具有特殊生物活性的花色苷提取和测定方法

专利名称：具有特殊生物活性的花色苷提取和测定方法
技术领域：
本发明涉及一种提取蓝靛果中花色苷及其测定的方法，具体涉及一种具有特殊生 物活性的花色苷提取测定方法。
背景技术：
自由基对人体的损伤是造成人衰老的重要原因之一，其损害作用主要体现在对生 命大分子的损害。羟基自由基是高反应性自由基，反应距离短，速度快，攻击力强，几乎能与细胞中 任何分子发生反应。它可介导脂质氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化反 应，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老，是已知的最活泼的活性氧自由 基。它几乎和所有的细胞成分发生反应，对机体危害极大，与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞 噬有关。

发明内容
本发明的目的是提供一种能够以蓝靛果为原料，采用溶剂提取法，得到提取液，旋 转蒸发，经大孔树脂纯化，减压浓缩，真空干燥，得到成品。上述的目的通过以下的技术方案实现具有特殊生物活性的花色苷提取方法，先将蓝靛果鲜果除杂并洗净晾干水分，送 入冷室进行冷冻并研磨进行粉碎，再按蓝靛果的重量份数酸化乙醇的重量份数=1 15 的比例加入酸化乙醇，所述的酸化乙醇PH值为2，在提取温度为50 60°C下提取90分钟 然后过滤最后收集滤液，再过滤提取2 3次；得到提取液，将提取液合并减压蒸发除去溶 剂，用大孔树脂AB-8纯化，旋转蒸发，真空冻干。所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法，每个提取条件的确定，均以羟自由 基清除率和1，1_ 二苯基-2-三硝基苯DPPH清除率为指标，通过选择对羟自由基OH和1， 1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH两者的清除率都较高的因素为最佳，以获得较好的抗氧化活 性。所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法(1).所述的蓝靛果花色苷的提取工艺流程为蓝靛果一除杂一洗净、浙干一冻藏一 冻样研磨一加浸提液提取一抽滤一滤液一减压蒸发浓缩一大孔树脂一旋转蒸发一真空冻 干一产品；(2).蓝靛果花色苷的提取准确称取IOg蓝靛果冻果，用高速万能粉碎机粉碎后置于锥形瓶中，加入提取液 并密封，放入恒温水浴锅中；选取料液比、提取剂浓度、温度和时间为影响因素进行L9(34) 正交试验确定最佳提取工艺，以花色苷提取量和抗氧化能力为考核指标，70%乙醇作为提 取溶剂，料液比为Ig 15ml、提取温度为50°C、提取时间为90min、PH值为2、提取3次。一种所述的具有特殊生物活性的花色苷含量的测定方法
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滤液用柠檬酸磷酸氢二钠Na2HPO4缓冲液定容后，以缓冲液作空白对照，进行光谱 扫描，确定最大吸收峰后，在此波长下进行提取液吸光度测定，通过色价法计算；(1).羟自由基清除率的测定在试管中分别加入ImL 10mmol/L水杨酸-乙醇溶液、样液、ImL 10mmol/L硫酸亚 铁FeSO4溶液、最后加入2mL 10mmol/L过氧化氢H2O2启动锌基(Fenton)，摇勻后于510nm处 测定吸光度Ax ；用蒸馏水代替样液，测得的吸光度值为Atl ；取2mL蒸馏水代替过氧化氢H2O2， 测得的吸光度为Axtl ；实验进行三次平行试验；羟自由基清除率I )表示为I(% ) = [A0- (Ax-Axo) ]/A0X100% ； (2). 1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH自由基清除率的测定准确移取样液与3mL 60 μ mol/L的1，1_二苯基_2_三硝基苯DPPH( 二苯基苦基苯 胼；l，l-diphenyl-2-picrylhydraZyl)溶液(用无水乙醇准确配制)均勻混合，反应30min 后在517nm处测定其吸光度Ai,同时用相同的方法测定等体积无水乙醇与3mL 60 μ mol/L 的1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH溶液混合后的吸光度Atl，以及样品溶液与3mL无水乙醇 混合液的吸光度Aj,实验进行三次平行试验，通过下列公式计算1，1- 二苯基-2-三硝基苯 DPPH清除率R)R(% ) = [A0-(Ai-Aj) ]/A0X 100%。本发明的有益效果1.