专利名称：一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，属于生物技术领域。
背景技术：
土壤微生物群落作为生态系统中极重要的一环，对植物的生长、生态系统中能量 流动、物质循环、环境污染物降解与解毒等方面都起着重要作用。近年来，出现了一些研究 微生物群落多样性及其互作的新技术，环境宏蛋白质组学技术便是其中一个。该方法除可 对环境中的微生物种群进行研究，还可对微生物群落的功能进行深入分析。虽然现在已经 开展的宏蛋白质组学研究很少，但该技术已经初步展示了其强大的功能通过宏蛋白质组 学研究能够把微生物群落组成与其功能联系起来，从而更好的了解土壤微生物群落的生态 功能。土壤胞内蛋白质主要来源于土壤中微生物，因此高效提取土壤胞内蛋白质能够有 效地分析土壤中微生物的种群变化及微生物体内代谢变化。然而，土壤是一个极其复杂的 “黑箱”，存在众多的干扰物质，严重干扰了土壤胞内蛋白质的提取，至今还未有关于土壤胞 内蛋白质提取的有效方法，因此开发一种快速、高效的土壤胞内蛋白质提取的方法对于环 境宏蛋白质组学研究的研究具有极其重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法。本发明的的土壤胞内蛋白质的提取方法，具体步骤如下
(1)土壤胞内蛋白质提取
取0. 8-1. 5g土壤，加入0. 05mol/L,pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液4_6mL，于漩涡振荡器中振 荡2. 5-4小时，15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入0. 05mol/L, pH8. 0柠檬酸钠缓 冲液4-6mL并于漩涡振荡器中振荡10-20min，然后15000rpm离心25min，弃上清液，重复2 次；取沉淀，加入SDS缓冲液4-6mL，于漩涡振荡器中振荡50-80min ；振荡结束后，15000rpm 离心25min，收集上清液，并过0. 45 μ m的微孔滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚 2-3mL,置于漩涡振荡器中振荡25-40min，静置20_50min，然后15000rpm离心25min，取下 层酚相，加入5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、 过夜，然后15000rpm离心25min ；弃上清液，沉淀中加入2_5mL甲醇洗涤，15000rpm离心 25min，去除甲醇上清液，用2-5mL丙酮洗涤沉淀，15000rpm离心25min，去上清液，重复1 2次；取沉淀，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉；
(2)土壤胞内蛋白质分离
取1. 2mg蛋白质干粉，加入300 μ L蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O所述双向电泳的具体步骤为选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘 上水化12-M小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、CN 102093466 A 1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓 冲液I和平衡缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层 为1 分离胶，用0. 8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温 度保持在15-20°C，电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、 脱色，最后用扫描仪扫描。其中所用试剂配制如下
0.05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液的配置方法称取1. 4705g 2水合柠檬酸钠采用 双蒸水溶解并定溶至IOOmL,并用0. lmol/L的NaOH溶液调节pH值为8. 0 ；
SDS凝胶缓冲液的配置方法首先称取0. 121g Tris定容到lmL，加入浓HCL调pH值 到6. 8，其次加入0. 25g SDS，0. 31g 二硫苏糖醇(DTT)，2mL甘油，0. 02g溴酚蓝加水定容至 10ml。本发明采用柠檬酸钠提取液提取，去除土壤胞外蛋白质，采用SDS提取液提取、溶 解土壤胞内蛋白质，经Tris-饱和酚、甲醇-醋酸铵等进一步进行胞内蛋白质的提取，然后 通过双向电泳分离。本发明的显著优点
1、国际上首次提出土壤胞内蛋白质提取方法。2、提取的土壤胞内蛋白质经SDS-PAGE检测后条带清晰。3、提取的土壤胞内蛋白质经双向电泳分离后蛋白质点清晰。
图1为采用本发明方法提取的土壤胞内蛋白质的SDS-PAGE图，其中1表示水稻土 壤，2表示甘蔗土壤，3表示烟草土壤；
图2为采用本发明方法分离的水稻土壤胞内蛋白质的双向电泳图。
具体实施例方式
本发明的的土壤胞内蛋白质的提取方法，具体步骤如下 (1) 土壤蛋白质提取剂的配置
