专利名称：大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法
技术领域：
本发明涉及鱼类肌肉生长抑制素，具体涉及体外表达的大黄鱼MSTN-I前肽和前 肽抗体及制备方法。
背景技术：
肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)属转化生长因子-β (Transfoming growth factor-β ,TGF-β)超家族，是一个重要的肌细胞生长调控因子，主要功能是负调控肌细胞 的生长和分化。美国学者McPherron等在1997年首次克隆到该基因，并证实MSTN基因敲 除的小鼠，其骨骼肌重量明显增加，是正常野生型小鼠的2-3倍左右。MSTN基因编码序列 的自然突变造成了比利时兰牛(Belgian blue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese )的双肌臀 现象，进一步证明MSTN基因的功能。MSTN包含N端的前肽和C端的成熟肽，在动物体内前 肽可与成熟肽二聚体结合，从而抑制MSTN的功能，促进动物的生长。目前对鱼类MSTN基 因有研究报道，如授权公告号为CN100347298的发明专利公开了花鲈的MSTN基因(4873bp) 克隆及载体构建，通过设计引物，扩增该基因的一个3. 2KB长片段和一个1. 5KB短片段，依 次连接PBS+KS载体上，再在长片段与短片段之间连接正标记基因，在长片段侧翼连接负标 记基因。但对鱼类MSTN基因体外表达研究很少，尤其是大黄鱼存在两种类型的肌肉生长抑 制素，即大黄鱼I型肌肉生长抑制素(大黄鱼MSTN-1)和大黄鱼II型肌肉生长抑制素(大黄 鱼MSTN-2)，大黄鱼MSTN-I主要在肌肉组织中表达，而大黄鱼MSTN-2主要在脑组织中表达； 我们克隆的大黄鱼MSTN-I基因序列的登录号为AY842933，该基因包括三个外显子，从109 bp -1239 bp (含有一个终止子)编码具有376个氨基酸的大黄鱼MSTN-1，它包括一个信号 肽序列(1-22氨基酸残基)，一个TGF- β前肽结构域(41-256氨基酸残基)，一个RXXR蛋白 酶水解位点(264-267氨基酸残基)和一个TGF-β成熟肽结构域(282-376氨基酸残基)，其 中最保守的区域为TGF-β成熟肽结构域，含有9个保守的半胱氨酸位点；对大黄鱼MSTN-I 前肽的体外表达从未有研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供大黄鱼MSTN-I前肽，该前肽可以与大黄鱼 MSTN-I的成熟肽结合，抑制肌肉生长抑制素的活性，从而促进大黄鱼肌肉的生长。本发明还提供了前肽抗体，该前肽抗体可与上述前肽结合，阻断上述前肽与大黄 鱼MSTN-I成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌肉的生长。本发明又提供了上述前肽和前肽抗体的制备方法，该制备方法可以得到纯度较高 的大黄鱼MSTN-I前肽，通过免疫学方法，可获得大黄鱼MSTN-I前肽抗体。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为大黄鱼MSTN-I前肽，其特征在于 该大黄鱼MSTN-I前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。大黄鱼MSTN-I前肽抗体，其特征在于该前肽抗体为上述大黄鱼MSTN-I前肽免疫 应答反应的血液中分离得到的血清。
大黄鱼MSTN-I前肽的制备方法，包括下述步骤
1)引物设计依据登录号为AY842933的大黄鱼肌肉生长抑制素基因序列，大小为 1906bp，根椐编码大黄鱼MSTN-I前肽的核苷酸序列设计引物，正向引物的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO. 3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，其中正向引物 含BamH I酶切位点，反向引物含Hind III酶切位点；正反向引物由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成；
2)RNA提取取IOOmg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入Iml Trizol溶液研磨成 勻浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0. 2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm 离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0. 5ml异丙醇，冰上置lOmin，12000rpm离心 lOmin，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混勻后7500rpm离心5min， 弃上清液，室温下干燥5-lOmin，加入30 μ 1水溶解，得到RNA溶液，_70°C保存；
3)cDNA 合成上述 RNA 溶液用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转 录试剂盒逆转录得到cDNA溶液，逆转录反应条件42°C，60 min ；70°C, 15 min, cDNA溶液 在-20°C保存备用；具体逆转录方法按该逆转录试剂盒的操作说明进行；
4)目的片段制备对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为浓度 为 2. 5mmol/L 的 IOXBuffer 溶液 2. 5 μ 1，浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1，浓度为 25mmol/L的MgCl2溶液1. 5 μ 1，上述cDNA溶液1 μ 1，上述正向引物和反向引物各0. 5 μ 1， Taq 酶 0.2 μ 1，用 PCR 水补足至 25 μ 1，扩增反应条件为94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，循环30次，72 °C延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；该目的片段为 MSTN-I基因序列中193 bp前连接26bp正向引物，859 bp后连接25 bp反向引物的重组序 列；