本发明生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关，适当补充 外源抗氧化剂能促使机体内源性抗氧化物质恢复一定的水平，可以改善衰老，防治疾病 ’天 然抗氧化剂的研究和应用越来越广泛。2.本发明的蓝靛果具有较高的营养价值及药用功能，是天然抗氧化剂的良好资 源；野生蓝靛果忍冬果实酸含有大量的维生素C和氨基酸以及多种微量元素及大量黄酮类 成分，提取物还富含次级代谢所需的花色苷和酚酸。3.本发明的蓝靛果花色苷对过氧自由基、超氧自由基、过氧化氢、羟自由基、单线 态氧有很高的氧自由基吸收能力。蓝靛果因其潜在的营养价值、药用价值和商用价值，是一 种世界珍稀的、纯天然的、绿色的、野生的可食用浆果，具有极为广阔的国内外市场，进一步 开发蓝靛果保健品，其附加值更高，因而具有广阔的开发利用前景。4.本发明的花色苷具有较多生理活性功能，包括抗氧化及消除自由基、抗炎、降低 血清及肝脏中的脂肪含量、抗变异及抗肿瘤，降血脂、降血压、防止体内过氧化作用等；研究 表明，花色苷可影响肿瘤发生、发展的各个阶段，可望成为一种无毒副作用的新型抗肿瘤药 物，也可望成为一种新型的保健食品。5.本发明以过氧化氢H2O2作氧化剂，Fe2+可与过氧化氢H2O2作用发生锌基反应 Fenton反应产生羟基自由基，蓝靛果提取物与其发生反应，其吸光度AA发生变化，从而可 间接测定羟基自由基的产生量和花色苷对羟基自由基的消除作用；该法设备简单，试剂便 宜，操作简单，易于广泛使用。6.本发明的蓝靛果花色苷类组分对自由基有消除作用，具有良好的抗氧化性。对 提取条件对蓝靛果花色苷抗氧化活性的研究，可为开发蓝靛果花色苷在食品、保健、化妆品 等方面的应用提供理论基础。7.本发明以蓝靛果提取物对羟自由基(OH)和1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH两
4者的清除率为指标，通过研究提取条件对蓝靛果提取物花色苷含量和抗氧化活性的影响， 得到了最佳的提取条件。在该提取条件下，得到的蓝靛果提取物有较高的综合抗氧化活性， 可能在体内发挥多种抗氧化活性途径，旨在为天然抗氧化剂的开发和应用提供理论基础。本发明提取方法得到的产品，对结肠癌和肝癌细胞的增殖具有抑制作用。在进行 基于MTT的细胞毒性试验时，对结肠癌和肝癌细胞增殖的抑制率可达70%左右。接下来进 行细胞凋亡试验，通过观察到的DNA ladder，可以发现。正常的DNA由于无降解，电泳条带 表现为一大分子片断，经过蓝靛果花色苷处理过的细胞的DNA是随机断裂的，电泳下为从 大到小连续分布的弥散条带。可以说明蓝靛果花色苷可以诱导癌细胞发生细胞凋亡现象。
具体实施例方式实施例1 具有特殊生物活性的花色苷提取方法，先将蓝靛果鲜果除杂并洗净晾干水分，送 入冷室进行冷冻并研磨进行粉碎，再按蓝靛果的重量份数酸化乙醇的重量份数=1 15 的比例加入酸化乙醇，所述的酸化乙醇pH值为2，在提取温度为50 60°C下提取90分钟然 后过滤最后收集滤液，再提取2 3次；(此处是将滤渣重复提取2 3次)得到提取液，将 提取液合并后减压蒸发除去溶剂，用大孔树脂AB-8纯化，旋转蒸发，真空冻干，得到产品。所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法，每个提取条件的确定，均以羟自由 基清除率和1，1-二苯基-2-三硝基苯DPPH清除率为指标，通过选择对羟自由基OH和1， 1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH 两者的清除率都较高的因素为最佳，以此来说明具有较好的 抗氧化活性。实施例2 实施例1所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法(1)蓝靛果花色苷的提取工艺流程蓝靛果一除杂一冲洗、浙干一冻藏一冻样研磨一加浸提液提取一抽滤一滤液(2)蓝靛果花色甘的提取准确称取IOg蓝靛果冻果，用高速万能粉碎机粉碎后置于锥形瓶中，加入一定体 积的提取液并密封，放入恒温水浴锅中。以花色苷提取量和抗氧化能力为考核指标，分别研 究了不同提取溶剂、提取剂浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取PH值、提取次数等因素 对蓝靛果花色苷提取量及其抗氧化活性的影响，在此基础上选取料液比、提取剂浓度、温度 和时间为影响因素进行L9(34)正交试验确定了最佳提取工艺。实施例3 上述实施例取得的花色苷含量的测定方法滤液用柠檬酸/磷酸氢二钠Na2HPO4缓冲液定容后，以缓冲液作空白对照，进行光 谱扫描，确定最大吸收峰后，在此波长下进行提取液吸光度测定，通过色价法计算，用吸光 度表示花色苷的提取量，根据吸光度大小确定优化工艺条件。羟自由基清除率的测定在试管中分别加入ImL lOmmol/L水杨酸-乙醇溶液、样 液、ImL lOmmol/L硫酸亚铁FeS04溶液、最后加入2mL lOmmol/L过氧化氢H2O2启动锌基反 应Fenton反应，摇勻后于510nm处测定吸光度AX ；用蒸馏水代替样液，测得的吸光度值为 A0 ；取2mL蒸馏水代替过氧化氢H2O2，测得的吸光度为Awo实验进行三次平行试验。羟自由
