专利名称：效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法
效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法相关申请本专利申请要求2009年1月23日提交的标题为“STABILUED Fc POLYPEPTIDES WITH REDUCED EFFECTOR FUNCTION AND METHODS OF USE” 的美国临时专利申请序列号 61/146,950的权益。以上提及的临时专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
背景技术：
获得性免疫应答是身体保护自身免受外来生物侵害身体引起感染或疾病的机制。 一种机制基于生成的或施用于宿主的抗体通过其可变区结合抗原的能力。一旦抗体结合了抗原，抗原就成为破坏的靶标，通常至少部分通过抗体的恒定区或Fc区介导。存在若干经抗体的Fc区介导的效应子功能或活性。一种效应子功能是在称为补体依赖性细胞毒作用(CDC)的过程中结合可协助溶解靶抗原(例如，细胞病原体)的补体蛋白的能力。Fc区的另一效应活性为结合免疫细胞表面的Fc受体(例如，FcyRS)或通常所说的效应细胞，该效应细胞具有触发其它免疫作用的能力。这些免疫作用(例如，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP))通过(例如)释放免疫活化剂和调节抗体生成、胞吞作用、吞噬作用以及细胞杀伤在去除病原体/抗原中起作用。在一些临床应用中，这些应答对于抗体的功效至关重要，而在其它情况下这些应答引起有害的副作用。效应介导的副作用的一个实例为释放引起急性发热反应的炎症性细胞因子。另一个实例是长期缺失抗原携带细胞。可通过使用缺少Fc区的抗体片段(例如，Fab、F(ab' )2或单链Fv(scFv))避免抗体的效应子功能。然而，由于通过肾脏快速清除，这些片段的半衰期缩短；在Fab和scFv 片段仅具有一个抗原结合位点而不是两个由于结合亲合力可能损害任何优点的抗原结合位点的情况下；并且在制造中可能存在挑战。替代性方法旨在降低全长抗体的效应子功能，同时保持Fc区其它有价值的属性 (例如，半衰期延长和异质二聚体化)。降低效应子功能的一种方法是通过去除与Fc区中的特定残基连接的糖生成通常所说的无糖基化抗体。例如，可通过删除或改变与糖连接的残基、通过酶促去除糖、在有糖基化抑制剂存在下培养的细胞中生成抗体，或通过在不能使蛋白质糖基化的细胞(例如，细菌宿主细胞)中表达抗体而生成无糖基化抗体。另一种方法是采用来自IgG4而非IgGl抗体的Fc区。众所周知，IgG4抗体特征在于具有比IgGl更低的补体活化和抗体依赖性细胞毒作用水平。尽管这些替代性方法有优点，但现已确认从抗体的Fc区去除低聚糖对其构象和稳定性有明显的不利影响。另外，由于IgG4的CH3域与IgGl的CH3域相比缺乏稳定性，所以IgG4抗体的稳定性通常较低。就一切情况而论，抗体稳定性损失或降低可呈现对抗体药物开发有不利影响的工艺开发挑战。因此，需要改良抗体和其它效应子功能改变或降低、稳定性提高的含Fc的多肽和制备这些分子的方法。发明概述本发明通过提供用于提高Fc区稳定性的改进方法解决了现有技术“无效应子”抗体，实际上为任何含Fc的“无效应子”蛋白的问题。例如，本发明提供了稳定性设计的Fc多肽，例如，稳定的IgG抗体或其它含Fc的结合分子，其包含在多肽的Fc区中的稳定氨基酸。 在一个实施方案中，本发明提供一种在亲本Fc多肽的Fc区中的特定氨基酸残基处弓I入导致Fc区稳定性提高的突变的方法。优选地，稳定的Fc多肽的效应子功能改变或降低(与不包含稳定氨基酸的多肽相比)，并且与亲本Fc多肽相比表现出提高的稳定性。因此，本发明具有包括但不限于以下的若干优点-提供包含稳定的无糖基化Fc区的稳定的无糖基化Fc多肽，例如，稳定的融合蛋白或无糖基化IgG抗体，由于其效应子功能降低而适于用作治疗剂；-提供包含源自IgG4抗体的Fc区的稳定的Fc多肽，例如，稳定的糖基化或无糖基化融合蛋白或IgG4抗体，由于其效应子功能降低为适于用作治疗剂；-对多肽进行最低限度的改变(例如，通过为不稳定的亲本多肽引入电荷或表达编码稳定的Fc多肽的核酸分子)生成稳定的Fc多肽的有效方法；-在避免任何免疫原性和/或效应子功能升高的同时提高Fc多肽稳定性的方法；-提高Fc多肽的可量测性、生产和/或长期稳定性的方法；-用本发明的稳定的Fc多肽治疗需要治疗的受试者的方法。一方面，本发明涉及包含嵌合Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含至少一个源自人IgG4抗体的恒定域和至少一个源自人IgGl抗体的恒定域。在一个实施方案中，Fc区为糖基化Fc区。在一个实施方案中，Fc区为无糖基化Fc区。在一个实施方案中，Fc区为包含位于Fc区的位置四7的谷氨酰胺(Q)和位置299 的丙氨酸(A)(欧盟编号规定)的无糖基化Fc区。另一方面，本发明涉及包含无糖基化Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于所述Fc区的至少一个Fc部分中一个或多个氨基酸位置的一个或多个稳定Fc氨基酸，其中所述氨基酸位置选自297、299、307、309、399、409和427 (欧盟编号规定)。在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自 IgGl同种型的IgG抗体的CH3域。在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的铰链、CHl和CH2 域和来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域，并且其中抗体包含位于氨基酸位置2 的脯氨酸(欧盟编号)。另一方面，本发明涉及包含来自IgG4抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自240FJ62LJ64T、266FJ97Q、299AJ99K、307P、309K、 309M、309P、323F、399S和427F(欧盟编号规定)氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。在一个实施方案中，稳定多肽包含位于氨基酸位置四7的Gin。一方面，本发明涉及包含来自IgGl抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自和(欧盟编号规定)氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含位于氨基酸位置四9的赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含位于氨基酸位置四9的赖氨酸和位于氨基酸位置四7的天冬氨酸。
