一种具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP1、其编码蛋白及应用的制作方法

专利名称：一种具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP1、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉具有抗镉和抗铜功能的基因DvCRPl、其编码蛋白质及应用。
背景技术：
随着现代工业的发展，重金属污染日趋严重。重金属污染引发的环境和健康问题 在许多国家都有报道。镉(Cd2+)是生物毒性最强的重金属之一，而且Cd2+在环境中的化学 活性强、移动性大、毒性持久。自上世纪20年代起，由于采矿、冶炼、电镀、化工等行业的快 速发展及其废水的排放，导致水体和土壤Cd2+污染日益严重。水体和土壤中污染的Cd2+易 被水体生物和高等植物吸收和积累，影响它们的生长及代谢，造成农产品产量和品质下降 及生态环境的破坏。更严重的是水体和土壤中的Cd2+容易通过食物链的富集作用进入人 体，对人类健康造成严重的危害。环境Cd2+污染的生物修复是一种新兴的绿色环境治理技术，具有很大的应用潜 力。该技术主要利用对Cd2+耐性强、吸收和富集量大的生物体(如高等植物和微生物)来 降低环境中Cd2+的含量，以达到修复的目的。从长远来看，生物修复技术的长足进步将依赖 于Cd2+耐受和积累关键基因的鉴定和克隆，并通过转基因技术培育一批高耐受、高积累Cd2+ 的生物新品种。研究发现很多绿藻对Cd2+具有很高的耐受性，如硅藻(Phaeodactylum tricornutum)可以耐受超过 400 μ M 的 Cd2+，而莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)也 可以耐受200 μ M以上的Cd2+ ；另外很多绿藻还具有很强的吸附和积累Cd2+的能力，因此绿 藻在治理水体Cd2+污染方面被公认为具有很好的应用前景。此外，绿藻特异耐Cd2+基因的 克隆可为Cd2+污染的生物修复技术提供优良基因资源。盐藻(Dimaliella)(又称杜氏盐藻)是一种生存于极端环境下的真核单细胞绿 藻，对盐胁迫具有极强的适应能力，研究表明盐藻对Cd2+也具有较强的耐受性(Tsuji et al.，2002，2003)。但对盐藻的研究缺乏转化系统，不能通过成熟的遗传学方法进行研究。利用酵母的功能互补系统克隆外源基因是一个非常有效的手段，因为酵母是真核 生物基因的优良表达系统，具有高效的转化方法，而且酵母有可供筛选的丰富突变体。由于 这一方法通过功能互补进行筛选，因而具有高效、直接、目的性强等优点，更重要的是通过 该方法可以筛选到与酵母突变基因不同源的新基因。植物很多抗Cd2+基因是通过这一方法 被克隆的，如拟南芥的AtPCSl和AtPcrl、小麦的TaPCSl、TaTM20和TaHsfA4a及遏蓝菜的 TcHMA4 等。因此，利用酵母功能互补系统从盐藻中分离抗镉基因是一个非常有效的手段，将 有可能从盐藻中筛选获得新的抗镉基因，从而为提高生物体抗镉能力、增加生物体内镉的 积累量的基因工程提供优良基因资源。

发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种从极端生物盐藻(Dimaliella viridis)中分 离出来的具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该基因在提高生物体抗镉和抗铜能力中的应用。本发明的目的之四在于提供该基因在增加生物体内镉和铜的积累量方面的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl，其特征在于该基因具有下列核苷酸 序列之一1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；2)与SEQ ID NO 1所限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同生物学 功能蛋白质的DNA序列。一种根据权利要求1所述DvCRPl基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨
基酸序列之一1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；2)通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO :2的蛋白具有相 同的生物学功能。一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求1所述的DvCRPl基因。一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。一种上述的DvCRPl基因在提高生物抗镉和抗铜能力基因工程方面的应用。一种上述的DvCRPl基因在提高生物镉和铜积累量基因工程方面的应用。一种上述的DvCRPl基因编码的蛋白在提高生物抗Cd2+和抗Cu2+功能方面的应用。一种上述的DvCRPl基因编码的蛋白在增加生物体内镉和铜的积累量方面的应用。