专利名称：富硒灵芝中硒蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的制备方法。
背景技术：
硒具有许多生物学功能，人体的低硒状态及硒的营养状况与关节炎、癌症、心血管 病、白内障、胆汁郁积、克罗恩氏病、婴儿猝死综合症、囊肿性纤维化、糖尿病、甲状腺肿、免 疫缺陷、大骨节病、克山病、淋巴细胞性贫血、肌肉萎缩症、中风和溃疡性结肠炎等40余种 疾病的发病率密切相关。而灵芝自古被誉为延年益寿之佳品，具有多种生物学功能(黄伟 光等，1993)，然而正常灵芝菌中有机硒含量较低，如果在富含无机硒的培养基中接入灵芝 菌种，利用灵芝菌的富硒能力将无机硒转化为有机硒，并使其富集较高含量的有机硒(控 制在人体安全吸收范围内)，这种灵芝即为富硒灵芝，富硒灵芝融灵芝和有机硒之长，其药 用价值更高。因此开发富硒灵芝将具有广阔的应用前景和极高的社会、经济效益，其中富硒 灵芝中硒蛋白作为有效成分，被作为主要的研究对象，现有富硒灵芝中硒蛋白的制备方法 多是以富硒灵芝为原料，用碱提的方法得到碱溶性蛋白，然后对碱溶性蛋白进行纯化来制 备硒蛋白，但是该方法所得到的硒蛋白中硒含量仅为3mg/g左右，且采用SDS-PAGE检验硒 蛋白的纯度，所得到的电泳图不是单一条带，纯度较低，极大的限制了硒蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法得到的硒蛋白纯度低的问题，而提供了富硒灵 芝中硒蛋白的制备方法。本发明富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行一、l(Tl5g的富硒灵芝 子实体浸泡于去离子水中，在(Tl0°c的条件下搅拌7 10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离 子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入 醋酸至PH为4. (T4. 5，而后加入占混合液质量百分比为20% 30%的硫酸铵，在3飞。C的条件 下静置10 14小时，而后在450(T5500r/min的条件下离心15 25min去沉淀，然后向离心上 清液中加入占离心上清液质量百分比为70% 90%的硫酸铵，在3飞。C的条件下静置1(T14小 时，而后在450(T5500r/min的条件下离心15 25min，将离心后的沉淀加入10(T200mL浓度 为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，再经过孔径为0. 22 y m的微孔滤膜过滤 后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4飞次得到蛋白质溶液，蛋 白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、广10mg的富硒灵 芝子实体水溶性粗蛋白和lmL的浓度为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，然 后在1100(Tl300(k的条件下离心2(T30min，离心后的上清液经孔径为0. 22 y m的膜过滤 得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为lmL/min、检测波 长为280nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液， 收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I ；四、将2mL富硒灵 芝子实体水溶性粗蛋白I加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为lmL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体 水溶性粗蛋白II ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II加入到疏水层析柱中，在流速 为0. 5^1. 5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白 洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。本发明以富硒灵芝子实体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并进一步通过硫酸铵 沉淀蛋白、葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析、疏水层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备 得到硒含量为6mg/g左右的硒蛋白，与现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本发明方法制 备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤法检验本发明制备得到的硒蛋白的纯度， 洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本发明制备得到的硒蛋白纯度好。
图1为具体实施方式
十一得到的硒蛋白凝胶过滤层析图，图2中为具体实施方式
十一得到的硒蛋白对羟自由基(H0* )和超氧自由基(02-* )的清除活性的回归方程曲线 图，图中■表示羟自由基的回归方程曲线表亍超氧自由基的回归方程曲。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行 一、l(Tl5g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在(T10°C的条件下搅拌7 10小时，然后 抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混 合液，再向混合液中加入醋酸至PH为4. (T4. 5，而后加入占混合液质量百分比为209^30% 的硫酸铵，在3 5°C的条件下静置10 14小时，而后在450(T5500r/min的条件下离心 15 25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70% 90%的硫酸 铵，在3 5°C的条件下静置10 14小时，而后在450(T5500r/min的条件下离心15 25min，将 离心后的沉淀加入10(T200mL浓度为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，再经 过孔径为0. 22 y m的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复 超滤过滤4飞次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体 水溶性粗蛋白；二、广10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和lmL的浓度为0. 05mol/L、pH 为8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，然后在11000 13000穿的条件下离心2(T30min，离心后的 上清液经孔径为0. 