专利名称：细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白的用途，特别是涉及一种细胞因子-超抗原融合蛋白在 制备抗癌药物的应用。
背景技术：
表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)和血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelial cell growth factor，VEGF)等的受体在各种肿瘤组织中大量 表达，例如在肠黏膜肿瘤中的EGF受体比正常组织高出300倍((Gastroenterology，98， 961-967，1990)。所以，异常高表达的EGF受体和VEGF受体成为一个引人注目的肿瘤治疗 靴点(Ann Oncol, 17Suppl 7 :viil09-114, 2006 ；Clin Cancer Res，12，5018-5022，2006)。表皮生长因子连接到一种毒素蛋白或RNA水解酶上可选择性杀伤高表达EGF受体 的肿瘤细胞(Clin Cancer Res, 11,329-334,2005 ；Protein Eng, 11,1285-1292,1998), H 样血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)也能与毒 素形成融合蛋白质来抑制肿瘤(Proc Natl Acad Sci USA，99，7866-7871，2002)。这里的 EGF-毒素或VEGF-毒素的融合蛋白是利用EGF或VEGF与肿瘤细胞上的EGF受体(EGFR)或 VEGF受体(VEGFR)相互作用而将融合蛋白定位到肿瘤细胞上，再通过融合蛋白中的毒素蛋 白来直接杀伤肿瘤细胞。但这种方式不是依靠免疫系统例如淋巴细胞等攻击肿瘤。肿瘤细胞是由正常细胞转变而来的，肿瘤细胞的抗原是自身抗原，所以肿瘤细胞 能够逃避免疫系统的监视。人们一直在寻找新的抗肿瘤方法来提高肿瘤病人的免疫力，特 别是针对肿瘤细胞的特异性免疫力。因此，本领域迫切需要一种特别针对肿瘤细胞的强有 力的新的抗肿瘤药物用于治疗目的。中国专利申请号2003101098 . 7“一种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其 生产方法”公开了一种构建细胞因子和超抗原的融合蛋白的方法以及这种融合蛋白质在大 肠杆菌中表达和纯化方法。中国专利申请号201010118438. 1“细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药 物的应用”公开了细胞因子-超抗原融合蛋白可以抑制小鼠肉瘤肿瘤Sarcoma 180(S180)。上面两个专利所使用的融合蛋白中的超抗原是金黄色葡萄球菌肠毒素 A(Staphylococcal-enterotoxin A, SEA)，并且在基因序列中显示第227位置上有一个 将Asp改变为Ala的点突变。而专利文献中的EGF和VEGF是根据公开文献(EGF基因 文献=NucleicAcids Res, 10，4467-4482，1982 ；Nature, 303，722-725，1983 ；VEGF 基因文 献=Science,246,1306-1309，1989 ；Science,246，1309-1312，1989 ;J Biol Chem,266， 11947-11954,1991)制备的，属于人来源的EGF和VEGF基因，从而构建成EGF-SEA和 VEGF-SEA两种超抗原融合蛋白。SEA不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整蛋白质形式直接与细胞膜上的主 要组织相容性抗原-II (Major histocompatibility complex class, MHC-II)类分子结合 形成复合物，识别T cell receptor(TCR)的νβ片段，激活比普通抗原多得多T细胞(包括CD4+，CD8+)，并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。瑞典的一个 小组的抗体超抗原融合蛋白对于B16黑色素瘤的肺转移进行了很多研究(Proc Natl Acad Sci USA，92，9791-9795，1995 ；Eur Surg Res，35，457-463，2003)。为 了减轻 SEA 的副作用， 在它的第227位置上引入了一个点突变，将Asp改变为Ala (Proc Natl Acad Sci USA, 94, 2489-2494，1997)。中国专利申请号201010118438. 