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在一个实施方案中，Fc区为无糖基化Fc区。在一个实施方案中，IgG抗体为人源抗体。在一个实施方案中，相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，稳定多肽的解链温度 (Tm)升高至少1°C。在一个实施方案中，稳定的Fc多肽的解链温度(Tm)升高约1°C或更多、约2°C或更多、约3°C或更多、约4°C或更多、约5°C或更多、约6°C或更多、约7°C或更多、约8°C或更多、约9°C或更多、约10°C或更多、约15°C或更多以及约20°C或更多。在一个实施方案中，在中性pH(约6. 5至约7. 5)下解链温度(Tm)升高。在另一个实施方案中，在约6. 5或更低、约6. 0或更低、约5. 5或更低、约5. 0或更低、约4. 5或更低和约4. 0或更低的酸性pH下，解链温度(Tm)升高。在一个实施方案中，相对于缺乏稳定突变的亲本多肽，稳定多肽以更高的产量表达。在另一个实施方案中，在细胞培养物中，稳定的Fc多肽以约5mg/L或更高、约 10mg/L或更高、约15mg/L或更高、约20mg/L或更高的产量表达。在一个实施方案中，相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，稳定多肽的浊度降低。在另一个实施方案中，浊度降低选自以下各项的倍数约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约6倍或更高、约7倍或更高、约8倍或更高、约9倍或更高、约10倍或更高、约15倍或更高、约50倍或更高和约100倍或更高。在另一个实施方案中，与缺乏稳定突变的亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的效应子功能降低。在一个实施方案中，降低的效应子功能为降低的ADCC活性。在另一个实施方案中，降低的效应子功能为降低的与选自Fc γ RI、Fc γ RII和 Fc γ RIII的Fc受体(FcR)的结合。在一个实施方案中，效应子功能降低选自以下各项的倍数约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。在一个实施方案中，与亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的半衰期增加。在另一个实施方案中，半衰期增加归因于与新生儿受体(Fcfoi)的结合增强。在一个实施方案中，半衰期增加选自以下各项的倍数约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。在一个实施方案中，Fc区为二聚Fc区。在另一个实施方案中，Fc区为单链Fc区。在一个实施方案中，Fc区的所有Fc部分均被无糖基化。 在一个实施方案中，无糖基化Fc区包含位于Fc区的位置299 (欧盟编号规定)的取代。 在另一个实施方案中，无糖基化Fc区由于其在细菌宿主细胞中生成而被无糖基化。在一个实施方案中，无糖基化Fc区由于通过化学或酶促方法的去糖基化作用而被无糖基化。在一个实施方案中，无糖基化Fc区包含嵌合铰链域。
在一个实施方案中，嵌合铰链域包含在氨基酸位置228(欧盟编号规定)用脯氨酸残基进行的取代。在一个实施方案中，稳定氨基酸独立地选自(i)位于位置四7的不带电氨基酸、 (ii)位于位置299带正电的氨基酸、(iii)位于位置307的极性氨基酸、(iv)位于位置309 带正电的氨基酸或极性氨基酸、(ν)位于位置399的极性氨基酸、(vi)位于位置409带正电的氨基酸或极性氨基酸和(vii)位于位置427的极性氨基酸。在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于氨基酸位置四7(欧盟编号)的谷氨酰胺。在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置四9的赖氨酸(K)或酪氨酸 ⑴。在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置307的脯氨酸(P)或甲硫氨酸(M)。在一个实施方案中，至少一个稳定氨基酸为位于位置309的脯氨酸(P)、甲硫氨酸 (M)或赖氨酸(K)。在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置399的丝氨酸⑶。
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置240的苯丙氨丨f (F)0
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置262的亮氨酸(L)。
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置264的苏氨酸⑴。
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置266的苯丙氨丨f (F)0
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置323的苯丙氨丨f (F)0
在--个实施方案中，至少--个稳定突变为位于位置409的赖氨酸⑷或甲硫氨
(M)。在一个实施方案中，至少一个稳定突变为位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置299的丙氨酸㈧或赖氨酸⑷和(ii)位于位置266的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置四9的丙氨酸㈧或赖氨酸⑷和(ii)位于位置307的脯氨酸⑵。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置四9的赖氨酸(K)和(ii)位于位置399的丝氨酸(S)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置四9的赖氨酸(K)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置四9的丙氨酸(A)或赖氨酸(K)、(ii)位于位置沈2的亮氨酸(L)和 (iii)位于位置264的苏氨酸(T)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置四9的赖氨酸⑷、(ii)位于位置307的脯氨酸⑵和(iii)位于位置399的丝氨酸⑶。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置四9的赖氨酸⑷、(ii)位于位置309的赖氨酸⑷和(iii)位于位置399的丝氨酸⑶。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置四9的赖氨酸⑷、(ii)位于位置348的苯丙氨酸(F)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置四9的赖氨酸(K)、(ii)位于位置399的丝氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含四个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置四9的丙氨酸㈧或赖氨酸⑷、(ii)位于位置沈2的亮氨酸(L)、 (iii)位于位置沈4的苏氨酸(T)和(iv)位于位置沈6的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置276的丝氨酸(S)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置观6的苏氨酸(T)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置323的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括⑴位于位置307的脯氨酸⑵和(ii)位于位置309的脯氨酸⑵、赖氨酸⑷或甲硫氨酸(M)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置399的丝氨酸(S)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)和(ii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置276的丝氨酸(S)和(iii)位于位置观6的苏氨酸⑴。