5基清除率表示为I(% ) = [A0- (Ax-Axo) ]/A0 X 100%关于1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH自由基清除率的测定准确移取样液与3mL 60 μ mol/L的1，1_二苯基_2_三硝基苯DPPH( 二苯基苦基苯 胼；l，l-diphenyl-2-picrylhydraZyl)溶液(用无水乙醇准确配制)均勻混合，反应30min 后在517nm处测定其吸光度Ai,同时用相同的方法测定等体积无水乙醇与3mL 60 μ mol/L 的1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH溶液混合后的吸光度Atl，以及样品溶液与3mL无水乙醇 混合液的吸光度~。实验进行三次平行试验。通过下列公式计算1，1_ 二苯基-2-三硝基 苯DPPH清除率R)R(% ) = [A0-(Ai-Aj)]/A0X 100%根据上述的情况确定最佳工艺条件的正交试验在单因素试验的基础上，选取料液比、提取剂浓度、温度和时间为影响因素进行 L9 (34)正交试验，如表1所示，确定最佳工艺参数。以花色苷提取量、羟自由基(·0Η)清除 率和1，1-二苯基-2-三硝基苯DPPH清除率为指标进行评价，这三种指标均为“高优”指标， 花色苷提取量以吸光度表示，用多指标综合评价方法-Z分综合评价法(Z-score)进行指标 的无量纲化。实施例4 实施例1或2所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法(1).提取溶剂乙醇浓度的影响70%乙醇作为提取溶剂时，比乙醇浓度为40%、50%、60%、80%、90%时，花色苷 提取量增加了 5. 56% 17. 53%，羟自由基清除率提高了 12. 30% 18. 51 %，1，1-二苯 基-2-三硝基苯DPPH清除率提高了 4. 32% 21. 18%。(2).提取温度的影响提取温度为50°C时，比提取温度为30°C、40°C、6(rC、7(rC、8(rC时，花色苷提取量 增加了 1.08% 13. 43%，羟自由基清除率提高了 11. 98% 287. 73%，1，1-二苯基-2-三 硝基苯DPPH清除率提高了 0. 14% 8. 93%。(3)提取时间的影响提取时间为90min时，比提取时间为15min、30min、60min、120min时，花色苷提取
量增加了 2. 43% 7. 37%，羟自由基清除率提高了 2. 10% 55. 09%，1，1-二苯基-2-三 硝基苯DPPH清除率提高了 6. 39% 44. 86%。(4) .PH值的影响PH值为1时，比PH值为1.5、2、2. 5、3、3. 5时，花色苷提取量增加了 6. 85% 162. 46%，羟自由基清除率提高了 64. 81% 180. 19%，PH值为2时，比PH值为1. 5、2、2· 5、 3、3. 5时，1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH清除率提高了 3. 96% 22.57%。pH值对花色苷 的结构有影响，导致其对羟自由基(·0Η)和DPPH清除率规律变化不一致，原因可能是两种 反应机理不同，不同的花色苷形式的电子数不一致造成的。因此选择提取PH值为2。(5).料液比的影响所述的料液比为综合考虑了花色苷提取量，羟自由基清除率，1，1- 二苯基-2-三 硝基苯DPPH清除率，以及降低接下来的浓缩工作量等各因素，取蓝靛果果重lg，加入盐
6酸酸化乙醇15ml。料液比为Ig 15ml时，花色苷提取量较其他料液比提高了 1.69% 14. 20%。(6).提取次数的影响本试验累计提取5次，第3次提取后，提取液中蓝靛果残渣已经变白，花色苷几乎 完全被提取出来；提取次数越多，累计提取量越高，但是提高幅度不同，第三次提取之后花 色苷提取量增加率已经非常低了，因此提取3次即可。实施例5 实施例1或2所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法蓝靛果花色苷的提取，先将蓝靛果鲜果除杂，洗净，然后避光晾干，粉碎，按照蓝靛 果果重酸化乙醇=1 15加入酸化乙醇，酸化乙醇pH值为2，在提取温度为50 60°C 下提取90分钟，过滤，收集滤液，提取2 3次。每个提取条件的确定，均以羟自由基清除率和1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH清 除率为指标，通过选择对· OH和1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH ·两者的清除率都较高的 因素为最佳，以此来说明具有较好的抗氧化活性。按照上述提取方法得到提取液，合并提取液，减压蒸发除去溶剂，经大孔树脂AB-8 纯化，旋转蒸发，真空冻干，得到产品。