1 “细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体 瘤药物的应用”公开了 EGF-SEA和VEGF-SEA可诱导动物体内由T细胞分泌的细胞因子 例如月中瘤坏死因子一a (Tumor necrosis factor, TNF-α )、干扰素一γ (Interferon—γ , IFN- γ )和白细胞介素-2(Interleukin-2，IL_2)，还可以诱导T细胞分泌分泌穿孔素和颗 粒酶，细胞因子TNF-α和IFN-Y可以诱导肿瘤细胞凋亡，而穿孔素和颗粒酶可直接杀伤肿 瘤细胞(Immunol Today 16，194-201，1995 ；Immunol Today 16,202-206,1995 ；Cell Mol Immunol，6，15-25，2009)，专利的融合蛋白中的超抗原SEA含有D227A的点突变。这些由T 细胞产生的杀伤肿瘤细胞的作用被称是细胞毒作用(Cytotoxicity)。所以这里所描述的EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白的作用方式与抗体是不同的， 而且与很复杂的抗体人源化的基因工程操作以及高成本的动物细胞培养体系来比较， EGF-SEA和VEGF-SEA是很方便的抗癌手段。根据大量文献报道，大多数实体肿瘤的癌细胞有大量EGFR和VEGFR表达(Nat Rev ClinOncol，6，569-579，2009)，特别是乳腺癌(Oncologist,14，378-390，2009 ； Breast Cancer，14，132-149，2007)、结肠癌(Cl in Transl Oncol,10,6-13,2008 ； Adv Exp Med Biol，587，251-275，2006)、胃癌(Jpn J Clin Oncol，39，543-551，2009 ； J Cancer Res Clin Oncol,135,855-866, 2009 ；Cancer Treat Rev,30，451-459，2004)、 肝癌(Histol Histopathol，24，493-502，2009 ;H印atology，48，1312-1327,2008 ;Curr Pharm Des，13，3301-3304，2007)和肺癌(Clin Lung Cancer, 11，82-90，2010 ；Expert Opin Pharmacother, 11,2363-2389,2010 ；Curr Med Chem，14，3157-3165，2007)等，这些肿瘤上 的EGFR和VEGFR就成为抗癌药物的靶点。因为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌肿瘤细胞表达大量EGFR和VEGFR，就可用 EGF-SEA和VEGF-SEA诱导和刺激T淋巴细胞来杀伤乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种细胞因子-超抗原融合蛋白在 制备抗癌药物的应用。本发明的技术方案概述如下细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因 子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶 向性地定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4+或CD8+特征。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介 素_2、干扰素-Y和肿瘤坏死因子-α。所述癌为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌或肺癌。
所述乳腺癌为人乳腺癌。所述结肠癌为人结肠癌。所述胃癌为人胃癌。所述肝癌为人肝癌。所述肺癌为人肺癌。本发明的优点EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白虽然与EGF-毒素或VEGF-毒素融合蛋白同样利 用EGF或VEGF与EGF受体或VEGF受体相互作用而达到肿瘤细胞定位目的，但EGF-SEA和 VEGF-SEA是利用T淋巴细胞来杀伤肿瘤的，这与EGF-毒素或VEGF-毒素融合蛋白的抑制肿 瘤的作用原理不同。细胞因子-超抗原融合蛋白实际上是代替现有技术的抗体的，也具有 靶向作用，是区别于抗体的新的可期待的抗肿瘤药物，实验证明，它可以制备抗人乳腺癌、 人结肠癌、人胃癌、人肝癌和人肺癌肿瘤细胞的药物。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员和激活T淋巴细胞，所述T淋巴细胞具 有CD4+或CD8+特征，并将T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围。所述细胞因子-超抗原融合蛋白诱导T细胞分泌白细胞介素_2、干扰素-Y和肿 瘤坏死因子-α。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人乳腺癌肿瘤细胞周围并 诱导和激活T淋巴细胞杀伤人乳腺癌肿瘤细胞。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人结肠癌肿瘤细胞周围并 诱导和激活T淋巴细胞杀伤人结肠癌肿瘤细胞。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人胃癌肿瘤细胞周围并诱 导和激活T淋巴细胞杀伤人胃癌肿瘤细胞。 所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人肝癌肿瘤细胞周围并诱 导和激活T淋巴细胞杀伤人肝癌肿瘤细胞。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能将T淋巴细胞集结到人肺癌肿瘤细胞周围并诱 导和激活T淋巴细胞杀伤人肺癌肿瘤细胞。
