专利名称：一种中试规模提取分离高纯度红景天苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种红景天提取物及其制备方法。
背景技术：
红景天苷是景天科红景天属植物的主要活性成分，具有诸多药理作用，如(1)抗 心肌缺血(张早华，杨梅香，王广泽.红景天胶囊对实验性心肌缺血合并心衰大鼠的影 响.中国实验方剂学杂志，1998，4(1) 24-26) ； (2)抗缺氧抗疲劳抗衰老；(3)免疫调节等 (宋月英，韩慧文，郝素云.红景天研究进展.武警医学院学报，2004;13(1) :66-67)。临床 应用与产品开发刘新宏等(刘心宏，何桂英，姚小伟，等.圣地红景天胶囊治疗心绞痛患者 30例.陕西中医，1999，20 (1) :8_9)应用圣地红景天胶囊治疗30例心绞痛患者，总有效率 90%;毛静远(毛静远，王化良，赵汝菊，等.红景天胶囊治疗冠心病心绞痛临床研究.中国 医药学报，2002，17 (8) 480-483)应用红景天胶囊治疗100例冠心病、心绞痛患者(心血淤 阻型)，总有效率90%。目前市售红景天制剂的原料药多为红景天苷含量较低的浸膏，安全 性稳定性都难以控制。为了提高红景天苷的药物安全性，并实现药物效用的最大化，提高原 料药中红景天苷含量成为必然趋势。近年来，有关红景天苷提取分离的研究也很活跃，开发 了很多思路和方法，发表了很多文献和专利。而大孔吸附树脂作为20世纪70年代发展起 来的新技术，具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点。其应用 到中药有效成分的分离过程已经被广泛地研究。已有很多以大孔树脂为主要分离方法分离 红景天苷的报道出现，如邰韧辉(邰韧辉.高纯度红景天苷的制备工艺研究.现代中药研 究与实践.2004年第18卷第4期，58-59)探索了用溶剂萃取结合大孔吸附树脂分离，然后 用硅胶柱精致得到较高含量的红景天苷。但是其工艺缺乏必备的放大参数，无法直接用于 大规模生产，而且硅胶柱层析过程中可能残留有机溶剂。王化田等(王化田，龚刚明.大孔 树脂纯化红景天苷工艺的研究·食品科学· 2007, Vol. 28, No. 02，117-120)以超临界CO2萃 取后的红景天干粉乙醇常温浸提液中的红景天苷为纯化对象，采用大孔树脂为分离介质， 并对纯化工艺进行了系统研究，得出初步纯化红景天苷的最佳工艺路线；经此纯化工艺可 将红景天苷初步纯化到40%。然而，其分离过程中采用了二氯甲烷这种有毒性的有机溶剂 作为解吸附剂，同样埋下安全隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种红景天提取物及其制备方法。本发明提供的制备红景天提取物的方法，包括如下步骤1)将红景天块根粉碎后，用水煎煮后合并煎煮液，过滤，将所得滤液浓缩得到浸膏 I ；2)向所述步骤1)所得浸膏I中加入乙醇，混勻后冷藏，过滤，将所得沉淀用乙醇水 溶液I溶解，过滤后合并所得滤液，将所得滤液浓缩得到浸膏II ；3)向所述步骤2)所得浸膏II中加入乙醇，混勻后冷藏，过滤，将所得沉淀用乙醇水溶液II溶解，过滤后合并所得滤液并调节PH值至8 8. 5，冷藏过滤后，将所得滤液浓缩 得到浸膏A ；4)将所述步骤3)所得浸膏A溶于水，得到浸膏A的水溶液，将所述浸膏A的水溶 液上样于大孔树脂柱中，依次用水、乙醇水溶液a和乙醇水溶液b进行洗脱，收集洗脱液，浓 缩得到浸膏B ；5)将所述步骤4)所得浸膏B溶于水，得到浸膏B的水溶液，将所述浸膏B的水溶 液上样于大孔树脂柱中，依次用水、乙醇水溶液c和乙醇水溶液d进行洗脱，收集洗脱液，浓 缩、烘干后得到浸膏C;6)将所述步骤5)所得浸膏C溶于水，得到浸膏C的水溶液，将所述浸膏C的水溶 液上样于大孔树脂柱中，依次用乙醇水溶液e和乙醇水溶液f进行洗脱，浓缩、烘干后得到 所述红景天提取物。上述方法的步骤1)用水煎煮步骤中，每次煎煮步骤中水的用量为所述红景天质 量的4-8倍，优选6倍，时间为1. 5至3小时，优选2小时，次数为2-4次，优选3次；所述浸 膏I在50°C的相对密度为1. 15-1. 20。所述步骤2)中，向所述浸膏I中加入乙醇步骤中，乙醇在由所述浸膏I和乙醇组 成的混合液中的质量百分比为60-80%，优选70% ；所述冷藏步骤中，温度为5-10°C，优选 5°C，时间为12-36小时，优选24小时；所述将所得沉淀用乙醇水溶液I溶解步骤中，所述乙 醇水溶液I的体积百分浓度为60-80%，优选70%，次数为1-2次，优选1次；所述浸膏II 在50°C的相对密度为1. 