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P) ； (ii)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(iii)位于位置399的丝氨酸(S)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置307的脯氨酸(P)、(ii)位于位置399的丝氨酸(S)和(iii)位于位置427的苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含三个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置308 的异亮氨酸(I)。在一个实施方案中，本发明的稳定多肽包含两个或更多个稳定突变，所述稳定突变包括(i)位于位置309的脯氨酸(P)、赖氨酸(K)或甲硫氨酸(M)和(ii)位于位置399 的丝氨酸⑶。在一个实施方案中，Fc区可操作地连接至结合位点。
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在一个实施方案中，结合位点选自抗原结合位点、受体的配体结合部分或配体的受体结合部分。在一个实施方案中，结合位点源自选自以下各项的修饰抗体SCFv、Fab、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体和Dab。在一个实施方案中，稳定多肽为稳定的全长抗体。在一个实施方案中，抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体和人源化抗体。在一个实施方案中，至少一个结合位点包含六个⑶R，重链可变区和轻链可变区或来自选自以下的抗体的抗原结合位点Rituximab、Daclizumab、Galiximab、CB6、Li33、5c8、 CBElU BDA8、14A2、B3F6、2B8、Lyml、Lym2、LL2、Her2、5E8、B1、MB 1、BH3、B4、B72. 3、CC49 和 5E10。在一个实施方案中，稳定的全长抗体与常规或稳定的scFv分子融合。在一个实施方案中，稳定多肽为稳定的免疫粘附素。在一个实施方案中，结合位点覆盖在稳定多肽的Fc区表面。在一个实施方案中，结合位点源自非免疫球蛋白结合分子。在一个实施方案中，非免疫球蛋白结合分子选自adnectin、亲合体(affibody)、 DARPin 禾口 anticalin。在一个实施方案中，所述受体的配体结合部分源自选自以下各项的受体免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)受体家族的受体和细胞因子受体超家族。在一个实施方案中，所述配体的受体结合部分源自抑制性配体。在一个实施方案中，配体的所述受体结合部分源自活化配体。在一个实施方案中，所述配体结合选自以下各项的受体免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCI )超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族。在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的稳定多肽的组合物及药学上可接受的载体。一方面，本发明涉及一种稳定包含无糖基化嵌合Fc区或其部分的亲本Fc多肽的方法，所述方法包括用稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸从而生成相对于所述起始多肽稳定性增强的稳定Fc多肽，其中对选自位于四7、四9、307、309、399、 409和427(欧盟编号规定)的氨基酸位置的Fc部分的氨基酸进行取代。在一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自 IgGl同种型的IgG抗体的CH3域。在一个实施方案中，存在于稳定Fc多肽的氨基酸的氨基酸位置选自^7Q、299A、 299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M 和 427F。在一个实施方案中，稳定Fc多肽包含位于位置四7(欧盟编号)的谷氨酰胺。另一方面，本发明涉及提高包含Fc区或其部分的亲本Fc多肽的产量的方法，所述方法包括用一个或多个稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸以生成相对于所述亲本多肽产量提高的稳定的Fc多肽，其中稳定氨基酸独立地选自M0F、262L、 264T、266F、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S 和 427F(欧盟编号规定)。在一个实施方案中，起始Fc区为IgGlFc区。在一个实施方案中，本发明稳定多肽的起始Fc区为IgG4Fc区。在一个实施方案中，起始Fc区为无糖基化IgGlFc区。在另一个实施方案中，起始Fc区为无糖基化IgG4Fc区。在一个实施方案中，稳定多肽包含两个或更多个稳定氨基酸。在一个实施方案中， 稳定多肽包含三个或更多个稳定氨基酸。另一方面，本发明涉及包含编码根据前述权利要求中任一项所述的稳定的结合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子包含编码稳定的结合多肽的多肽链的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及包含编码稳定的结合多肽或其多肽链的核酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明涉及一种生成本发明的稳定的Fc多肽的方法，其包括在培养基中培养宿主细胞以便生成稳定的Fc多肽。—方面，本发明涉及一种大批量制备包含稳定的Fc区的多肽的方法，所述方法包括(d)将至少一个稳定的Fc部分基因融合至多肽，以形成稳定的融合蛋白；(e)用编码所述稳定的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞；(f)在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在IOL或更多的培养基中培养步骤(f) 的宿主细胞；从而生成稳定的融合蛋白。在一个实施方案中，稳定的Fc区为包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域的嵌合Fe。在一个实施方案中，稳定的Fc区包含位于氨基酸位置四7(欧盟编号)的谷氨酰胺。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防受试者疾病或病症的方法，其包括将本发明的结合分子或包含此类结合分子的组合物结合至患有所述疾病或病症的受试者，从而治疗或预防疾病或病症。在一个实施方案中，所述疾病或病症选自炎症性疾病、神经障碍、自身免疫性疾病和肿瘤性疾病。从以下的详细描述和权利要求将显而易见本发明的其它特征和优点。附图简述