图1为被LSS670蛋白染料标记的EGF-SEA和VEGF-SEA分别与T淋巴细胞结合的 流式细胞实验的细胞分布。(图中1-1为不加蛋白，1-2为EGF-SEA，1-3为VEGF-SEA)图2为SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA诱导T淋巴细胞分泌细胞因子IL_2、IFN_ γ和 TNF- α 0图3为被LSS670蛋白染料标记的EGF-SEA和VEGF-SEA分别与MCF-7乳腺癌肿 瘤细胞结合的流式细胞实验的细胞分布。(图中3-1为不加蛋白，3-2为EGF-SEA，3-3为 VEGF-SEA)图4为根据流式细胞实验所得到的MCF-7乳腺癌、Caco-2结肠癌、NCI-N87胃癌、 H印G2肝癌和A549肺癌人肿瘤细胞分别与被标记的EGF-SEA或VEGF-SEA结合的百分比数。图5为在不加蛋白、分别加SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA情况下，肿瘤细胞周围的T 细胞数量分布。
图6为显微镜观察MCF-7肿瘤细胞。(图中6_1为EGF-SEA组，6-2为VEGF-SEA 组)图7为显微镜观察Caco-2肿瘤细胞。(图中7_1为不加蛋白的对照组，7_2为SEA 组，7-3 为 EGF-SEA 组，7-4 为 VEGF-SEA 组)图8为T细胞对5种肿瘤细胞杀伤的细胞毒作用。图9为单克隆MCF-7肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中9_1和9-2为 表达EGF-SEA，9-3和9_4表达VEGF-SEA，9-1和9_3为普通显微镜观察，9_2和9_4为荧光 显微镜观察)图10为单克隆Caco-2肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中10-1和10-2 为表达EGF-SEA，10-3和10_4表达VEGF-SEA，10-1和10_3为普通显微镜观察，10-2和10_4 为荧光显微镜观察)图11为单克隆NCI-N87肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中11-1和11-2 为表达EGF-SEA，11-3和11-4表达VEGF-SEA，11-1和11-3为普通显微镜观察，11-2和11-4 为荧光显微镜观察)图12为单克隆Hep G2肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中12-1和12-2 为表达EGF-SEA，12-3和12-4表达VEGF-SEA，12-1和12-3为普通显微镜观察，12-2和12-4 为荧光显微镜观察)图13为单克隆A549肿瘤细胞表达EGF-SEA和VEGF-SEA。(图中13_1和13-2为 表达EGF-SEA，13-3和13-4表达VEGF-SEA，13-1和13-3为普通显微镜观察，13-2和13-4 为荧光显微镜观察)图14为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆MCF-7肿瘤细胞。(图中 14-1和14-2为表达EGF-SEA组，14-3和14-4为表达VEGF-SEA组，14-1和14-3为普通显 微镜观察，14-2和14-4为荧光显微镜观察)图15为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆Caco_2肿瘤细胞。(图 中15-1和15-2为表达EGF-SEA组，15-3和15-4为表达VEGF-SEA组，15-1和15-3为普 通显微镜观察，15-2和15-4为荧光显微镜观察)图16为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆NCI-N87肿瘤细胞。(图 中16-1和16-2为表达EGF-SEA组，16-3和16-4为表达VEGF-SEA组，16-1和16-3为普 通显微镜观察，16-2和16-4为荧光显微镜观察)图17为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆H印G2肿瘤细胞。(图 中17-1和17-2为表达EGF-SEA组，17-3和17-4为表达VEGF-SEA组，17-1和17-3为普 通显微镜观察，17-2和17-4为荧光显微镜观察)图18为T细胞攻击表达EGF-SEA或VEGF-SEA的单克隆A549肿瘤细胞。(图中 18-1和18-2为表达EGF-SEA组，18-3和18-4为表达VEGF-SEA组，18-1和18-3为普通显 微镜观察，18-2和18-4为荧光显微镜观察)