15-1. 20。所述步骤3)中，向所得浸膏II中加入乙醇步骤中，乙醇在由所述浸膏II和乙醇 组成的混合液中的质量百分比为80-90%，优选85% ；所述冷藏步骤中，温度均为5-10°C， 优选5°C，时间为12-24小时，优选12小时；所述将所得沉淀用乙醇水溶液II溶解步骤中， 所述乙醇水溶液II的体积百分浓度为80-90%，优选85%，次数为1-2次，优选1次；所述 调节PH值步骤中，pH值为8. 0 ；所述浸膏A在50°C的相对密度为1. 15-1. 20。所述步骤4)中，所述大孔树脂注中的大孔树脂型号为SP825 ；所述乙醇水溶液a 的体积百分浓度为3-6%，优选5%，乙醇水溶液b的体积百分浓度为8-12%，优选10% ； 所述浸膏B在50°C的相对密度为1. 20-1. 30 ；所述水的用量为所述大孔树脂柱体积的4_10 倍，优选8倍；所述乙醇水溶液a的用量为所述大孔树脂柱体积的2-5倍，优选3倍；所述 乙醇水溶液b的用量为所述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍所述洗脱步骤中，洗脱速 率均为l-3BV/h，优选2BV/h。所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，具体可为1 6_8或 1 8-10，优选1 10;所述浸膏A的水溶液的浓度为15-60mg/ml，具体可为，优选60mg/ ml;所述浸膏A的水溶液中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg Ig, 具体为 28-42. 5mg Ig,31. 1-41. Img lg、31. 25_38mg lg、33_36. 25mg Ig 或 28-35. 6mg lg，优选45mg lg。所述大孔树脂柱的径高比中，径为该树脂柱的内径，高为 树脂柱内的大孔树脂填充高度。所述步骤5)中，所述大孔树脂柱中的大孔树脂型号为SP825 ；所述乙醇水溶液 c的体积百分浓度为3-6 %，优选5 %，所述乙醇水溶液d的体积百分浓度为8-12 %，优选 10%;所述浸膏C在50°C的相对密度为1. 20-1. 30 ；所述水的用量为所述大孔树脂柱体积的 4-10倍，优选8倍；所述乙醇水溶液c的用量为所述大孔树脂柱体积的2-4倍，优选3倍；所述乙醇水溶液d的用量为所述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍；所述洗脱步骤中，洗脱 速率均为l_3BV/h，优选2BV/h。所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，具体可为1 6_8 或1 8-10，优选1 10 ；所述浸膏B的水溶液的浓度为15-60mg/ml，具体可为，优选60mg/ ml ；所述浸膏B的水溶液中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg lg，优 选45mg Igo所述大孔树脂柱的径高比中，径为该树脂柱的内径，高为树脂柱内的大孔树 脂填充高度。所述步骤6)中，所述大孔树脂注中的大孔树脂型号为SP825 ；所述乙醇水溶液e 的体积百分浓度为1_5%，优选3%，所述乙醇水溶液f的体积百分浓度为12-16%，优选 15% ；所述乙醇水溶液e的用量为所述大孔树脂柱体积的2-5倍，优选4倍；所述乙醇水溶 液f的用量为所述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍；所述洗脱步骤中，洗脱速率均为 l-3BV/h，优选2BV/h 所述烘干步骤中，温度为50-80°C，优选60°C，时间为6_10小时，优选 8小时。所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，具体可为1 6-8或1 8-10，优选1 10; 所述浸膏C的水溶液的浓度为15-60mg/ml，具体可为，优选60mg/ml ；所述浸膏C的水溶液 中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg lg，优选45mg lg。