图1描述了典型抗原结合多肽(IgG抗体)的结构和抗体的抗原结合和效应子功能(例如，Fc受体(FcR)结合)的功能性质。还示出了抗体CH2域中糖的存在(糖基化) 如何改变效应子功能(FcR结合)，但不影响抗原结合。图2描述了两个来自IgGl的χ射线晶体结构(pdb密码lhzh)的相互作用的CH3域(图2A)。突出了 IgGl残基K409和D399。图2B描述了使用基于结构的HMM对人IgGl/ κ 恒定域序列的比对(Wang，N. ,Smith, W. ,Miller,B.，Aivazian，D. , Lugovskoy, A. ,Reff, Μ. ,Glaser,S. ,Croner,L. ,Demarest,S. (2008)Conserved amino acid networks involved in antibody variable domain interactions Proteins :Struct. Funct. Bioinform. In Press.)。以灰色突出域间相互作用涉及的Q、ChI和CH3的残基位置和与碳水化合物直接接触的那些氨基酸一起共同强烈变化的氨基酸位置。在比对下方提供了 Kabat和EU编号。 图2C描述了 IgGl-CH2域的结构的带状图(Sondermarm等，2000)。标记被N连接碳水化合物隐蔽的缬氨酸残基和Ch2域中唯一的6氨基酸环。图2D描述了天然IgGl-CH2序列和经完全修饰的IgGl-C^序列的比对。经修饰的残基位置以黑色示出。在比对的上面示出修饰位置的EU编号。图3描述了搅拌之后本发明的示例性IgG Fc构建体的浊度(图A)和％单体含量 (图 B)。图4描述了在保持低pH(pH 3. 1)时IgG Fc构建体随时间的相对峰高。图5描述了通过溶液亲合力表面等离子体共振测量的本发明的示例性IgGl和 IgG4Fc构建体与Fc γ受体的初始结合率。图6描述了用于计算本发明的示例性IgGl和IgG4Fc构建体与⑶64(Fe Y RI)(图 6A)和CD16 (Fe YRIIIa V158)(图6B)的结合的IC50的滴定曲线。图7描述了滴定曲线，突出与IgGlD99A和IgGl野生型相比，IgGlD99K与 CD64 (Fe y RI)的结合降低(图7A)，与其它含有D99A突变的示例性IgG4Fc构建体和IgGl 野生型相比含有D99K突变的示例性IgG4Fc构建体与⑶64 (Fe y RI)的结合降低(图7Β)。图8描述了与其它含有D99A突变的示例性IgG4Fc构建体和IgGl野生型相比， 含有T299K突变的示例性IgG4Fc构建体与CD16(FcYRIIIa V158)的结合。图9描述了用于评估本发明示例性IgGl构建体和IgG4Fc构建体与补体因子的结合的滴定曲线。图10图A和B分别示出用于评估各Fc构建体与⑶64和⑶16的结合的滴定曲线。图C示出N297Q IgG4-CH2/IgGl-CH3的半衰期与T299A抗体(其比无糖基化IgGl稍短)相同。图11图A示出用于评估D99X构建体与⑶64结合的滴定曲线，并说明带正电的侧链T299R和T299K对⑶64的亲合力低。图B示出用于评估⑶64与各替代性构建体的结合的滴定曲线。图C和D示出用于评估构建体与CD32aR的结合的滴定曲线，以及图E和F 示出构建体与⑶16的结合。图G和H示出Clq ELISA的结果。图12图A示出用于评估构建体与CD64的结合的滴定曲线，以及图B示出用于评估构建体与CD16的结合的滴定曲线。
具体实施例方式已发展了一种方法用于通过将一个或多个稳定氨基酸包含在Fc多肽的Fc区中以生成效应子功能降低的稳定的Fc多肽，例如，无糖基化抗体或IgG4抗体。该方法尤其适于仅通过对多肽进行最低限度的氨基酸改变而在真核细胞中生成含Fc的治疗性多肽。从而本发明的方法避免将氨基酸序列引入可致免疫的多肽中。优选地，稳定氨基酸使多肽的Fc区稳定，而不影响多肽的糖基化和/或效应子功能，且不会显著改变多肽的其它所需功能 (例如，抗原结合亲合力或半衰期)。为了清楚地理解说明书和权利要求书，下文方便地给出了以下定义。定义本文所使用的术语“效应子功能”指!^c区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞以及介导各种生物效应的功能性能力。效应子功能可为抗原依赖性或抗原非依赖性。 效应子功能降低指一种或多种效应子功能的降低，同时保持抗体(或其片段)可变区的抗原结合活性。效应子功能(例如，与Fc受体或补体蛋白的Fc结合)的升高或降低可用倍数变化(例如，改变1倍、2倍等)来表示，并且可基于例如用本领域熟知的测定而确定的结合活性的变化百分比来计算。本文所使用的术语“抗原依赖性效应子功能”指通常在抗体结合相应抗原之后诱导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白(如Clq)的能力。例如，补体的Cl组分与Fc区的结合可激活典型的补体系统，其引起细胞病原体的调理素作用和溶解，这是称为补体依赖性细胞毒作用(CDCC)的过程。补体的激活也刺激炎症反应并且也可能参与自身免疫超敏反应。其它抗原依赖性效应子功能由抗体通过其Fc区与细胞上某些Fc受体(〃 FcR") 结合来介导。存在若干对不同种类抗体的特异的Fc受体，包括IgG( γ受体或Ig Y Rs)、 IgE( ε受体或IgeR)、IgA(α受体或IgaR)和IgM(μ受体或IgyR)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发若干重要的不同生物反应，包括免疫复合物的胞吞作用、吞没和破坏抗体包被微粒或微生物(也称为抗体依赖性吞噬作用或ADCP)、清除免疫复合物、杀伤细胞溶解抗体包被的靶细胞(也称为抗体依赖性细胞毒作用或ADCC)、释放炎症性介质、调节免疫系统细胞激活、胎盘转移和控制免疫球蛋白生成。某些Fc受体，Fcy受体(FCYR)在取消或增强免疫募集中起关键性作用。FCYR 在白细胞上表达，并且由三个不同种类组成FcyRI、FcyRII和Fc γ RIII (Gessner等， Ann. Hemato 1. , (1998)，76 :231-48)。在结构上，Fc γ R是免疫球蛋白超家族的所有成员， 具有带有由两个或三个Ig样域组成的胞外部分的IgG结合α链。人FcyRI(CD64)在人单核细胞上表达，显示出与单体IgGl、IgG3、IgG4的高亲合力结合(Ka = IO8-IO9Ml。人 Fc yRII(CD32)和 Fc yRIII(CD16)对 IgGl 和 IgG3 的亲合力低(Ka < ΙΟΙ1)，并且可仅结合这些IgG同种型的复合或聚合形式。而且，Fc γ RII和Fc γ RIII类包括“A”和“B”两种形式。Fc YRIIa(CD32a)和Fc γ RIIIa(CD16a)通过跨膜域与巨噬细胞、NK细胞和一些T细胞的表面结合，而FcYRIIa(CD32a)和Fc γ RIIIa (CD16a)通过磷脂酰肌醇聚糖(GPI)锚点选择性地与粒细胞(例如嗜中性粒细胞)的细胞表面结合。人Fc γ RI、Fc y RII和Fc y RIII 的各鼠科同系物为Fc y RIIa, Fc y RIIb/1和Fc y Rio。本文所使用的术语“抗原非依赖性效应子功能”指可由抗体诱导的效应子功能， 而不管其是否已经结合其相应的抗原。典型的抗原非依赖性效应子功能包括细胞运输、免疫球蛋白的循环半衰期和清除率以及促进提纯。结构独特的Fc受体、“新生儿Fc受体”或 “Fcto”(也称为救治受体)在调节半衰期和细胞运输中起关键性作用。从微生物细胞提纯的其它Fc受体(例如，葡萄球菌蛋白A或G)能够以高亲合力结合Fc区并且可用于促进含 Fc的多肽的提纯。