具体实施例方式本发明利用细胞因子-超抗原融合蛋白质，其中的促进癌细胞生长的细胞因子可 以将融合蛋白质定位到肿瘤细胞上，而超抗原则在肿瘤细胞周围引起抗癌的免疫反应，即超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-d印endent-cellular-cytotoxicit y，SDCC)。利用此方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到肿瘤细胞上并在肿瘤 细胞周围引起抗癌的细胞毒免疫反应。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1融合蛋白诱导T淋巴细胞活性外周血细胞购自天津血液中心以及从健康人获得，用Ficoll密度离心和尼龙 毛柱方法法取得T淋巴细胞(J Clin hvest^l，1490-1498，1993)，以后再用利用试剂 盒 Human CD4+T Cell Enrichment Column 禾口 Human CD8+T Cell Enrichment Column(R&D Systems公司)分离纯化⑶4和⑶8阳性T淋巴细胞，将⑶4和⑶8细胞分别计数并等量混
口 O利用已申请专利(中国专利申请号200310109829. 7“一种可用以抗癌治疗的超抗 原融合蛋白质及其生产方法”和中国专利申请号201010118438. 1 “细胞因子-超抗原融合 蛋白在制备抗实体瘤药物的应用”)中的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA来诱导这些T细胞分泌 细胞因子IL-2、IFN-y和TNF-α。这里的超抗原SEA含有D227A的点突变，融合蛋白中的 EGF和VEGF都是人的EGF和VEGF的基因，而且蛋白都经过变复性以及纯化等操作。为了分析EGF-SEA和VEGF-SEA与T细胞相互作用，用流式细胞方法。按照LSS670 蛋白染料(Kodak公司)说明书的方法将染料分别标记到EGF-SEA和VEGF-SEA，1500rpm 离心收集肿瘤细胞，PBS重悬浮。⑶4和⑶8细胞等量混合T细胞Qx IO6)分别用50pmol 的LSS670染料标记的EGF-SEA或VEGF-SEA蛋白4°C孵育30分钟，然后用冷PBS洗3次。 通过流式细胞仪BD FACS Calibur分析EGF-SEA和VEGF-SEA结合T细胞能力。图1表明 90-95%以上的T细胞能与被标记的EGF-SEA(图1_2)或VEGF_SEA(图1_3)结合，而图1_1 是不加蛋白仅仅是T细胞的对照样品。同时对于SEA进行了同样的操作，发现90%以上T 细胞也能与SEA结合。所以EGF-SEA和VEGF-SEA与SEA —样有着同样的与T细胞相互作 用的功能。用DMEM培养基培养纯化后的T细胞，然后分别加入SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA 蛋白，用ELISA试剂盒(R&D Systems公司)检测培养基中由T细胞受到SEA、EGF-SEA和 VEGF-SEA诱导后分泌的细胞因子IL-2、IFN- γ和TNF- α的量。图2表明EGF-SEA和 VEGF-SEA能和SEA —样诱导和刺激T细胞分泌细胞因子，也就是能够诱导和激活T淋巴细 胞。上面的实验说明了 EGF-SEA和VEGF-SEA通过融合蛋白中的超抗原SEA来诱导和 激活T淋巴细胞，促使被活化的T细胞分泌各种细胞因子。实施例2融合蛋白与人肿瘤细胞相互作用所有人肿瘤细胞株从美国ATCC(American Type Culture Collection)机构和中 国科学院典型培养物保藏委员会细胞库等细胞库购得。用被LSS670染料标记的EGF-SEA 和VEGF-SEA来分析融合蛋白与肿瘤细胞的相互作用，即进行流式细胞实验分析，各种肿瘤 细胞(hlO6)分别用50pmol的LSS670染料标记的EGF-SEA或VEGF-SEA蛋白4°C孵育30 分钟，然后用冷PBS洗3次，通过流式细胞仪分析EGF-SEA和VEGF-SEA结合肿瘤细胞的能 力。图3是被标记融合蛋白分别与MCF-7人乳腺癌肿瘤细胞进行流式细胞实验的细胞 分布，显示85%以上的肿瘤细胞能够与标记的EGF-SEA(图3_2)或VEGF_SEA(图3_3)相结合，而图3-1是不加蛋白仅是MCF-7肿瘤细胞的对照样品。