权利要求
一种具有特殊生物活性的花色苷提取方法，其特征是先将蓝靛果鲜果除杂并洗净晾干水分，送入冷室进行冷冻并研磨进行粉碎，再按蓝靛果的重量份数∶酸化乙醇的重量份数＝1∶15的比例加入酸化乙醇，所述的酸化乙醇pH值为2，在提取温度为50～60℃下提取90分钟然后过滤最后收集滤液，再过滤提取2～3次；得到提取液，将提取液合并减压蒸发除去溶剂，用大孔树脂AB 8纯化，旋转蒸发，真空冻干。
2.根据权利要求1所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法，其特征是每个提取 条件的确定，均以羟自由基清除率和1，1" 二苯基-2-三硝基苯DPPH清除率为指标，通过选 择对羟自由基0H和1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH两者的清除率都较高的因素为最佳，以 获得较好的抗氧化活性。
3.根据权利要求1或2所述的具有特殊生物活性的花色苷提取方法，其特征是(1).所述的蓝靛果花色苷的提取工艺流程为蓝靛果一除杂一洗净、浙干一冻藏一冻样 研磨一加浸提液提取一抽滤一滤液一减压蒸发浓缩一大孔树脂一旋转蒸发一真空冻干一女口广PR ；(2).蓝靛果花色苷的提取准确称取10g蓝靛果冻果，用高速万能粉碎机粉碎后置于锥形瓶中，加入提取液并密 封，放入恒温水浴锅中；选取料液比、提取剂浓度、温度和时间为影响因素进行L9 (34)正交 试验确定最佳提取工艺，以花色苷提取量和抗氧化能力为考核指标，70%乙醇作为提取溶 剂，料液比为lg 15ml、提取温度为50°C、提取时间为90min、PH值为2、提取3次。
4.一种权利要求1或2所述的具有特殊生物活性的花色苷含量的测定方法滤液用柠檬酸磷酸氢二钠Na2HP04缓冲液定容后，以缓冲液作空白对照，进行光谱扫 描，确定最大吸收峰后，在此波长下进行提取液吸光度测定，通过色价法计算；(1).羟自由基清除率的测定在试管中分别加入lmL lOmmol/L水杨酸-乙醇溶液、样液、lmL lOmmol/L硫酸亚铁 FeS04溶液、最后加入2mL 10mmol/L过氧化氢H202启动锌基(Fenton)，摇勻后于510nm处 测定吸光度Ax ；用蒸馏水代替样液，测得的吸光度值为& ；取2mL蒸馏水代替过氧化氢H202， 测得的吸光度为AX(I ；实验进行三次平行试验；羟自由基清除率I )表示为 I(% ) = [A0-(AX-AX0)]/A0X100% ；(2).1，1_ 二苯基-2-三硝基苯DPPH自由基清除率的测定准确移取样液与3mL 60 u mol/L的1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH (二苯基苦基苯胼； 1, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl)溶液(用无水乙醇准确配制)均勻混合，反应30min后 在517nm处测定其吸光度 ，同时用相同的方法测定等体积无水乙醇与3mL 60 u mol/L的 1,1-二苯基-2-三硝基苯DPPH溶液混合后的吸光度&，以及样品溶液与3mL无水乙醇混合 液的吸光度Ap实验进行三次平行试验，通过下列公式计算1，1- 二苯基-2-三硝基苯DPPH 清除率)R(% ) = HApVAoXlOO^。
全文摘要
具有特殊生物活性的花色苷提取和测定方法。羟基自由基是高反应性自由基，反应距离短，速度快，攻击力强，几乎能与细胞中任何分子发生反应。具有特殊生物活性的花色苷提取方法，先将蓝靛果鲜果除杂并洗净晾干水分，送入冷室进行冷冻并研磨进行粉碎，再按蓝靛果的重量份数∶酸化乙醇的重量份数＝1∶15的比例加入酸化乙醇，所述的酸化乙醇pH值为2，在提取温度为50～60℃下提取90分钟然后过滤收集滤液，再提取2～3次；合并提取液，将提取液减压蒸发除去溶剂，用大孔树脂AB-8纯化，旋转蒸发，真空冻干，得到产品。本发明用于提取蓝靛果中的花色苷。
文档编号C07H17/065GK101941998SQ201010225929
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者包怡红, 李文星 申请人:包怡红