与属于免疫球蛋白超家族的Fc γ R不同，人Fcfoi在结构上类似于I类主要组织相容性复合体(MHC)的多肽(Ghetie 和 Ward，Immunology Today, (1997), 18(12) :592-8)。 Fcfoi通常表示为异质二聚体，该异质二聚体由跨膜α或重链与可溶β或轻链(β 2微球蛋白)形成的复合物组成。Fcfoi与I类MHC分子有22-29%的序列同一性，并具有非功能型 MHC肽结合沟槽(Simister 和 Mostov，Nature，(1989) ,337 :184-7)。如同 MHC，Fcfoi 的 α 链由三个胞外域(α 1、α 2、α幻组成，且胞质短尾区将蛋白质锚定在细胞表面。α 1域和α 2 域与抗体Fc区中的FcR结合位点相互作用(Raghavan等，Immunity, (1994)，1 :303-15)。 FcRn在哺乳动物母体胎盘或卵黄囊中表达，并且其参与将IgG从母体转运至胎儿。Fcfoi也在啮齿动物新生儿的小肠中表达，其中其参与将母体IgG从摄取的初乳或奶中转运通过刷状缘上皮细胞。Fcfoi还在许多物种的许多其它组织以及各种内皮细胞系中表达。它还在成人血管内皮、肌肉脉管系统和肝窦状隙中表达。认为Fcfoi通过结合IgG并将其在血清中再利用而在保持IgG的循环半衰期或血清水平中起附加作用。Fcfoi与IgG分子的结合严格依赖于pH，在pH低于7.0时结合最佳。本文所使用的术语“半衰期”指体内特定结合多肽的生物半衰期。可用施用于受试者的量的一半从动物体内的循环和/或其它组织清除所需的时间来表示半衰期。当将给定结合多肽的清除曲线构造为时间函数时，该曲线通常为两相，即快速α相和较长的β相。 α相通常表示所施用的Fc多肽在血管内外空间之间的平衡，并且部分由多肽的大小确定。 β相通常表示结合多肽在血管内空间中的分解代谢。因此，在优选的实施方案中，本文所使用的术语半衰期指在β相中结合多肽的半衰期。人源抗体在人体内的典型β相半衰期为 21天。本文所使用的术语“多肽”指两个或更多个天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。 术语“Fe多肽”指包含Fc区或其部分(例如，Fc部分)的多肽。在优选的实施方案中，根据本发明的方法使Fc多肽稳定。在任选的实施方案中，Fc多肽进一步包含与Fc多肽的Fc 区(或其部分)可操作地连接或融合的结合位点。本文所使用的术语“蛋白质”指多肽(例如，Fc多肽)或包含一个以上多肽的组合物。因此，蛋白质可为单体(例如，单链Fc多肽)或多聚体。例如，在一个实施方案中， 本发明的蛋白质为二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体为包含两个相同单体亚单位或多肽(例如，两个相同的Fc多肽)的同型二聚体。在另一个实施方案中，本发明的二聚体为包含两个不同单体亚单位或多肽(例如，两个不同Fc多肽或一个Fc多肽和另一个不同于所述Fc多肽的多肽)的异质二聚体。二聚体的亚单位可包含一条或多条多肽链，其中至少一条多肽链为Fc多肽。例如，在一个实施方案中，二聚体包含至少两条多肽链(例如，至少两条Fc多肽链)。在一个实施方案中，二聚体包含两条多肽链，其中一条或两条链为Fc多肽链。在另一个实施方案中，二聚体包含三条多肽链，其中一条、两条或所有多肽链为Fc多肽链。在另一个实施方案中，二聚体包含四条多肽链，其中一条、两条、三条或所有多肽链为Fc多肽链。本文所使用的术语“连接的”、“融合的，，或“融合，，可交换使用。这些术语指两个以上的元件分或组分通过包括化学共轭或重组方式在内的任何方式连接在一起。本领域已知化学共轭方法(例如，使用异双功能交联剂)。本文所使用的术语“基因融合的”或“基因融合”指通过编码所述蛋白质、多肽或片段的单个多核苷酸分子的基因表达，两个或更多
15个蛋白质、多肽或其片段经由其各自的肽主链共线、共价连接或附接。这种基因融合引起单个邻接基因序列的表达。优选的基因融合是在框中，即两个或更多个开放阅读框(ORF)按保持原始ORF的正确阅读框的方式融合以形成连续更长的0RF。因此，所得到的重组融合蛋白为单一多肽，其含两个或更多个与由原始ORF编码的多肽相对应的蛋白质片段(实际上该片段通常并非如此连接)。尽管这样使得阅读框在整个融合基因片段上连续，但是可通过 (例如)框内多肽连接头在物理上或空间上分离蛋白质片段。本文所使用的术语“Fe区”应定义为由抗体重链的两个或更多个Fc部分形成的免疫球蛋白的部分。在某些实施方案中，Fc区为二聚Fc区。“二聚Fc区”或“dcFc”指由两条单独的免疫球蛋白重链的Fc部分形成的二聚体。二聚Fc区可为两个相同Fc部分的同型二聚体(例如，天然存在的免疫球蛋白的Fc区)或两个不同Fc部分的异质二聚体。在其它实施方案中，Fc区为单体或“单链” Fc区(S卩，scFc区)。单链Fc区由单一多肽链中基因连接的Fc部分(即，在单一邻接基因序列中编码的)组成。2008年5月14日提交的 PCT申请第PCT/US2008/006^0号中公开了示例性scFc区，该申请通过引用的方式并入本文。本文所使用的术语“Fe部分”指源自免疫球蛋白重链的部分的序列，其从正好位于木瓜蛋白酶裂解位点上游的铰链区开始(即，IgG的216位残基，将重链恒定区的第一个残基移至114位)并在免疫球蛋白重链的C端结束。因此，Fc部分可为完整的Fc部分或其部分(即，域)。完整的Fc部分包含至少一个铰链域、CH2域和CH3域(例如，EU氨基酸位置216-446)。Fc部分的C末端有时存在另外的赖氨酸残基(K)，但往往与成熟抗体分开。 Fc区中每个氨基酸位置已根据本领域公认的Kabat的欧盟编号系统编号，见例如1983年和 1987 年 U. S. Dept. Health and Human Services, Kabat 等的 “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，。在某些实施方案中，Fc部分包含以下的至少一个铰链(例如，上、中和/或下铰链区)域、CH2域、CH3域或其变体、部分或片段。在优选的实施方案中，Fc部分包含至少一个CH2域或CH3域。在某些实施方案中，Fc部分为完整的Fc部分。在其它实施方案中，相对于天然存在的Fc部分，所述Fc部分包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。例如，可能缺失铰链域、CH2域或CH3域(或其部分)中的至少一个。例如，Fc部分可包含或由以下域组成(i)与CH2域(或其部分)融合的铰链域(或其部分)、(ii)与CH3域(或其部分)融合的铰链域(或其部分)、(iii)与CH3域(或其部分)融合的CH2域(或其部分)、 (iv)CH2域(或其部分)和(v)CH3域或其部分。如前所述，本领域的普通技术人员应理解可修饰Fc部分以致其在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子的完整Fc部分不同，同时保持至少一种天然存在的Fc部分赋予的所需功能。例如，Fc部分可至少包含本领域已知的Fcfoi结合或延长半衰期所需的 Fc部分的部分或由其组成。在另一个实施方案中，Fc部分至少包含本领域已知的Fc YR结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区至少包含本领域已知的蛋白质A结合所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc部分至少包含本领域已知的蛋白质G结合所需的Fc分子的部分。