5)目的片段纯化上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，在 凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1. 5 ml离心管 中，用EZ-IO spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的 纯化液；具体纯化操作步骤按该纯化试剂盒的操作说明进行；
6)目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建取上述含目的片段的纯化液2. 25 μ 1置于PCR 管中，加入pMD18-T质粒0. 25 μ 1和solution I溶液2. 5 μ 1，组成连接反应液，16°C连接3 小时，构建得到含目的片段-PMD18-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到50 μ 1感 受态细胞DH5 α中，冰上放置30min，然后42°C水浴90s，立刻放冰上4min，然后加入300 μ 1 LB液体培养基，在摇床中37°C震荡培养Ih得到培养液，摇床转速为150rpm，取120 μ 1培养 液涂于含氨苄的平板中，37°C培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含氨苄的LB液 体培养基中过夜扩大培养，该含氨苄的LB液体培养基中氨苄的终浓度为100μ g/ml，得到 含目的片段-PMD18-T-DH5 α的培养物，并测序验证；
7)大黄鱼MSTN-I前肽基因制备将上述培养物用质粒提取试剂盒抽提，得到含目的 片段-pMDlS-T质粒的抽提液，抽提方法依质粒提取试剂盒的操作说明进行，取含目的片 段-pMD18-T质粒的抽提液32 μ 1置于PCR管中，加入BamH I和Hind III限制性内切酶各 2μ Ι,ΙΟΧΚ buffer溶液4 μ 1，37°C酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的酶切液， 该酶切液先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干 净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-I前肽基因的琼脂条，放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spincolumn DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-1的前肽基因纯化 液，该大黄鱼MSTN-I前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；
8)pET_28a表达质粒的抽提和酶切将过夜培养的pET_28a-DH5α表达质粒菌液用质 粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET_28a表达 质粒的抽提液32μ1，BamH I和Hind III限制性内切酶各2 μ 1，IOXK buffer溶液4μ1， 37°C酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET_28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切 下目的条带，用EZ-IO spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切 之后的pET-28a表达质粒纯化液；
9)前肽基因-pET-28a-BL21载体构建取上述大黄鱼MSTN-I前肽基因纯化液7 μ 1， 上述pET-28a表达质粒纯化液 1 μ 1，T4 DNA Iigase溶液 1 μ 1，10ΧΤ4 DNA ligase buffer 溶液lyl，16°C连接过夜，然后转化到感受态DH5a中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液 测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感 受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养的 菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1 :50的比例进行扩大培养，37°C振摇培养 3 h 4 h，得到含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液，上述含卡那霉素的LB液体培 养基的卡那霉素终浓度为30 μ g/ml ；
