专利名称：一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时制备毛蕊异黄酮(Calycosin)、芒柄花素 (Formononetin)化学对照品的制备新工艺。主要包括硅胶柱色谱纯化、重结晶二个步骤。
背景技术：
黄芪为临床常用中药，有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效，所含的皂苷和黄 酮类成分为其主要活性成分。毛蕊异黄酮和芒柄花素是黄芪中含量较高的两个异黄酮类化 合物，为黄芪的潜在质控指标成分；同时现代药理表明，黄芪中的异黄酮类成分具有抗菌消 炎、降血脂等多种药理作用，因此获取大量对照品，对于黄芪相关制品的质量控制和深入研 究黄芪的功效等具有重要意义。目前，从黄芪中制备黄酮类化合物的报道多为实验室规模，步骤较繁琐；有少量 规模化生产的报道，但对照品纯度不高。中国专利(CN201010101961.3)报道采用勻浆萃 取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化提取技术、液液萃取、大孔吸附树脂、硅胶层析等 步骤，从黄芪注射液废渣中提取毛蕊异黄酮和芒柄花素，但对照品纯度为95%。本发明通过 合理简化步骤及优化各步骤的参数，达到快速从黄芪提取物中分离纯化两个高纯对照品的 目的。
发明内容
本发明旨在提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以黄芪粗提物为原 料，同时制备纯度大于98%的毛蕊异黄酮和芒柄花素两种化学对照品，制备规模为克级。为实现上述目的，本发明采用的技术方案1)硅胶柱色谱纯化黄芪醇提物，用硅胶柱色谱分离，石油醚、乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层色谱检测， 收集Rf值在0. 13-0. 32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为毛蕊异黄酮粗品；收集Rf值在 0. 44-0. 64的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为芒柄花素粗品；2)重结晶上述对照品粗品用适宜溶剂溶解，低温放置析晶，即可获得纯度大于98%的毛蕊 异黄酮和芒柄花素对照品，其外观为白色粉末。所述步骤1)的具体过程为，硅胶柱色谱采用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混 合溶剂，其体积比例为8 2-5 5;薄层色谱采用的薄层板为GF2M荧光板，展开剂为石 油醚和乙酸乙酯的混合溶液，其体积比例为7 3 5 5，紫外灯254nm处检视暗斑点。所述步骤2)的具体过程为，重结晶的溶剂为体积比为3 7 5 5的石油醚-乙 酸乙酯、体积比为3 7 5 5的石油醚-丙酮、或甲醇等；温度为-4°C -20°C;放置时 间为24-48小时。以本发明从天麻中分离毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷化学对照品具有如下优 点和进步1)本发明工艺简单，且可同时获取两个高纯度对照品。
本发明采用黄芪提取物直接进行硅胶层析，通过优选流动相洗脱条件及控制流份 收集条件，相应流份直接浓缩即可析出结晶(或沉淀)，获得的对照品粗品的纯度可达85% 以上；粗品再经过一次重结晶，即可获得纯度大于98%的对照品。与文献报道经乙酸乙酯 萃取、反复硅胶柱层析、sephadex LH-20柱分离等比较，工艺较为简单。2)本发明采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。原料要求不高，一般市售粗提物即可，易于批量备料；硅胶柱层析可用中压层析， 也可用减压层析，而后者制备规模及通量较中压层析有大幅度的提升；硅胶填料便宜易得， 所用溶剂仅涉及石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等常规溶剂，价廉易得。
图1为硅胶柱层析后获得的毛蕊异黄酮粗品(第一次结晶)的HPLC图谱OMnm)； a毛蕊异黄酮粗品；图2为硅胶柱层析后获得的芒柄花素粗品(第一次结晶)的HPLC图谱OMnm)； b芒柄花素粗品；图3为毛蕊异黄酮对照品(第二次结晶)的HPLC分析图谱OMnm)；图4为芒柄花素对照品(第二次结晶)的HPLC分析图谱OMnm)。
具体实施例方式现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而 非对本发明的限定。实施例11)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物浸膏70g，加入约70g硅胶拌勻，60°C减压干燥，硅胶减压层析 (21cm*12cm)分离，分别用5倍柱体积的石油醚乙酸乙酯(体积比8 2)、石油醚乙酸 乙酯(体积比7 3)、石油醚乙酸乙酯(体积比5 5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测，以 石油醚乙酸乙酯(体积比1 1)为展开剂，GF2M荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点， 收集Rf值为0. 13的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀35mg(毛蕊异黄酮粗品，图1)；收集Rf 值为0. 