在某些实施方案中，Fc区的Fc部分为相同的同种型。例如，Fc部分可源自IgGl 或IgG4同种型的免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)。然而，Fc区(或Fc区的一个或多个Fc部分)也可以是嵌合的。嵌合Fc区可包含源自不同免疫球蛋白同种型的Fc部分。在某些实施方案中，二聚或单链Fc区的至少两个Fc部分可来自不同的免疫球蛋白同种型。在另外的或替代性实施方案中，嵌合Fc区可包含一个或多个嵌合Fc部分。例如，嵌合Fc区或部分可包含一个或多个源自第一同种型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的部分，而Fc区或部分的其余部分为不同的同种型。例如，Fc多肽的Fc区或部分可包含源自第一同种型(例如，IgGl、IgG2或IgG4同种型)的免疫球蛋白的CH2域和/或CH3 域和来自第二同种型(例如，IgG3同种型)的免疫球蛋白的铰链区。在另一个实施方案中， Fc区或部分包含源自第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的铰链和/或CH2域和来自第二同种型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的CH3域。在另一个实施方案中，嵌合Fc区包含来自第一同种型(例如，IgG4同种型)的免疫球蛋白的Fc部分(例如，完整的Fc部分)和来自第二同种型(例如，IgGl、IgG2或IgG3同种型)的免疫球蛋白的Fc部分。在一个示例性的实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4免疫球蛋白的 CH2域和来自IgGl免疫球蛋白的CH3域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自IgG4 分子的CHl域和CH2域以及来自IgGl分子的CH3域。在另一个实施方案中，Fc区或部分包含来自抗体的特定同种型的CH2域的部分，例如，CH2域的EU位置四2-340。例如，在一个实施方案中，Fc区或部分包含源自IgG4部分的CH2的氨基酸位置四2-34和源自IgGl部分的CH2的其余部分(或者，CH2的位置四2-34可源自IgGl部分，且CH2的其余部分源自 IgG4部分)。在其它实施方案中，Fc区或部分可包含嵌合铰链区。嵌合铰链可部分源自IgGl、 IgG2或IgG4分子(例如，上和下中部铰链序列)，而部分源自IgG3分子(例如，中部铰链序列)。在另一个实例中，Fc区或部分可包含部分源自IgGl分子而部分源自IgG4分子的嵌合铰链。在具体的实施方案中，嵌合铰链可包含来自于IgG4分子的上部和下部铰链域和来自于IgGl分子的中部铰链域。可通过在IgG4铰链区的中部铰链域中的EU位置2 处引入脯氨酸取代来制备此类嵌合铰链。在另一个实施方案中，嵌合铰链可包含位于EU位置233-236的氨基酸，这些氨基酸来自IgG2抗体和/或Ser228Pro突变，其中铰链的其余氨基酸来自IgG4抗体(例如，序列ESKYGPPCPPCPAPPVAGP的嵌合铰链)。美国专利申请第10/880，320号中描述了另外的嵌合铰链，该专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。定义“Fe区”特别包括“无糖基化Fc区”。本文所使用的“无糖基化Fc区”为例如在其一个或多个Fc部分中位于EU位置297的N糖基化位点处缺乏共价连接的低聚糖或多糖的Fc区。在某些实施方案中，无糖基化Fc区被完全无糖基化，即，其所有Fc部分均缺乏糖。在其它实施方案中，无糖基化为部分无糖基化(即，半糖基化)。无糖基化Fc区可为去糖基化Fc区，即已通过例如化学或酶促方法除去Fc糖的Fc区。或者，无糖基化Fc区可以是非糖基化的或未糖基化的，即表达抗体而没有Fc碳水化合物，方式例如是使例如位于EU 位置297或四9的N糖基化位点的编码糖基化模式的一个或多个残基突变，在并非天然地将碳水化合物附接至蛋白质的生物(例如，细菌)中表达，或在通过基因操作或添加糖基化抑制剂(例如，糖基转移酶抑制剂)致使其糖基化机构有缺陷的宿主细胞或生物体中表达。 在替代性实施方案中，Fc区为“糖基化Fc区”，即，其在所有可用糖基化位点被完全糖基化。术语“亲本Fc多肽”包括含有需要稳定的Fc区的多肽(例如，IgG抗体)。优选地，亲本Fc多肽为无效应子Fc多肽。因此，亲本Fc多肽表示对其实施本发明的方法或可用作稳定性比较的参考点的原始Fc多肽。亲本多肽可包含天然的(即天然存在的)Fc区或部分(例如，人IgG4Fc区域或部分)或具有对天然存在的序列进行的预先存在氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其它改变)，但缺乏一个或多个稳定氨基酸的Fc区。术语“突变”或“突变的”应理解为包括在物理上对亲本Fc多肽进行突变(例如， 通过(例如，通过定点诱变)将编码一个氨基酸的核酸分子的密码子改变为编码不同氨基酸的密码子)或合成具有亲本Fc区中没有的氨基酸的变体Fc区(例如，通过分辨编码亲本Fc区的核酸分子的核苷酸序列和设计合成包含编码亲本Fc区的变体的核苷酸序列的核酸分子，而无需使编码本发明稳定多肽的核酸分子的一个或多个核苷酸突变)。在一个示例性的实施方案中，亲本Fc多肽包含来自无效应子Fc多肽的Fc区。本文所使用的术语“无效应子Fc多肽”指与IgGl同种型的野生型无糖基化抗体相比，效应子功能改变或降低的Fc多肽。优选地，降低或改变的效应子功能为抗体依赖性效应子功能， 例如，ADCC和/或ADCP。在一个实施方案中，由于Fc多肽的Fc区(例如，无糖基化Fc区) 中经修饰或降低的糖基化作用，无效应子Fc多肽的效应子功能降低。在另一个实施方案中，由于并入IgG4Fc区或其部分(例如，IgG4抗体的CH2域和/或CH3域)，无效应子Fc 多肽的效应子功能降低。术语“变体Fc多肽”或“Fe变体”包括源自亲本Fc多肽的Fc多肽。Fc变体与亲本Fc多肽不同之处在于例如，由于引入至少一个Fc稳定突变，Fc变体包括稳定一个或多个稳定氨基酸残基。在某些实施方案中，除存在一个或多个稳定Fc氨基酸外，本发明的Fc 变体包含序列与亲本多肽的序列相同的Fc区(或Fc部分)。在优选的实施方案中，与亲本 Fc多肽相比，Fc变体稳定性增强，并且与亲本Fc多肽相比，Fc变体的效应子功能任选地相当或降低。“源自，，指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列指多肽的来源。优选地，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有基本上与所述序列或其部分相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、优选至少20-30个氨基酸、更优选至少30-50个氨基酸组成，或者本领域的普通技术人员可识别为该序列中具有其起源。在多肽的情况下，“线性序列”或 “序列”为多肽中从氨基至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中在多肽的一级结构中所述序列中相邻的残基邻接。相对于原多肽或亲本多肽，源自另一个多肽(例如，亲本Fc多肽)的多肽(例如， 变体Fc多肽)可有一个或多个突变，例如，被另一个氨基酸残基取代或有一个或多个氨基酸残基插入或缺失的一个或多个氨基酸残基。