图4是根据流式细胞实验所得的 MCF-7人乳腺癌、Caco-2人结肠癌、NCI-N87人胃癌、Hep G2人肝癌和A549人肺癌的肿瘤 细胞分别与标记EGF-SEA或VEGF-SEA结合的百分比数，在只有标记蛋白存在的情况下，显 示80%以上肿瘤细胞与标记融合蛋白结合，而在等量标记蛋白和未标记蛋白一起孵育即有 竞争性结合的情况下，肿瘤细胞与标记融合蛋白结合数下降到50%左右，这表明EGF-SEA 和VEGF-SEA不仅能与这些人肿瘤细胞相互作用，而且这些肿瘤细胞表面上有大量EGFR和 VEGFR存在。实施例3融合蛋白诱导T淋巴细胞集结在肿瘤细胞周围并杀伤肿瘤细胞在6孔板上用DMEM培养基培养人肿瘤来源的MCF-7、Caco-2、NCI-N87、H印G2 和A549肿瘤细胞，浓度为2xl05个/孔，然后加入T细胞，再分别加入SEA、EGF-SEA和 VEGF-SEA。细胞毒作用或癌细胞杀伤效果采用MTT (Methabenzthiazuron)法测定 (Immunology，82，117-125，1994)，细胞生长抑制用 100-[ (Atest-Ab) / (Ac-Ab) ] χ 100 公式计 算，Atest指的是有T细胞加入下的癌细胞生长，Ab指的是孔中只有培养基，Ac指的是癌细胞 生长。以后每种癌细胞杀伤实验的次数都在20以上。实验一、在不同效靶比条件下杀伤肿瘤细胞效靶比是指T细胞与肿瘤细胞数量之比，在5 UlO 1和20 1的情况下，分 别加入IOpmol浓度的SEA、EGF-SEA和VEGF-SEA，结果在表1，随着T细胞数量的增加，肿瘤 细胞杀伤效果也增加，在T细胞与肿瘤细胞20 1条件下，经80小时培养后测定，EGF-SEA 和VEGF-SEA杀伤率或细胞毒作用达到60 )以上(表1)，而SEA的效果要比EGF-SEA和 VEGF-SEA低。另外在不加蛋白仅加T细胞的情况下，细胞毒作用发现在10 )以下。表1为T细胞与肿瘤细胞不同数量之比的共培养，在SEA、EGF-SEA或VEGF-SEA诱 导下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用。
权利要求
1.细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征是所述细胞因子为表皮 生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。
2.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶向性地 定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4+或CD8+特征。
3.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素_2、干扰 素-Y和肿瘤坏死因子-α。
4.根据权利要求1所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述癌为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌或肺癌。
5.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述乳腺癌为人乳腺癌。
6.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述结肠癌为人结肠癌。
7.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述胃癌为人胃癌。
8.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述肝癌为人肝癌。
9.根据权利要求4所述的细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，其特征 是所述肺癌为人肺癌。
全文摘要
本发明公开了细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因子或血管内皮细胞生长因子，所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素A的超抗原。所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够动员人T淋巴细胞，并将所述T淋巴细胞靶向性地定位到肿瘤细胞周围，所述人T淋巴细胞具有CD4+或CD8+特征。能诱导人T淋巴细胞分泌细胞因子白细胞介素-2、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。所述EGF-SEA和VEGF-SEA融合蛋白能有效抑制乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌。
文档编号C07K19/00GK102114239SQ201010585818
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者孙嘉琳 申请人:孙嘉琳