44的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀Ilmg(芒柄花素粗品，图2)；2)重结晶上述对照品粗品分别以甲醇溶液加热溶解(< 60°C )，冰箱冷藏室低温放置 (-40C )，24h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮16mg，芒柄花素5mg。经HPLC归一化 检测，它们的纯度分别为99. 00% (图3)和98. 30% (图4)。上述对照品的UV、MS均和文献相一致。实施例21)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物浸膏700g，加入约700g硅胶拌勻，60°C减压干燥，硅胶柱层析 (8cm*80cm)分离，分别用4倍柱体积的石油醚乙酸乙酯(体积比8 2)、石油醚乙酸 乙酯(体积比7 3)、石油醚乙酸乙酯(体积比5 5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测，以 石油醚乙酸乙酯(体积比3 7)为展开剂，GF2M荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑点，收集Rf值为0. 32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀360mg(毛蕊异黄酮粗品)；收集Rf值 为0. 64的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀105mg(芒柄花素粗品)；2)重结晶上述对照品粗品分别以石油醚乙酸乙酯(体积比3 7)超声溶解，冰箱冷藏室 低温放置(_4°C )，48h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮155mg，芒柄花素53mg。经 HPLC归一化检测，它们的纯度分别为98. 52%和98. 92%。实施例31)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物浸膏7000g，加入约7000g硅胶拌勻，60°C减压干燥，硅胶柱层析 (9. 5cm*120cm)分离，分别用3倍柱体积的石油醚乙酸乙酯(体积比8 2)、石油醚乙 酸乙酯(体积比7 3)、石油醚乙酸乙酯(体积比5 5)台阶梯度洗脱，薄层色谱检测， 以石油醚乙酸乙酯(体积比1 1)为展开剂，GF2M荧光板，紫外灯254nm处检视暗斑 点，收集Rf值为0. 20的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀3. 58g(毛蕊异黄酮粗品)；收集Rf 值为0. 48的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀1. lg(芒柄花素粗品)；2)重结晶上述对照品粗品分别以石油醚丙酮(体积比5 5)超声溶解溶解，冰箱冷冻室 低温放置(_20°C)，36h后析出白色沉淀，过滤，可得毛蕊异黄酮1.6g，芒柄花素528mg。经 HPLC归一化检测，它们的纯度分别为98. 75%和98. 63%。
权利要求
1.一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的方法，其特征在于黄芪醇提物， 经硅胶柱色谱纯化、重结晶两个步骤，获得纯度大于98%的毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品。 具体步骤如下1)硅胶柱色谱纯化黄芪醇提物，用硅胶柱色谱分离，石油醚、乙酸乙酯混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收 集Rf值在0. 13-0. 32的洗脱液，浓缩，析出浅黄色沉淀为毛蕊异黄酮粗品；收集Rf值在 0. 44-0. 64的洗脱液；浓缩，析出浅黄色沉淀为芒柄花素粗品；2)重结晶上述对照品粗品用适宜溶剂溶解，低温放置析晶，即可获得纯度大于98%的毛蕊异黄 酮和芒柄花素对照品，其外观为白色粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于1)步骤中石油醚和乙酸乙酯的体积比例 为 8 2-5 5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于1)步骤中薄层色谱的展开剂为石油醚和 乙酸乙酯的混合溶液，其体积比例为5 5 3 7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于1)步骤薄层色谱中的薄层板为GF2M荧 光板，紫外灯254nm处检视暗斑点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于2)步骤中重结晶的溶剂为体积比为 3 7 5 5的石油醚-乙酸乙酯、体积比为3 7 5 5的石油醚-丙酮、或甲醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于2)步骤中重结晶的温度为_4°C -20°C， 放置时间为12-48小时。
全文摘要
本发明涉及一种同时制备毛蕊异黄酮、芒柄花素化学对照品的制备新工艺。黄芪醇提物，经硅胶柱色谱纯化、重结晶两个步骤，即可获得纯度大于98％的毛蕊异黄酮、芒柄花素两种化学对照品。本发明工艺步骤简单、纯度高，并且易规模化生产。
文档编号C07D311/36GK102079738SQ20101056695
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者彭杰, 王莉, 肖红斌, 赵楠 申请人:中国科学院大连化学物理研究所