10)大黄鱼MSTN-I前肽制备在含前肽基因-pET-28a-BL21载体的培养液加入浓度 为lmol/L的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)溶液，使其终浓度为0. 5mmol/L,诱导表达 培养3 h收集菌液，40C IOOOOrpm离心5 min,收集菌体，将菌体先用浓度0. 01mol/LPH7. 4 的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后5000rpm离心10 min，洗涤离心重复3次，得到去杂菌体， 用His. Bind Purification Kit纯化试剂盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、 层析、洗脱得到大黄鱼MSTN-I前肽溶液，末端测序验证，该大黄鱼MSTN-I前肽的氨基酸序 列如序列表SEQ ID NO. 2所示，-20°C冰箱保存备用。大黄鱼MSTN-I前肽抗体制备用等体积的弗氏佐剂将上述大黄鱼MSTN-I前肽溶 液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四次注射免疫反应，各次注射的间隔时 间为一周，首次注射量为100-200 μ g/只，第二、三四次注射量都为20-40 μ g/只，第四次注 射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37°C放置20min，然后置于4°C冰箱过夜，将过夜 的血液用4000rpm离心lOmin，取上清即为前肽抗体血清。上述Trizol溶液、IPTG溶液、PBS缓冲液、LB液体培养基、含氨苄的平板、弗氏 佐剂、EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购于 上海生工生物工程技术服务有限公司；其中LB液体培养基组成成份=Tryptone lg, Yeast Extract 0.5 g，NaCl lg，ddH20 至 100 ml, pH 为 7. 0 ；含氨苄的平板的组成为 Tryptone lg，Yeast Extract 0. 5 g，NaCl lg，琼脂粉 A 1.5 g，ddH20 至 100 ml，调 pH 至 7· 0，加氨节 使其终浓度为100 μ g/ml 1。上述PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、10XBuffer 溶液、Taq 酶、dNTP 溶液、pMD18_T 质粒、solution I 溶液、BamH I 酶、Hind III 酶、10XK buffer溶液、T4 DNA ligase溶液、10XΤ4 DNA ligase buffer溶液均购于大连宝生物工 程有限公司。感受态DH5 α、pET-28a_DH5 α表达质粒菌液和感受态BL21均购于北京天恩泽基因科技有限公司。
His. Bind Purification Kit 纯化试剂盒购于 Novagen 公司。与现有技术相比，本发明的优点大黄鱼MSTN-I前肽，该大黄鱼MSTN-I前肽的氨基 酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，该前肽可以结合大黄鱼肌肉生长抑制素的功能区域，抑 制肌肉生长抑制素的活性，促进大黄鱼的肌肉生长。大黄鱼MSTN-I前肽抗体可与该前肽结 合，阻断该前肽与大黄鱼MSTN-I成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌 肉的生长。大黄鱼MSTN-I前肽和前肽抗体的制备通过RNA提取、cDNA合成、目的片段制备、 目的片段纯化、目的片段-PMD18-T-DH5 α载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽基因制备、pET_28a 质粒的抽提和酶切、前肽基因_pET-28a- BL21载体构建、大黄鱼MSTN-I前肽制备及该前肽 的免疫应答反应，可以得到大量的大黄鱼MSTN-I前肽和纯度较高的前肽抗体，本发明的大 黄鱼MSTN-I前肽可以增加大黄鱼的肌肉量，本发明的前肽抗体可以抑制前肽的作用，因而 前肽和前肽抗体具有互相调节大黄鱼肌肉发育和生长的功能，如用本发明的前肽抗体注射 大黄鱼幼鱼，一月后的称量，注射前肽抗体的大黄鱼比未注射的大黄鱼体重轻8. 4%左右。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 实施例大黄鱼I型肌肉生长抑制素前肽和前肽抗体的制备方法
1)引物设计依据登录号为AY842933的大黄鱼I型肌肉生长抑制素基因序列，大小 为1906bp，根椐发明要求设计扩增MSTN-I前肽基因的引物，正向引物的核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO. 3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，其中正向引物含 BamH I酶切位点，反向引物含Hind III酶切位点；引物由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成；
2)RNA提取取IOOmg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入Iml Trizol溶液研磨成 勻浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0. 2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm 离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0. 5ml异丙醇，冰上置lOmin，12000rpm离心 lOmin，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混勻后7500rpm离心5min， 弃上清液，室温下干燥5-lOmin，加入30 μ 1水溶解，得到RNA溶液，_70°C保存；
3)cDNA合成上述RNA溶液用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆转录 试剂盒逆转录得到逆转录cDNA溶液，具体逆转录方法按该逆转录试剂盒的操作说明进行 在 Microtube 管中，力口 Oligo dT Primer (50 μ Μ) 1 μ 1，dNTP Mixture (IOmM each) 1 μ 1, Total RNA 2 μ 1，最后加RNase free dH20至10 μ 1，配制成混合液；在PCR仪上65°C变性 处理5min，然后冰上急冷退火；再在上述Microtube管中加入5XPrimeScript Buffer 4 μ 1, RNase Inhibitor (40 U/μ 1) 0. 5μ 1 , PrimeScript RTase (200 U/μ 1) 1 μ 1, RNase Free dH20 4. 5 μ 1，总体积为20 μ 1 ；在PCR仪上按下列条件进行反转录反应42°C， 60 min;70°C，15 min，最后 _20°C保存;