所述大孔 树脂柱的径高比中，径为该树脂柱的内径，高为树脂柱内的大孔树脂填充高度。上述步骤4)_6)中，所用大孔树脂柱均为同一根大孔树脂柱。为进一步提高分 离效果，可在步骤4)-6)每次洗脱步骤之后进行如下处理利用3倍柱体积的体积百分浓 度为95%的乙醇水溶液将树脂柱中的脂溶性杂质洗脱干净，再用纯水冲柱至无醇味，并用 HPLC全程监测其中含有红景天苷的洗脱液，将所有含有红景天苷的洗脱液汇集，再按照步 骤4)-6)的洗脱步骤进行洗脱。另外，按照上述方法制备所得红景天提取物，也属于本发明的保护范围。本发明提供的制备红景天提取物的方法，工艺简便，且过程中避免了有毒的有机 溶剂，所得红景天提取物中红景天苷的纯度大于90%，由于该制备方法每次分离步骤中杂 质部分亦含有红景天苷，将杂质在每次分离步骤中重复上样，可使最终提取物中红景天苷 的产率进一步提高，可达95%以上，从而进一步降低了原料红景天中红景天苷的提取损失 率，故该方法具有重要的应用价值。
图1为红景天苷提取分离工艺简图。图2为实施例2红景天苷提取分离过程中对照品的HPLC色谱图。图3为实施例2红景天苷提取分离过程中药材的HPLC色谱图。图4为实施例2红景天苷提取分离过程中浸膏A的HPLC色谱图。图5为实施例2红景天苷提取分离过程中终产品的HPLC色谱图。图6为实施例2提取所得红景天苷与红景天苷对照品红外光谱图。(上为样品、下 为对照品)图7为实施例2提取所得红景天苷与红景天苷对照品核磁氢谱图。(上为样品、下 为对照品)图8为红景天苷溶液高效液相色谱峰面积对浓度线性回归图。图9为红景天苷对照品溶液(100 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图10为红景天苷对照品名容液(200 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图11为红景天苷对照品名容液(300 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图12为红景天苷对照品名容液(350 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图13为红景天苷对照品名謎(400 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图14为红景天苷对照品名謎(500 μ g/ml)的高效液相色谱图。
图15为红景天苷注射用原料含量测定用对照品的HPLC色谱图。
图16为红景天苷注射用原料HPLC色谱图a。
图17为红景天苷注射用原料HPLC色谱图b。
图18为红景天苷注射用原料HPLC色谱图C。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下 述实施例中所述方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例步骤6)所得红景天苷的产 率均按照如下公式计算而得步骤6)所得红景天提取物的质量乘以纯度，所得数值除以步骤3)所得浸膏A中 红景天苷的质量再乘以100%。如实施例1中红景天苷的产率的计算过程如下114乘以 94%除以170乘以100%，得到产率为63%。下述实施例中红景天苷的含量均参照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部 附录VID)进行测定(a)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱分析 柱；以乙腈-水(90 10)为流动相；检测波长为275nm。理论塔板数按红景天苷峰计算应 不低于2000。(b)对照品溶液的制备取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每Iml含 0. 3mg的溶液，即得。(c)供试品溶液的制备取精密称取注射用红景天苷原料适量，加水制成每Iml含 红景天苷0. 3mg的溶液，即得。(d)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μ L，注入高效液相色谱 仪，测定，即得。