一种克隆上述具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl的方法，其特征在于该方法 包括如下步骤a)将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体Δ yapl，在150 μ M Cd2+的筛 选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆；b)将步骤a)得到的候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大 肠杆菌进行扩增；把扩增以后的载体回转酵母突变体Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的胁迫处 理下仍能够正常生长的阳性克隆；c)利用限制性内切酶EcoRI/XhoI消化步骤b)得到的阳性克隆释放出插入片段， 构建到测序载体中，通过测序获得DvCRPl基因的部分cDNA序列；d)在步骤c)得到的部分cDNA序列上设计两条5’ RACE弓丨物，引物序列分别为5， -gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，5， -gtggcacagcctgtctcccgagctacag-3，，使用SMART RACE cDNA amplification kit 试剂盒进行 5，cDNA 扩增反应，回收 最长的扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得盐藻DvCRPl基因的全长编码序列。本发明还涉及所述的DvCRPl基因在提高生物体抗镉和抗铜能力、增加生物体内
4镉和铜的积累量基因工程方面的应用；以及所述的DvCRPl基因编码的蛋白质在提高生物 体抗镉和抗铜能力、增加生物体内镉和铜的积累量基因工程方面的应用。


图1显示了表达盐藻DvCRPl基因的酵母转化子的抗Cd2+表型。图2显示了表达盐藻DvCRPl基因的酵母转化子的抗Cu2+表型。图3显示了表达盐藻DvCRPl基因的酵母转化子中的高Cd2+积累量。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 编，Cold Spring Harbor Laboratory，1998出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。实施例一 =DvCRPl全长编码区的克隆与分析将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体Δ yapl，在含150 μ M Cd2+的筛 选压力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆。为了排除由于酵母基因组上自 发突变造成的假阳性，将候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆 菌进行扩增，将扩增以后的载体回转酵母突变体Ayapl，在150μΜ Cd2+处理下仍能够稳定 生长得克隆即为真正的阳性克隆。对阳性克隆所携带的表达载体中的插入片段进行测序， 获得DvCRPl的部分cDNA序列。 为了得到全长编码区的cDNA序列，本发明在已知的cDNA序列上设计了两条 5，RACE 弓丨物5，-gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，和 5，-gtggcacagcctgtctcccgagcta cag-3，。使用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNA amplification kit 试剂盒进行 5，cDNA 扩增反应，回收最长的扩增产物连接到测序载体上进行测序，最终在原有cDNA的基础上向 5，端补全了 cDNA序列，得到了盐藻DvCRPl基因的全长cDNA序列，长度为1799bp。实施例二 DvCRPl的序列分析先后采用Blastx、tBlastx和Blastn程序将DvCRPl基因的全长cDNA序列在 NCBI相应数据库进行同源性搜索(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov)，都没有获得有效的 Blast搜索结果，表明盐藻DvCRPl基因及其同源基因目前还没有被克隆和研究，是首次被 发现的具有抗Cd2+功能的新基因。通 过 NCBI ORF Finder(http://www, ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/Rorf. html)对 DvCRPl基因的全长cDNA序列进行ORF预测，结果显示DvCRPl正义链含有一个长1497bp的 0RF(88_1584bp。然后，通过PCR将这个预测的ORF亚克隆到pAJ401中并转化Δ yapl突变 体，转化子的抗Cd2+表型鉴定显示这个ORF具有和全长cDNA同等强度的抗Cd2+功能(见实 施例三)，表明所预测的DvCRP 1基因的ORF是正确的。另外，在DvCRP 1的cDNA序列中，其 ORF的5’端起始密码子上游存在同框的终止密码子，这表明DvCRPl基因的ORF是完整的。因此，DvCRPl编码一个498个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO 2，图1)。实施例三DvCRPl在酵母中的功能分析(一 )酵母表达载体的构建通过PCR方法，以DvCRPl的cDNA克隆为模板，扩增获得DvCRPl的全长ORF片段。 为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上EcoRI酶切位点，在其3’端加 上XhoI酶切位点，引物序列如下DvCRPl+ 5' _attgaattcatgaacggagacgagtgtagg_3，DvCRPl- :5，_attctcgagtcagcatctgcacagatcac_3，将PCR扩增得到产物利用酶位点EcoRI和XhoI定向克隆至载体pAJ401中，转化 大肠杆菌ToplO。通过酶切和测序鉴定获得阳性克隆pAJ401-DvCRPl。(二)转化酵母使用LiAc热激转化法将空载体PAJ401和DvCRPl的表达载体pAJ401_DvCRPl分 别转化到酵母镉敏感突变体Ayapl和酵母铜敏感突变Acupl中，同时将空载体pAJ401转 化到相应的野生型酵母Y252和DTY3中。