4)目的片段制备对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为浓度 为 2. 5mmol/L 的 IOXBuffer 溶液 2. 5 μ 1，浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTP 溶液 2. O μ 1，浓度为25mmol/L的MgCl2溶液1. 5 μ 1，上述cDNA溶液1 μ 1，上述正向引物和反向引物各0. 5 μ 1， Taq 酶 0.2 μ 1，用 PCR 水补足至 25 μ 1，扩增反应条件为94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，循环30次，72°C延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；
5)目的片段纯化上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时， 在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1. 5 ml离心管 中，用EZ-IO spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的 纯化液，纯化的目的片段溶于30 μ 1的Elution buffer，保存于-20 °C备用；具体纯化操作 步骤按该纯化试剂盒的操作说明进行；
6)目的片段-PMD18-T-DH5α载体构建取上述含目的片段的纯化溶液2. 25 μ 1置于 PCR管中，加入pMD18-T质粒0. 25 μ 1和solution I溶液2. 5 μ 1，组成连接反应液，16°C 连接3小时，构建得到含目的片段-pMDIS-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到 50 μ 1感受态细胞DH5a中，冰上放置30min，然后42°C水浴90s，立刻放冰上4min，然后加 入300 μ 1 LB液体培养基，在摇床中37°C震荡培养Ih得到培养液，摇床转速为150rpm，取 120 μ 1培养液涂于含氨苄的平板中，37°C培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含 氨苄的LB液体培养基中过夜扩大培养，培养基中氨苄终浓度为100 μ g/ml，得到含目的片 段-pMD18-T-DH5 α的培养物，并测序验证，经比对没有基因突变、缺失和增补等异常情况 存在，可以进行下一步实验；
7)大黄鱼MSTN-I前肽基因制备经测序验证后的培养物用质粒提取试剂盒抽提，得到 含目的片段-PMD18-T质粒的抽提液，抽提方法依质粒提取试剂盒说明书进行，取含目的片 段-pMD18-T质粒的抽提液32 μ 1置于PCR管中，加入BamH I和Hind III限制性内切酶各 2μ Ι,ΙΟΧΚ buffer溶液4 μ 1，37°C酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-1前肽基因的酶切液， 该酶切液先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干 净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-I前肽基因的琼脂条，放入1.5 ml离心管中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-1的前肽基因纯化 液，测序，该大黄鱼MSTN-I前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；
8)pET_28a表达质粒的抽提和酶切将过夜培养的pET_28a-DH5 α表达质粒菌液用质 粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET_28a表达 质粒的抽提液32μ1，BamH I和Hind III限制性内切酶各2 μ 1，10XK buffer溶液4μ1， 37°C酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET_28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切 下目的条带，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切 之后的pET-28a表达质粒纯化液，抽提和纯化方法依说明书进行；