上述测定红景天苷的含量时，所用标准曲线是按照如下线性试验而得称取红景天苷对照品25mg，置25ml容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇勻，得 每Iml含Img红景天苷对照品溶液。精密量取该溶液1ml、2ml、3ml、3. 5ml、4ml、5ml，分别置 IOml容量瓶，加水稀释至刻度，摇勻，备测。用高效液相色谱仪测定各溶液中红景天苷峰面 积(进样量为20 μ 1)，结果见表1，以峰面积积分值为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，绘制 标准曲线，见图8。由图可知，红景天苷在100. 0 500. 0 μ g/ml范围内呈线性关系，其回 归方程为:y = 5. 7687X+31. 031 (r = 0. 9993)，色谱图见图9-14。其中，图9中保留时间为 7. 751min,峰面积为612. 7 ；图10中保留时间为7. 737min,峰面积为1164. 2 ；图11中保留时 间为7. 752min，峰面积为1777. 3 ；图12中保留时间为7. 752min，峰面积为2077. 1 ；图13中 保留时间为7. 745min，峰面积为2309. 2 ；图14中保留时间为7. 721min，峰面积为2917. 8 ；表1、线性关系考察
权利要求
一种制备红景天提取物的方法，包括如下步骤1)将红景天块根用水煎煮后合并煎煮液，过滤，将所得滤液浓缩得到浸膏I；2)向所述步骤1)所得浸膏I中加入乙醇，混匀后冷藏，过滤，将所得沉淀用乙醇水溶液I溶解，过滤后合并所得滤液，将所得滤液浓缩得到浸膏II；3)向所述步骤2)所得浸膏II中加入乙醇，混匀后冷藏，过滤，将所得沉淀用乙醇水溶液II溶解，过滤后合并所得滤液并调节pH值至8.0 8.5，冷藏过滤后，将所得滤液浓缩得到浸膏A；4)将所述步骤3)所得浸膏A溶于水，得到浸膏A的水溶液，将所述浸膏A的水溶液上样于大孔树脂柱中，依次用水、乙醇水溶液a和乙醇水溶液b进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到浸膏B；5)将所述步骤4)所得浸膏B溶于水，得到浸膏B的水溶液，将所述浸膏B的水溶液上样于大孔树脂柱中，依次用水、乙醇水溶液c和乙醇水溶液d进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到浸膏C；6)将所述步骤5)所得浸膏C溶于水，得到浸膏C的水溶液，将所述浸膏C的水溶液上样于大孔树脂柱中，依次用乙醇水溶液e和乙醇水溶液f进行洗脱，浓缩、烘干后得到所述红景天提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)用水煎煮步骤中，每次煎煮 步骤中水的用量为所述红景天质量的4-8倍，优选6倍，时间为1. 5-3小时，优选2小时，次 数为2-4次，优选3次；所述浸膏I在50°C的相对密度为1. 15-1. 20。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，向所述浸膏I中加 入乙醇步骤中，乙醇在由所述浸膏I和乙醇组成的混合液中的质量百分比为60-80%，优选 70% ；所述冷藏步骤中，温度为5-10°C，优选6°C，时间为12-36小时，优选12小时或24小时；所述将所得沉淀用乙醇水溶液I溶解步骤中，所述乙醇水溶液I的体积百分浓度为 60-80 %，优选70 %，次数为1-2次，优选1次；所述浸膏II在50°c的相对密度为1. 15-1. 20。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，向所得浸膏II中 加入乙醇步骤中，乙醇在由所述浸膏II和乙醇组成的混合液中的质量百分比为80-90%， 优选85% ；所述冷藏步骤中，温度均为5-10°C，优选6°C，时间均为12-36小时，优选12小时或24 小时；所述将所得沉淀用乙醇水溶液II溶解步骤中，所述乙醇水溶液II的体积百分浓度为 80-90 %，优选85 %，次数为1-2次，优选1次；所述调节PH值步骤中，pH值为8. 0 ；所述浸膏A在50°C的相对密度为1. 15-1. 20。