IOOmL的0. lmol/L的NaOH溶液配制方法称取0. 4g NaOH，采用双蒸水溶解并定溶至 100mL。IOOmL的0. 05mol/L的柠檬酸钠缓冲液配置方法称取1. 4705g 2水合柠檬酸钠 采用双蒸水溶解并定溶至IOOmL,并用0. lmol/L的NaOH溶液调节pH值为8. 0。IOOmL的SDS缓冲液配置方法称取1. 2114g Tris，加入40mL的蒸馏水溶解，再加 入1. 25g SDS溶解，再加入0. 3086g的二硫基苏糖醇溶解，定容至IOOmL左右，同时HCl调 节pH至6. 8。IOOmL的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液配置方法称取0. 771g醋酸铵，加入40mL的 甲醇溶解，再用甲醇定溶至100mL。IOmL的SDS凝胶缓冲液配置方法首先称取0. 121g Tris定容到lmL，加入浓HCL 调PH值到6. 8，其次加入0. 25g SDS，0. 31g 二硫苏糖醇(DTT)，2mL甘油，0. 02g溴酚蓝加水 定容至10ml。5mL的土壤蛋白质裂解液配置方法称取0. 76g硫脲、2. Ig尿素、0. 05g 二硫苏糖醇、0.2g 3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)于IOmL离心管中，加双 蒸水溶解并定容至5mL。IOmL的平衡液I配置方法称取0. 12g的Tris溶于670 μ L的双蒸水，HCl调节 ρΗ值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS，0. Ig 二硫苏糖醇(DTT)，加入 0. 001 g的溴酚蓝，双蒸水定容至10mL。IOmL的平衡液II配置方法称取0. 12g的Tris溶于670 μ L的双蒸水，HCl调节 ρΗ值至8. 8，加入7. 21g的尿素，6. 9mL的甘油，0. 4g的SDS, 0. 4g碘乙酰铵，加入0. 001 g 的溴酚蓝，双蒸水定容至10mL。IOOOmL的固定液配置方法量取500 mL甲醇、500mL乙酸充分混勻后即可配得 IOOOmL固定液。500mL的染色液配置方法称取0. 6g的G-250，加入50mL的磷酸，50mL的硫酸铵、 IOOmL的甲醇，蒸馏水定容至500mL。(2 ) 土壤胞内蛋白质提取
称取0. 8-1. 5g 土壤样品于IOmL的离心管中，加入4-6mL柠檬酸钠缓冲液(0. 05mol/L, pH8. 0)于漩涡振荡器中振荡2. 5-4小时；振荡结束后，将样品置于预冷至4°C的离心机中 15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入4_6mL柠檬酸钠缓冲液(0. 05mol/L, pH8. 0) 并于漩涡振荡器中振荡10-20min，然后于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，弃 上清液，重复2次；取沉淀，加入4-6mLSDS缓冲液，于漩涡振荡器中振荡50-80min ；振荡 结束后，于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，收集上清液，并过0. 45 μ m的微 孔滤膜，取滤液添加2-3mL Tris-饱和酚(pH8. 0)，置于漩涡振荡器中振荡25-40min，静置 20-50min，然后置于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，取下层酚相于新的IOmL 离心管中，并加入5倍体积预冷至4°C的甲醇-醋酸铵溶液(0. lmol/L)，置于_20°C条件下 沉淀、过夜；将沉淀后的溶液于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min ；弃上清液，沉淀 中加入甲醇2-5mL洗涤，再将其置于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，去除甲醇 上清液，用2-5mL丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于4°C的离心机中15000rpm离心25min ； 取沉淀，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉。称取0. 5mg蛋白质干粉加入100μ 1 SDS 凝胶缓冲液溶解，取10 μ 1用于SDS-PAGE检测土壤胞内蛋白质提取效果。(3) 土壤胞内蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300 μ L蛋白质裂解液，用于蛋白质双向电泳分离。双向 电泳具体步骤选取Mcm IPG胶条(等电点4-7)，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化 12- 小时，放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小 时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将每根胶条分别置于平衡缓冲液I 和平衡缓冲液II中平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳凝胶底层为12%分 离胶，用0. 8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在 15-20°C,电泳时间为7-9小时。电泳结束后，卸下胶片，先用固定液固定1小时，水洗3次， 每次5分钟，然后用300mL的考马斯亮蓝G-250染色液染色过夜。染色完成，水洗脱色2天， 最后用扫描仪扫描检测蛋白质提取与分离效果。为充分公开本发明的一种有效的土壤胞内蛋白质提取方法，以下结合方法验证和 实施实例加以说明。
实施例1
(1) 土壤蛋白质提取与检测步骤