22 pm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝 胶柱中，在流速为lmL/min、检测波长为280nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/ L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体 水溶性粗蛋白I ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I加入到阴离子交换层析柱中， 然后在流速为lmL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的 蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗 蛋白II加入到疏水层析柱中，在流速为0. 5^1. 5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线 性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。本实施方式步骤一中富硒灵芝子实体由菌种培育得到，具体步骤如下在栽培料中，添加亚硒酸钠，通过灵芝菌在生长过程中对无机硒的吸收，富集，然后转化为含有机态 硒的生物富硒灵芝子实体。采集的富硒灵芝子实体，测定其含硒量为72. 44y g/g，用自来水 洗净，双重蒸馏水冲淋，切片，冷冻干燥粉碎制成实验样品，冷冻保藏备用。本实施方式步骤一中搅拌采用电动搅拌机进行。本实施方式步骤三中葡聚糖凝胶柱在使用前用浓度为50mmol/L、pH为8. 0的 Tris - HC1缓冲液平衡后再使用，其中葡聚糖凝胶柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝胶。本实施方式步骤四中阴离子交换层析柱在使用前用浓度为50mmol/L、pH为8. 0的 Tris-HCl缓冲液平衡后再使用，其中阴离子交换层析柱采用的是Mono-Q强阴离子交换树 脂。本实施方式步骤五中疏水层析柱在使用前用浓度为50mmol/L的硫酸铵-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸铵-Tris - HC1溶液中溶质是浓度为0. 5mol/L硫酸铵，溶剂 是浓度为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，疏水层析柱采用的是PhenylSuperose 树脂。本实施方式步骤三、步骤四、步骤五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液方法均 为用洗脱液洗脱时，每个试管3飞mL的洗脱液(含有蛋白的洗脱液)，测定每个蛋白峰在相 同浓度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脱液，即得到了具有抗氧化活性的 硒蛋白。本实施方式步骤五中收集抗氧化活性的蛋白洗脱液可经过进一步浓缩或者干燥 得到硒蛋白固形物。对本实施方式制备得到的硒蛋白的结合离子进行测定，具体内容为用电感偶 合等离子体发射光谱法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)测定了该硒蛋白中的硒(Se)、铬 (Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、钴(Co)、镍(Ni)、钡(Ba)、 锶(Sr)、钼(Mo)、锗(Ge)、砷(As)等16种元素的含量；检测结果为在所测定的16种金属元 素中，该硒蛋白只与硒元素(Se )结合，结合量为6mg/g左右。对本实施方式制备得到的硒蛋白进行羟自由基(H0 )和超氧自由基(02_ ) 的清除活性测定，具体内容如下采用顺磁共振自旋捕集技术(EPR)检测本实施方式 制备得到的硒蛋白的羟自由基和超氧自由基的清除活性，研究结果显示，该硒蛋白具 有很强的H0*和02-*清除活性，清除率与硒蛋白之间存在剂量依赖关系。而且对 02_ 和的清除率与其浓度之间存在一定的对数回归关系。对于H0 而言，该回 归方程为Y=-0. 0001X2+0. 2187X - 1. 0420，R2=0. 9970 ；对于02- 而言，该回归方程为 Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981。即，清除反应体系产生的 50% 的 H0 和 02_ 需 要的该硒蛋白的浓度分别为264. 15 u g/mL和218. 03 u g/mL。本实施方式以富硒灵芝子实体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并进一步通过硫 酸铵沉淀蛋白、葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析、疏水层析对水溶性粗进行纯化，即制备 得到硒含量为6mg/g左右的硒蛋白，现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本实施方式制备 得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤层析检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯 度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本实施方式制备得到的硒蛋白纯度好。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中12 14g的富 硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在2 8°C的条件下搅拌8、小时。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中13g的富硒 灵芝子实体浸泡于去离子水中，在5°C的条件下搅拌8. 5小时。其它步骤及参数与具体实施 方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中占 混合液质量百分比为25%的硫酸铵，在4°C的条件下静置12小时。其它步骤及参数与具体 实施方式一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一中向 离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为80%的硫酸铵，在4°C的条件下静置12小时。 其它步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中重 复超滤过滤5次。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤一中冷 冻干燥条件为绝对气压为20Pa，冷阱温度为_55°C，样品厚度为l(T24mm。其它步骤及参 数与具体实施方式