9)前肽基因-pET-28a- BL21载体构建取上述大黄鱼MSTN-I前肽基因纯化液7 μ 1， 上述pET-28a表达质粒纯化液 1 μ 1，T4 DNA Iigase溶液 1 μ 1，10ΧΤ4 DNA ligase buffer 溶液lyl，16°C连接过夜，然后转化到感受态DH5a中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液 测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感 受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，培养基的卡 那霉素终浓度为30 μ g/ml，过夜培养的菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1 : 50的比例进行扩大培养，37°C振摇培养3 h 4 h，得到大量的含前肽基因-pET-28a- BL21 载体的培养液；10)大黄鱼MSTN-I前肽制备在含前肽基因-pET-28a-BL21载体的培养液加入浓度为 lmol/L的IPTG溶液，使其终浓度为0. 5mmol/L,诱导表达培养3 h收集菌液，4°C IOOOOrpm 离心5 min,收集菌体，将菌体先用浓度0. 01mol/L、PH7. 4的PBS缓冲液洗涤，然后5000rpm 离心10 min，洗涤离心重复3次，得到去杂菌体，用His. Bind Purification Kit纯化试剂 盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、层析、洗脱得到大黄鱼MSTN-I前肽溶液， 末端测序验证，该大黄鱼MSTN-I前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，_20°C冰箱 保存备用；
11)大黄鱼MSTN-I前肽抗体制备用等体积的弗氏佐剂将上述大黄鱼MSTN-I前肽溶 液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四次注射免疫反应，各次注射的间隔时 间为一周，首次注射量为100-200 μ g/只，第二、三四次注射量都为20-40 μ g/只，第四次注 射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37°C放置20min，然后置于4°C冰箱过夜，将过夜 的血液用4000rpm离心lOmin，取上清即为前肽抗体血清；
12)前肽抗体的Westblotting鉴定按照Western blot试剂盒进行免疫印迹实验， 检测该抗体，100V转膜2h，一抗与封闭液的比例1:1000，二抗与封闭液的比例为1:10000， 显色后在31KDa处出现棕色条带，说明抗体制备成功。 试验例
用体重为10. 5士2. 4克的养殖大黄鱼20尾，随机分成实验组10尾和对照组10尾，实 验组腹腔注射本发明的大黄鱼I型肌肉生长抑制素前肽抗体，注射量每尾100μ 1抗体溶 液(含20 μ 1抗体)，对照组注射等量的生理盐水，同样条件下养殖1月，称重，实验组的体 重为14. 1 士3. 6克，对照组的体重为15. 4士3. 9克，实验组比对照组轻8. 4%。
权利要求
大黄鱼MSTN 1前肽，其特征在于该大黄鱼MSTN 1前肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.利用权利要求1所述的大黄鱼MSTN-I前肽制备得到的大黄鱼MSTN-I前肽抗体，其 特征在于该前肽抗体为所述大黄鱼MSTN-I前肽免疫应答反应的血液中分离得到的血清。
3.权利要求1所述的大黄鱼MSTN-I前肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)引物设计依据登录号为AY842933的大黄鱼肌肉生长抑制素基因序列，大小为 1906bp，根椐编码大黄鱼MSTN-I前肽的核苷酸序列设计引物，正向引物的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO. 3所示，反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示，其中正向引物 含BamH I酶切位点，反向引物含Hind III酶切位点；2)RNA提取取IOOmg大黄鱼肌肉在液氮中磨成粉末，加入Iml Trizol溶液研磨成 勻浆，室温放置5分钟，转移到离心管并加入0. 2ml氯仿，剧烈摇荡离心管15秒，12000rpm 离心20min，取上层水相置于另一离心管，加0. 5ml异丙醇，冰上置lOmin，12000rpm离心 lOmin，弃上清液，沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，混勻后7500rpm离心5min， 弃上清液，室温下干燥5-lOmin，加入30 μ 1水溶解，得到RNA溶液，_70°C保存；3)cDNA 合成上述 RNA 溶液用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转 录试剂盒逆转录得到cDNA溶液，逆转录反应条件42°C，60 min ；70°C, 15 min, cDNA溶液 在-20°C保存备用；4)目的片段制备对上述逆转录cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增反应体系为浓度 为 2. 5mmol/L 的 IOXBuffer 溶液 2. 5 μ 1，浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1，浓度为 25mmol/L的MgCl2溶液1. 5 μ 1，上述cDNA溶液1 μ 1，上述正向引物和反向引物各0. 5 μ 1， Taq 酶 0.2 μ 1，用 PCR 水补足至 25 μ 1，扩增反应条件为94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s，循环30次，72 °C延伸6min，获得含718bp目的片段的PCR产物；5)目的片段纯化上述PCR产物先用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时， 在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含目的片段的琼脂条，琼脂条放入1. 5 ml离心管 中，用EZ-10 spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含目的片段的 纯化液；6)目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建取上述含目的片段的纯化液2. 25 μ 1置于PCR 管中，加入pMD18-T质粒0. 25 μ 1和solution I溶液2. 