称取Ig水稻土壤于IOmL的离心管中加入0. 05mol/L柠檬酸钠缓冲液5mL。于漩涡振 荡器中充分振荡3小时。振荡结束后，将离心管置于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心 25min,弃上清液。于离心管中加入5mL柠檬酸钠缓冲液并于漩涡振荡器中振荡lOmin，于 预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，弃上清液，重复2次。于离心管中加入SDS缓 冲液5mL，并将其置于漩涡振荡器中振荡1小时。振荡结束后，取上清液过0.45 μ m的滤膜 并转移至一新的IOmL离心管中，添加2mL Tris-饱和酚(pH8. 0)，置于漩涡振荡器中振荡 30min,静置30min。然后将离心管置于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心25min，取下层 苯酚液体于一新的IOmL离心管中，并加入5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶 液，置于_20°C条件下沉淀过夜。将沉淀后的溶液于预冷至4°C的离心机中15000rpm离心 25min。倒掉上清液，用5ml甲醇洗涤沉淀后，4°C的离心机中15000rpm离心25min，去除甲 醇溶液，5ml丙酮洗涤沉淀2次，每次洗涤后于4°C的离心机中15000rpm离心25min。将沉 淀于超净台中吹干。吹干后的沉淀用蛋白裂解液溶解，采用SDS-PAGE检测土壤胞内蛋白质 提取效果。SDS-PAGE电泳条件凝胶规格为102X84X2. 4mm,分离胶为10%聚丙烯酰胺凝 胶，用1%琼脂糖(电泳缓冲液配置)封闭；电泳槽加入电极缓冲液；15mA恒流进行电泳，室 温，待溴酚蓝离底部0. 5cm即可停止电泳，电泳2小时；电泳槽电极缓冲液配比25mmol/L Tris, 192mmol/L 甘氨酸，0. 1%SDS。如图1所示，采用本发明方法提取不同作物土壤胞内蛋白质结果表明，提取土壤 胞内蛋白质经SDS-PAGE检测后条带清晰，电泳条带多。(2) 土壤蛋白质分离步骤
取1.2mg水稻土壤蛋白质干粉，加入300μ 1蛋白质裂解液，用于蛋白质双向电泳分离。 双向电泳具体步骤选取Mcm IPG胶条(等电点4-7)，加入蛋白质样品后置于水化盘上水 化12小时，放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小 时、8000V，7小时、3000V，10小时；等电聚焦结束后，将每根胶条分别置于平衡缓冲液I和 平衡缓冲液II中平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳凝胶底层为1 分离 胶，用1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15°C，电 泳时间为9小时。电泳结束后，卸下胶片，先用固定液固定1小时，水洗3次，每次5min，然 后用300mL的考马斯亮蓝G-250染色液染色过夜。染色完成，水洗脱色2天，最后用扫描仪 扫描。如图2所示，采用本发明方法提取分离的水稻土壤胞内蛋白质双向电泳结果表明，提 取的土壤胞内蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质点清晰，分离的蛋白质点多。实施例2
(1) 土壤胞内蛋白质提取
取0. Sg甘蔗土壤，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液4mL，于漩涡振荡器中振 荡2. 5小时，15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入0. 05mol/L，pH8. 0柠檬酸钠缓冲 液4mL并于漩涡振荡器中振荡lOmin，然后15000rpm离心25min，弃上清液，重复2次；取沉 淀，加入SDS缓冲液4mL，于漩涡振荡器中振荡50min ；振荡结束后，15000rpm离心25min，收 集上清液，并过0. 45 μ m的微孔滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚2mL，置于漩涡振荡器中振荡25min，静置20min，然后15000rpm离心25min，取下层酚相，加入5倍体积预 冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后15000rpm离心 25min ；弃上清液，沉淀中加入2mL甲醇洗涤，15000rpm离心25min，去除甲醇上清液，用2mL 丙酮洗涤沉淀，15000rpm离心25min，去上清液，重复1 2次；取沉淀，将沉淀于超净台中 吹干，获得蛋白质干粉；
(2) 土壤胞内蛋白质分离
取1. 2mg蛋白质干粉，加入300 μ L蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O所述双向电泳的具体步骤为选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化 盘上水化12小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、 1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，10小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液 I和平衡缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为1 分离胶，用0. 8%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在 15-20°C,电泳时间为7小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用 扫描仪扫描。如图2所示，结果表明，提取的土壤胞内外蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质 点清晰，分离的蛋白质点多。实施例3
(1)土壤胞内蛋白质提取
取1. 5g烟草土壤，加入0. 05mol/L, pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液6mL，于漩涡振荡器中振 荡4小时，15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入0. 05mol/L，pH8. 0柠檬酸钠缓冲液 4-6mL并于漩涡振荡器中振荡10-20min，然后15000rpm离心25min，弃上清液，重复2次；取 沉淀，加入SDS缓冲液6mL，于漩涡振荡器中振荡80min ；振荡结束后，15000rpm离心25min， 收集上清液，并过0. 45 μ m的微孔滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚3mL，置于漩 涡振荡器中振荡40min，静置50min，然后15000rpm离心25min，取下层酚相，加入5倍体积 预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过夜，然后15000rpm离 心25min ；弃上清液，沉淀中加入5mL甲醇洗涤，15000rpm离心25min，去除甲醇上清液，用 5mL丙酮洗涤沉淀，15000rpm离心25min，去上清液，重复1 2次；取沉淀，将沉淀于超净 台中吹干，获得蛋白质干粉；