一六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤二中在 12000g的条件下离心25min。其它步骤及参数与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤四中线 性梯度洗脱时间为40min，洗脱液A是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，洗 脱液B是浓度为Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，线性梯度洗脱设定的程序为09Tl00%B，其中 洗脱液B中NaCl为溶质，浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液为溶液。其它步 骤及参数与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤五中线 性梯度洗脱时间为40min，洗脱液C是浓度为0. 5mol/L的硫酸铵Tris - HC1溶液，洗脱液D 是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，线性梯度设定的程序为1009T0%D，其 中洗脱液C中硫酸铵为溶质，Tris - HC1缓冲液为溶液。其它步骤及参数与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进 行一、10. 36g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在5°C的条件下搅拌8小时，然后抽 滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合 液，再向混合液中加入醋酸至PH为4. 3，而后加入占混合液质量百分比为25%的硫酸铵，在 3 5°C的条件下静置13小时，而后在5000r/min的条件下离心20min去沉淀，然后向离心 上清液中加入占离心上清液质量百分比为80%的硫酸铵，在4°C的条件下静置12小时，而 后在5000r/min的条件下离心20min，将离心后的沉淀加入150mL浓度为0. 05mol/L、pH为 8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，再经过孔径为0. 22 y m的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子 量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤5次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷 冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、8mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和 lmL的浓度为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液混合，然后在1200Q§"的条件下离 心25min，离心后的上清液经孔径为0. 22 y m的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为lmL/min、检测波长为280nm的条件下进行洗脱，洗 脱液是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱 液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I加 入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为lmL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯 度洗脱，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II ’五、 将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II加入到疏水层析柱中，在流速为lml/min、检测波长 为280nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵 芝中的硒蛋白。本实施方式步骤一中搅拌采用电动搅拌机进行。本实施方式步骤三中葡聚糖凝胶柱在使用前用浓度为50mmol/L、pH为8. 0的 Tris - HC1缓冲液平衡后再使用，其中葡聚糖凝胶柱采用的是S印hadexG-75葡聚糖凝胶。本实施方式步骤四中阴离子交换层析柱在使用前用浓度为50mmol/L、pH为8. 0的 Tris-HCl缓冲液平衡后再使用，其中阴离子交换层析柱采用的是Mono-Q强阴离子交换树 脂。本实施方式步骤五中疏水层析柱在使用前用浓度为50mmol/L的硫酸铵-Tris -HC1溶液平衡后使用，其中硫酸铵-Tris - HC1溶液中溶质是浓度为0. 5mol/L硫酸铵，溶剂 是浓度为0. 05mol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，疏水层析柱采用的是PhenylSuperose 树脂。本实施方式步骤三、步骤四、步骤五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液方法均 为用洗脱液洗脱时，每个试管5mL的洗脱液(含有蛋白的洗脱液)，测定每个蛋白峰在相同 浓度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脱液，即得到了含有抗氧化活性的洗 脱液。本实施方式步骤四中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液A是浓度为50mmol/L、 pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，洗脱液B是浓度为Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，线性梯度 洗脱设定的程序为09Tl00%B，其中洗脱液B中NaCl为溶质，浓度为50mmol/L、pH为8. 0的 Tris-HCl缓冲液为溶液。本实施方式步骤五中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液C是浓度为0. 5mol/L的 硫酸铵Tris - HC1溶液，洗脱液D是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，线性 梯度设定的程序为1009T0%D，其中洗脱液C中硫酸铵为溶质，Tris - HC1缓冲液为溶液。采用凝胶过滤层析检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，检测结果如图1所 示，图1中为单一蛋白峰，由此可知，本实施方式制备得到的硒蛋白纯度好。对本实施方式制备得到的硒蛋白进行结合离子测定和抗氧化活性测定，具体内容 如下
1、结合离子测定用电感偶合等离子体发射光谱法(ICP-AES)(莫定琪等，1999年)测 定了该硒蛋白中的硒(Se)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)、钾(K)、钙(Ca)、镁 (Mg)、钴(Co)、镍(Ni)、钡(Ba)、锶(Sr)、钼(Mo)、锗(Ge)、砷(As)等16种元素的含量；检测 结果为在所测定的16种金属元素中，该硒蛋白只与硒元素(Se)结合，结合量为5. 98mg/g。2、羟自由基(H0 )和超氧自由基(02- )的清除活性