优选地，多肽包含非天然存在的氨基酸序列。 这种变体与原多肽的序列同一性或相似性必定低于100%。在优选的实施方案中，例如在变体分子的全长或其一部分(例如，Fc区或Fc部分)上，变体的氨基酸序列与原多肽的氨基酸序列将具有约75%至低于100%氨基酸序列同一性或相似性，更优选为约80%至低于 100%，更优选为约85%至低于100%，更优选为约90%至低于100% (例如，91%、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% )和最优选为约95%至低于100%。在一个实施方案中，原多肽序列(例如，亲本Fc多肽的Fc区)和源自原多肽序列的序列(如变体Fc多肽的Fc区)之间有一个氨基酸差异。在其它实施方案中，在原多肽序列和变体多肽之间有介于两个和十个之间的氨基酸差异(例如，约2-20、约2-15、约2-10、约5_20、约5_15、约5-15、约5-10个氨基酸差异)。例如，可能有少于约10个氨基酸差异(例如，2、3、4、5、6、7、 8、9或10个氨基酸差异)。本文将相对于该序列的同一性或相似性定义为在比对序列并在必要时引入空隙获得最高百分比序列同一性之后，与原氨基酸残基相同的(即，相同的残基)候选序列中的氨基酸残基百分比。本发明的优选Fc多肽包含源自人免疫球蛋白序列(例如，来自人IgG分子的Fc区或Fc部分)的氨基酸序列(例如，至少一个Fc区或Fc部分)。然而，多肽可包含一个或多个来自另外的哺乳动物的氨基酸。例如，受试多肽中可包含灵长类Fc部分或灵长类结合位点。或者，Fc多肽中可存在一个或多个鼠类氨基酸。本发明的优选Fc多肽不产生免疫性。本领域的普通技术人员还应了解可改变本发明的Fc多肽以致与其来源的亲本多肽在氨基酸序列上不同，同时保持亲本多肽的一种或多种所需活性(例如，效应子功能降低)。在具体的实施方案中，进行使Fc多肽稳定的核苷酸或氨基酸取代。在一个实施方案中，可通过对亲本Fc多肽的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而生成编码Fc变体的分离的核酸分子，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白质。可通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变(例如，稳定突变)。本文所使用的术语“蛋白质稳定性”指本领域公认的蛋白质响应于环境条件(例如，温度升高或降低)的一种或多种物理性质保持性的量度。在一个实施方案中，物理性质为蛋白质共价结构的保持(例如，没有蛋白裂解、有害的氧化或脱酰胺作用)。在另一个实施方案中，物理性质为存在呈适当折叠状态的蛋白质(例如，没有可溶性或不溶性聚集物或沉淀)。在一个实施方案中，通过测定蛋白质的生物物理学性质，如热稳定性、PH解折叠性、稳定的去除糖基化、溶解性、生化功能(例如，结合蛋白质(例如，配体、受体、抗原等) 或化学部分等的能力)，和/或其组合来测量蛋白质的稳定性。在另一个实施方案中，用相互作用的结合亲合力证明生化功能。在一个实施方案中，蛋白质稳定性的量度为热稳定性， 即，对热激发的抵抗力。可使用本领域已知的方法和/或本文所描述的方法测量稳定性。例如，可测量“Tm”(也称为“转变温度”)。Tm是使50%的大分子(例如，结合分子)变性的温度，并被视为用于描述蛋白质热稳定性的标准参数。术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、 天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸 (Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、 甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或幻、苏氨酸 (Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明范围之内，并包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物， 如Ellman等，Meth. Enzym. 202 :301-336(1991)中所描述的那些。为了生成这种非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等，Science 244:182(1989)和Ellman等，上文献中的方法。简言之，这些方法涉及化学激活带非天然存在氨基酸残基的抑制型tRNA，然后在体外转录并翻译RNA。还可使用本领域已知的肽化学法实现非传统氨基酸的引入。本文所使用的术语“极性氨基酸”包括具有零净电荷，但在其侧链的不同部位具有局部非零电荷的氨基酸 (例如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所使用的术语“带电氨基酸”包括在其侧链可具有非零净电荷的氨基酸(例如R、K、H、E、D)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所使用的术语“空间体积足够大的氨基酸”包括那些侧链占有较大三维空间的氨基酸。具有足够大空间体积的侧链化学性质的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸或其类似物或模拟物。“氨基酸取代”指用另一不同的“置换，，氨基酸残基置换预定氨基酸序列(原多肽的氨基酸序列)中至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”指将至少一个额外的氨基酸并入预定氨基酸序列。虽然插入将通常由插入一个或两个氨基酸残基组成，但可进行当前更大的“肽插入”，例如插入约3个至约5个或甚至多达约10个、15个或20个氨基酸残基。 如上所述，插入的残基可为天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”指从预定氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。如上所述，这些术语包括现有物理核酸分子的实际变化或在设计过程(例如，在书面上或电脑上)中对现有核酸序列所作的变化。在某些实施方案中，本发明的多肽为结合多肽。本文所使用的术语“结合多肽”指包含至少一个特异性结合靶分子(如抗原或结合配偶体)的靶结合位点或结合域的多肽 (例如，Fc多肽)。例如，在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含免疫球蛋白抗原结合位点或负责配体结合的受体分子的部分或负责受体结合的配体分子的部分。本发明的结合多肽包含至少一个结合位点。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合多肽包含两个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含三个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含四个结合位点。在一个实施方案中，结合位点相互连接在一起。在另一个实施方案中，结合位点位于结合多肽的不同位置，例如位于Fc多肽的Fc区的一个或多个N或C端。例如，当Fc区为scFc区时，结合位点可连接至 scFc区的N端、C端或其二者。