(2)土壤胞内蛋白质分离
取1.2mg蛋白质干粉，加入300 μ L蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分
1 O所述双向电泳的具体步骤为选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化 盘上水化M小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、 1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲 液I和平衡缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为 1 分离胶，用1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持 在15-20°C，电泳时间为9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后 用扫描仪扫描。如图2所示，结果表明，提取的土壤胞内蛋白质分离效果良好，土壤蛋白质 点清晰，分离的蛋白质点多。
权利要求
1.一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下(1)土壤胞内蛋白质提取取0. 8-1. 5g土壤，加入0. 05mol/L,pH8. 0的柠檬酸钠缓冲液4_6mL，于漩涡振荡器中振 荡2. 5-4小时，15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入0. 05mol/L, pH8. 0柠檬酸钠缓 冲液4-6mL并于漩涡振荡器中振荡10-20min，然后15000rpm离心25min，弃上清液，重复2 次；取沉淀，加入SDS缓冲液4-6mL，于漩涡振荡器中振荡50-80min ；振荡结束后，15000rpm 离心25min，收集上清液，并过0. 45 μ m的微孔滤膜，取滤液添加pH为8. 0的Tris-饱和酚 2-3mL,置于漩涡振荡器中振荡25-40min，静置20_50min，然后15000rpm离心25min，取下层 酚相，加入5倍体积预冷至4°C的0. lmol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于_20°C条件下沉淀、过 夜，然后15000rpm离心25min ；弃上清液，沉淀中加入甲醇洗涤，15000rpm离心25min，去除 甲醇上清液，用丙酮洗涤沉淀，15000rpm离心25min，去上清液，重复1 2次；取沉淀，将沉 淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉；(2)土壤胞内蛋白质分离取1. 2mg蛋白质干粉，加入300 μ L蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分1 O
2.根据权利要求1所述的一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于步骤(2) 所述双向电泳的具体步骤为选取Mcm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化 12-24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6 小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液I和 平衡缓冲液II中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为1 分 离胶，用0. 8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在 15-20°C,电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后 用扫描仪扫描。
3.根据权利要求1所述的一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于 柠檬酸钠缓冲液的配置方法称取1. 4705g 2水合柠檬酸钠采用双蒸水溶解并定溶至IOOmL,并用0. lmol/L的NaOH溶液调节pH值为8. 0 ；SDS凝胶缓冲液的配置方法首先称取0. 121g Tris定容到lmL，加入浓HCL调pH值到 6. 8，其次加入0. 25g SDS, 0. 31g 二硫苏糖醇，2mL甘油，0. 02g溴酚蓝加水定容至10ml。
全文摘要
本发明提供了一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，该方法采用柠檬酸钠提取液提取去除土壤胞外蛋白质，采用SDS提取液提取、溶解土壤胞内蛋白质，经Tris-饱和酚、甲醇-醋酸铵等进一步进行胞内蛋白质的提取，然后通过双向电泳分离。提取的土壤胞内蛋白质经SDS-PAGE检测后条带、蛋白质点清晰，是国际上首次提出的土壤胞内蛋白质的提取分离方法。
文档编号C07K1/36GK102093466SQ20101058516
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者何海斌, 俞振明, 吴林坤, 张志兴, 林文雄, 王海斌 申请人:福建农林大学