5 μ 1，组成连接反应液，16°C连接3 小时，构建得到含目的片段-PMD18-T克隆质粒的连接反应液，将连接反应液加到50 μ 1感 受态细胞DH5 α中，冰上放置30min，然后42°C水浴90s，立刻放冰上4min，然后加入300 μ 1 LB液体培养基，在摇床中37°C震荡培养Ih得到培养液，摇床转速为150rpm，取120 μ 1培养 液涂于含氨苄的平板中，37°C培养14小时，挑菌PCR检测，取阳性克隆菌在含氨苄的LB液 体培养基中过夜扩大培养，该含氨苄的LB液体培养基中氨苄的终浓度为100 μ g/ml，得到 含目的片段-PMD18-T-DH5 α的培养物，并测序验证；7)大黄鱼MSTN-I前肽基因制备将上述含目的片段-PMD18-T-DH5α的培养物用质粒 提取试剂盒抽提，得到含目的片段-PMD18-T质粒的抽提液，取含目的片段-pMDIS-T质粒的 抽提液32 μ 1置于PCR管中，加入BamH I和Hind III限制性内切酶各2 μ 1，10ΧΚ buffer 溶液4μ 1，37°C酶切3小时，得到含大黄鱼MSTN-I前肽基因的酶切液，该酶切液先用质 量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳半小时，再在凝胶成像分析仪上用干净的手术刀割下含大黄鱼MSTN-I前肽基因的琼脂条，放入1. 5 ml离心管中，用EZ-IO spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到含大黄鱼MSTN-I前肽基因的纯化液，该大黄鱼 MSTN-I前肽基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示； 8)pET-28a表达质粒的抽提和酶切将过夜培养的pET_28a-DH5 α表达质粒菌液用质 粒提取试剂盒的抽提，得到含pET-28a表达质粒的抽提液，在PCR管中加入含pET_28a表达 质粒的抽提液32μ1，BamH I和Hind III限制性内切酶各2 μ 1，IOXK buffer溶液4μ1， 37°C酶切3小时，得到酶切的pET-28a质粒，酶切的pET_28a质粒先用琼脂糖电泳检测并切 下目的条带，用EZ-IO spin column DNA gel extraction kit纯化试剂盒纯化，得到酶切 之后的pET-28a表达质粒纯化液；9)前肽基因-pET-28a-BL21载体构建取上述大黄鱼MSTN-I前肽基因纯化液7 μ 1， 上述pET-28a表达质粒纯化液 1 μ 1，T4 DNA Iigase溶液 1 μ 1，10ΧΤ4 DNA ligase buffer 溶液lyl，16°C连接过夜，然后转化到感受态DH5a中，过夜培养之后挑取阳性克隆菌液 测序验证，验证后用质粒提取试剂盒抽提，得到前肽基因-pET-28a质粒，将该质粒导入感 受态BL21细胞中，挑取阳性克隆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养的 菌液再与含卡那霉素的LB液体培养基按体积比1 :50的比例进行扩大培养，37°C振摇培养 3 h 4 h，得到含前肽基因-pET-28a- BL21载体的培养液，上述含卡那霉素的LB液体培 养基的卡那霉素终浓度为30 μ g/ml ；10)大黄鱼MSTN-I前肽制备在含前肽基因-pET-28a-BL21载体的培养液加入浓度 为lmol/L的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷溶液，使其终浓度为0. 5mmol/L,诱导表达培养3 h收集菌液，4°C IOOOOrpm离心5 min，收集菌体，将菌体先用浓度0. 01mol/L、PH7. 4的磷酸 盐缓冲液洗涤，然后5000rpm离心10 min,洗涤离心重复3次，得到去杂菌体，用His. Bind Purification Kit纯化试剂盒，按说明书要求，将去杂菌体破碎、提取、纯化、层析、洗脱得 到大黄鱼MSTN-I前肽溶液，末端测序验证，该大黄鱼MSTN-I前肽的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO. 2所示，_20°C冰箱保存备用。
4.权利要求2所述的大黄鱼MSTN-I前肽抗体制备方法，其特征在于用等体积的弗氏 佐剂将所述的大黄鱼MSTN-I前肽的溶液乳化为乳化液，用该乳化液对ICR小鼠腹腔进行四 次注射免疫反应，各次注射的间隔时间为一周，首次注射量为100-200 μ g/只，第二、三四 次注射量都为20-40yg/只，第四次注射后三天摘眼球取血，血液置于离心管中，37°C放置 20min，然后置于4°C冰箱过夜，将过夜的血液用4000rpm离心lOmin，取上清即为前肽抗体 血清。
全文摘要
本发明公开了大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体及制备方法，该大黄鱼MSTN-1前肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示，该前肽可以结合大黄鱼肌肉生长抑制素的功能区域，抑制肌肉生长抑制素的活性，促进大黄鱼的肌肉生长；大黄鱼MSTN-1前肽抗体可与该前肽结合，阻断该前肽与大黄鱼MSTN-1成熟肽结合，激活肌肉生长抑制素的活性，抑制大黄鱼肌肉的生长；大黄鱼MSTN-1前肽和前肽抗体的制备通过RNA提取、cDNA合成、目的片段制备、目的片段纯化、目的片段-pMD18-T-DH5α载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽基因制备、pET-28a质粒的抽提和酶切、前肽基因-pET-28a-BL21载体构建、大黄鱼MSTN-1前肽制备及该前肽的免疫应答反应，可以得到大量的大黄鱼MSTN-1前肽和纯度较高的前肽抗体。
文档编号C07K16/06GK101955526SQ20101029134
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者叶秀丽, 薛良义 申请人:宁波大学