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步骤4)中，所述大孔树脂柱 中的介质为SP825树脂；所述乙醇水溶液a的体积百分浓度为3-6 %，优选5 %，乙醇水溶液 b的体积百分浓度为8-12%，优选10% ；所述上样步骤中，洗脱速率为lBV/h ；所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，优选1 10;所述浸膏A的水溶液的浓度为15-60mg/ml，优选60mg/ml ；所述浸膏A的水溶液中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg lg，优 选 45mg Ig ；所述洗脱步骤中，所述水的用量为所述大孔树脂柱体积的4-10倍，优选8倍；所述乙醇 水溶液a的用量为所述大孔树脂柱体积的2-4倍，优选3倍；所述乙醇水溶液b的用量为所 述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍；洗脱速率均为l_3BV/h，优选2BV/h ；所述浸膏B在50°C的相对密度为1. 20-1. 30。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述步骤5)中，所述大孔树脂柱 中的介质为SP825树脂；所述乙醇水溶液c的体积百分浓度为3-6%，优选5%，所述乙醇水 溶液d的体积百分浓度为8-12%，优选10% ；所述上样步骤中，洗脱速率为lBV/h ；所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，优选1 10;所述浸膏B的水溶液的浓度为15-60mg/ml，优选60mg/ml ；所述浸膏B的水溶液中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg lg，优 选 45mg Ig ；所述洗脱步骤中，所述水的用量为所述大孔树脂柱体积的4-10倍，优选8倍；所述乙醇 水溶液c的用量为所述大孔树脂柱体积的2-4倍，优选3倍；所述乙醇水溶液d的用量为所 述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍；洗脱速率均为l_3BV/h，优选2BV/h ；所述浸膏C在50°C的相对密度为1. 20-1. 30。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述步骤6)中，所述大孔树脂柱 中的介质为SP825树脂；所述乙醇水溶液e的体积百分浓度为1_5%，优选3%，所述乙醇水 溶液f的体积百分浓度为12-16%，优选15% ；所述上样步骤中，洗脱速率为lBV/h ；所述大孔树脂柱的径高比为1 6-10，优选1 10;所述浸膏C的水溶液的浓度为15-60mg/ml，优选60mg/ml ；所述浸膏C的水溶液中红景天苷的质量与所述大孔树脂的质量比为28-56mg lg，优 选 45mg Ig ；所述洗脱步骤中，所述乙醇水溶液e的用量为所述大孔树脂柱体积的2-5倍，优选4 倍；所述乙醇水溶液f的用量为所述大孔树脂柱体积的6-10倍，优选8倍；洗脱速率均为 l-3BV/h，优选 2BV/h ；所述烘干步骤中，温度为60-80°C，优选60°C，时间为6-10小时，优选10小时。
8.权利要求1-7任一所述方法制备所得红景天提取物。
全文摘要
本发明公开了一种红景天提取物及其制备方法。该方法，包括如下步骤1)将红景天块根粉碎后，用水煎煮后合并煎煮液，浓缩得浸膏I；2)向浸膏I中加入乙醇，沉淀，溶解，浓缩得到浸膏II；3)向浸膏II中加入乙醇，沉淀，溶解，浓缩得浸膏A；4)将浸膏A上样于大孔树脂柱中，用水、乙醇水溶液a和乙醇水溶液b洗脱，收集洗脱液，浓缩得浸膏B；5)将浸膏B上样于大孔树脂柱中，依次用水、乙醇水溶液c和乙醇水溶液d洗脱，收集洗脱液，浓缩得浸膏C；6)将浸膏C上样于大孔树脂柱中，用乙醇水溶液e和乙醇水溶液f进行洗脱，浓缩、烘干后得到红景天提取物。该方法提取过程中无有机溶剂，提取物纯度大于90％，提取损失率低。
文档编号C07H15/18GK101955501SQ201010511429
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者刘伟祥, 向飞军, 吕万良, 周佳, 居瑞军, 张强, 张早华, 李若婧, 许冬谨, 马兴田 申请人:北京大学;康美药业股份有限公司