具体操作为用Fenton体系产生H0 ，分别取5 u L0. 5mol/LDMP0,5 u L试样或PBS (磷酸缓冲液)、5 y L4mmol/LDETAPAC(二乙三胺五乙酸)、5 y L0. lmmol/LFeS04混合均勻后，加 A 5 u L0. 0125%H202，120s后即刻采用EPR测量，中心磁场强度336. 5mT,响应时间0. ls，调 制幅度0. 2mT,扫场宽度10. OmT,扫描时间2min，微波功率10. Omff,调制频率9. 44GHz，试样 对HO 的清除率如公式(2-3)所示 其中&-体系中加入试样前EPR图谱中第二个峰的峰高；
hx-体系中加入试样后EPR图谱中第二个峰的峰高。超氧阴离子(02_ )的产生和清除用次黄嘌呤(HPX)-黄嘌呤氧化酶(X0D)体 系产生(V (Finkelsteinete7.，1980；Gradyete7.，1989)，分别取 5ii LI. Omol/LDMPO、 5 u L6mmol/LHPX,5 u L4mmol/LDETAPAC 禾口 5 ii L i式样或 PBS 混合均勾后，力口入 5 ii L50mU/ mLXOD, 80s后即刻采用EPR测量，中心磁场强度336. 3mT,响应时间0. ls，调制幅度 0. 079mT,扫场宽度5. OmT,扫描时间2min,微波功率10. Omff,调制频率9. 44GHz，试样对 02_ 的清除率计算方法同上对H0 的清除率，不同的是和hx分别为体系加入试样前后 EPR图谱中第一个峰的峰高。检测结果显示，该硒蛋白具有很强的H0 和02_ 清除活性，清除率与硒蛋白之间 存在剂量依赖关系。而且对02_的清除率与其浓度之间存在一定的对数回归关 系。对于H0 而言，该回归方程为Y=-0. 0001X2+0. 2187X- 1. 0420，R2=0. 9970，如图2所示； 对于02- 而言，该回归方程为Y=-0. 0001X2+0. 2417X+0. 7317，R2=0. 9981，如图2所示。即 清除反应体系产生的50%的H0 和02_ 需要的该硒蛋白的浓度分别为264. 15 u g/mL和 218. 03y g/mL。
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权利要求
富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行一、10~15g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在0~10℃的条件下搅拌7~10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.0~4.5，而后加入占混合液质量百分比为20%~30%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70%~90%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min，将离心后的沉淀加入100~200 mL浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4~6次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，然后在11000~13000g的条件下离心20~30min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1 mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水层析柱中，在流速为0.5~1.5mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。
2.根据权利要求1所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中12 14g 的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在2 8°C的条件下搅拌8、小时。
3.根据权利要求1或2所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中占 混合液质量百分比为25%的硫酸铵，在4°C的条件下静置12小时。
4.根据权利要求3所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中向离心 上清液中加入占离心上清液质量百分比为80%的硫酸铵，在4°C的条件下静置12小时。
5.根据权利要求1、2或4所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中 重复超滤过滤5次。
6.根据权利要求5所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中冷冻干 燥条件为绝对气压为20Pa，冷阱温度为_55°C，样品厚度为l(T24mm。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤二 中在12000g的条件下离心25min。
8.根据权利要求7所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤四中线性梯 度洗脱时间为40min，洗脱液A是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，洗脱液 B是浓度为Imol/LNaCl-Tris - HC1溶液，线性梯度洗脱设定的程序为09Tl00%B，其中洗脱 液B中NaCl为溶质，浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液为溶液。
9.根据权利要求1、2、4、6或8所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步 骤五中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液C是浓度为0. 5mol/L的硫酸铵Tris - HC1溶 液，洗脱液D是浓度为50mmol/L、pH为8. 0的Tris - HC1缓冲液，线性梯度设定的程序为1009T0%D，其中洗脱液C中硫酸铵为溶质，Tris - HC1缓冲液为溶液。
全文摘要
富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，它涉及一种蛋白质的制备方法。本发明解决了现有方法得到的硒蛋白纯度低的问题。方法一、超滤、硫酸铵沉淀制备富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和Tris–HCl缓冲液混合，过滤；三、用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；四、用阴离子交换层析柱进行分离纯化；五、用疏水层析柱进行分离纯化即得到富硒灵芝中的硒蛋白。本发明制备得到硒蛋白中硒含量为6mg/g左右，与现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本发明方法制备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤法检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本发明制备得到的硒蛋白纯度好。
文档编号C07K1/20GK101851269SQ20101017911
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者杜明, 胡小松, 赵广华 申请人:哈尔滨工业大学