(三)酵母转化子的表型鉴定将转化pAJ401或pAJ401_DvCRPl的突变体Δ yapl转化子细胞和转化pAJ401的 野生型Y252转化子细胞培养至对数期，5倍梯度稀释(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀释菌液分别滴到含O、150、200、250及300 μ M CdCl2的YNB平板上，30°C培养6天。结 果如图1所示，表达DvCRPl的突变体Ayapl转化子细胞的抗镉能力得到了非常显著的提 高，并大大超出了野生型酵母的抗镉能力。将转化pAJ401或pAJ401-DvCRPl的突变体Δ cupl转化子细胞和转化pAJ401的 野生型DTY3转化子细胞培养至对数期，5倍梯度稀释(起始0D600 = 0. 5)后，取5 μ 1各梯 度稀释菌液分别滴到含0、25、50、75及ΙΟΟμΜ CuSO4的YNB平板上，30°C培养6天。结果 如图2所示，表达DvCRPl的突变体Acupl转化子细胞的抗铜能力得到了显著的提高。(四)酵母转化子中的镉含量测定将转化pAJ401或pAJ401-DvCRPl的突变体Δ yapl转化子细胞和转化pAJ401的野 生型Y252转化子细胞培养至对数前期，加入终浓度为20 μ M的CdCl2,继续培养12小时后， 收集不同酵母转化子细胞，80°C烘干48小时，用电感耦合等离子质谱系统(ELAN DRC-e, Perkin-Elmer)测定样品中的Cd2+含量。结果如图3所示，表达DvCRPl的突变体Ayapl转 化子细胞的镉含量得到了非常显著的提高，并大大超出了野生型酵母细胞中的镉含量。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利 要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
一种具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP1，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一1)具有SEQ ID NO1所示的碱基序列；2)与SEQ ID NO1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
2.一种根据权利要求1所述DvCRPl基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基 酸序列之一1)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；2)通过将SEQID NO :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO :2的蛋白具有相同的 生物学功能。
3.—种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求1所述的DvCRPl基因。
4.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种根据权利要求1所述的DvCRPl基因在提高生物抗镉和抗铜能力基因工程方面 的应用。
6.一种根据权利要求1所述的DvCRPl基因在提高生物镉和铜积累量基因工程方面的应用。
7.一种根据权利要求2所述的DvCRPl基因编码的蛋白在提高生物抗Cd2+和抗Cu2+功 能方面的应用。
8.一种根据权利要求2所述的DvCRPl基因编码的蛋白在增加生物体内镉和铜的积累量方面的应用。
9.一种克隆权利要求1所述具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRPl的方法，其特征 在于该方法包括如下步骤a)将酵母表达文库通过LiAc热击法转化酵母突变体Ayapl，在150μΜCd2+的筛选压 力下筛选突变表型回复的酵母转化子，得到候选克隆；b)将步骤a)得到的候选克隆所携带的表达载体从酵母细胞中分离出来，转化大肠杆 菌进行扩增；把扩增以后的载体回转酵母突变体Ayapl，得到在150μΜ Cd2+的胁迫处理下 仍能够正常生长的阳性克隆；c)利用限制性内切酶EcoRI/XhoI消化步骤b)得到的阳性克隆释放出插入片段，构建 到测序载体中，通过测序获得DvCRPl基因的部分cDNA序列；d)在步骤c)得到的部分cDNA序列上设计两条5’RACE引物，引物序列分别为 5，-gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3，5' -gtggcacagcctgtctcccgagctacag-3',使用SMART RACE cDNA amplification kit试剂盒进行5，cDNA扩增反应，回收最长 的扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得盐藻DvCRPl基因的全长编码序列。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗镉Cd2+和抗铜Cu2+基因DvCRP1、其编码蛋白质和应用。本发明采用了酵母功能互补系统筛选得到了DvCRP1基因，运用RACE技术得到了全长cDNA序列，并且证明了该基因能够显著提高模式生物酵母的抗镉和抗铜能力、并能显著增加酵母细胞内镉的积累量。所公开的全长基因及氨基酸序列为首次发现的盐藻特有的抗镉和抗铜基因，其在提高生物体的抗镉和抗铜能力、增加生物体内镉和铜的积累量基因工程方面具有应用价值。
文档编号C07K14/405GK101921778SQ20101020143
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者孟祥宗, 宋任涛, 许政暟 申请人:上海大学