当Fc区为二聚Fc区时，结合位点可连接至一个或两个N端和/或一个或两个C端。本文所使用的术语“结合域”、“结合位点，，或“结合部分，，指结合多肽具有生物活性(Fe介导的生物活性除外)的部分、区或位点，例如，介导与靶分子(如抗原、配体、受体、 底物或抑制剂)的特异性结合的部分、区或位点。示例性结合域包括生物活性蛋白或部分、 抗原结合位点、配体的受体结合域、受体的配体结合域或酶结合域。在另一个实例中，术语 “结合部分”指结合生物系统的组分(例如，血清或细胞表面蛋白或细胞基质中的蛋白质) 的生物活性分子或其部分，并且这种结合导致生物效应(例如，通过改变与之结合的活性部分和/或组分进行测量(例如，裂解与之结合的活性部分和/或组分，传输信号或加强或抑制细胞或受试者体内的生物反应))。本文所使用的术语“配体结合域”指保持至少一种定性配体结合能力，并优选保持相应天然受体的生物活性的天然受体(例如，细胞表面受体)或其区或衍生物。本文所使用的术语“受体结合域”指保持至少一种定性受体结合能力，并优选保持相应天然配体的生物活性的天然配体或其区或衍生物。在一个实施方案中，本发明的结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域，例如，细胞表面抗原或可溶性抗原。在优选的实施方案中，结合域包含抗原结合位点或由抗原结合位点组成(例如，包含来自置于选择性骨架区(例如，任选包含一个或多个氨基酸取代的人骨架区)的抗体的可变重链序列和可变轻链序列或六个CDR)。本文所使用的术语“结合亲合力”包括结合相互作用的强度，且因此包括实际结合亲合力以及表观结合亲合力。实际结合亲合力为缔合速率与解离速率的比率。因此，授予或优化结合亲合力包括改变这两个部分之一或其二者以达到所需水平的结合亲合力。表观亲合力可包括例如相互作用的亲合力等。本文所使用的术语“结合自由能”或“结合的自由能”包括其领域公认的含义，并且尤其适用于溶剂中结合位点-配体或Fc-FcR的相互作用。结合自由能降低使亲合力增强，而结合自由能升高使亲合力下降。术语“特异性”包括特异性结合给定靶标(例如，与之免疫反应)的潜在结合位点的数量。结合多肽可为单特异性的并含有一个或多个特异性结合相同的靶标(例如，相同的表位)的结合位点，或者结合多肽可为多特异性的并含有两个或更多个特异性结合相同靶标的不同区(例如，不同的表位)或不同靶标的结合位点。在一个实施方案中，可制备对一个以上的靶分子(例如，一个以上的抗原或相同抗原上的一个以上的表位)具有结合特异性的多特异性结合多肽(例如，双特异性多肽)。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对细胞上的靶分子有特异性的结合域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对药物有特异性的结合域。在又一个实施方案中，多特异性结合多肽具有至少一个对被靶向减少或消除的分子有特异性的结合域和至少一个对药物前体有特异性的结合域。在又一个实施方案中，多特异性结合多肽为四价抗体，其具有两个对一个靶分子有特异性的结合域和两个对另一靶分子有特异性的结合位点ο本文所使用的术语“价”指结合多肽或蛋白质中潜在结合域的数量。各结合域特异性结合一个靶分子。当结合多肽包含一个以上结合域时，各结合域可特异性结合相同或不同的分子(例如，可结合不同的配体或不同的抗原或相同抗原上的不同表位)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽为单价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为多价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为二价。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽为三价。在又一个实施方案中，本发明的结合多肽为四价。在某些方面，本发明的结合多肽采用多肽接头。本文所使用的术语“多肽接头”指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可用于将结合位点连接到本发明Fc多肽的Fc区(或Fc部分)。优选地，这种多肽接头为多肽分子提供挠性。例如，在一个实施方案中，VH域或VL域与多肽接头融合或连接，且多肽接头的N端或C端与Fc区(或Fc部分)的C端或N端连接，且多肽接头的N 端与VH域或VL域的N端或C端连接。在某些实施方案中，多肽接头用于连接(例如，基因融合)scFc多肽的两个Fc部分或域。本文也将这种多肽接头称为Fc连接多肽。本文所使用的术语“Fe连接多肽”尤其指连接(例如，基因融合)两个Fc部分或域的连接多肽。本发明的结合分子可包含一个以上的肽接头。本文所使用的术语“适当折叠的多肽”包括其中组成多肽的所有功能域均具有明显活性的多肽(例如，本发明的结合多肽)。本文所使用的术语“不当折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能区无活性的多肽。本文所使用的术语“适当折叠的Fc多肽”或“适当折叠的Fc区”包括其中至少两个Fc组成部分适当折叠以致所得到的Fc区包含至少一种效应子功能的Fc区(例如，scFc区)。本文所使用的术语“免疫球蛋白”包括具有两条重链和两条轻链的组合而无论其
21是否具有任何相关特异免疫反应性的多肽。本文所使用的术语“抗体”指这种对目标抗原 (例如，肿瘤相关抗原)有显著的已知特异免疫反应活性的集合(例如，全抗体分子、抗体片段或其变体)。抗体和免疫球蛋白包含其间有或无链间共价键的轻链和重链。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构相对很好理解。如以下将更详细讨论的，通用术语“抗体”包括五个可用生化方法区别的不同种类的抗体。来自各类抗体的Fc部分明显在本发明的范围之内，以下讨论通常针对IgG类免疫球蛋白分子。对于IgG而言，免疫球蛋白包含两条分子量约为23，000道尔顿的相同多肽轻链和两条分子量为53，000-70，000道尔顿的相同多肽重链。用二硫键将这四条链连接成 “Y”构型，其中轻链将起始于“Y” 口部并继续通过可变域的重链括在一起。将免疫球蛋白的轻链归类为κ或λ。每个重链种类可与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生成时，轻链和重链相互共价结合， 两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键相互结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉端处的N端至各链底部的C端。本领域的技术人员将了解重链归类为Y、μ、α、δ、ε， 其间有许多子类(例如，Y I-Y 4)。该链的特性在于将抗体的“种类”分别确定为IgG、IgM、 IgA、IgG或IgE0免疫球蛋白子类(同种型)，例如，IgG1UgG2, IgG3、IgG4, IgA1等也是定性清楚的并且已知使之功能特化。由本公开内容来看，这些各种类和同种型的修饰类型对于技术人员是易于辩别的，并因此在本发明范围之内。轻链和重链均分为结构区和功能同源区。术语“区”指单个免疫球蛋白或抗体单链的局部或部分(术语“Fe区”也是如此)，并包括恒定区或可变区以及所述域的更多的分离局部或部分。例如，轻链可变域包括散布于本文所定义的“骨架区”或“FR”间的“互补决定区”或“CDR”。在“恒定区”的情况下根据各类成员的区中相对缺乏的序列变体，或在“可变区” 的情况下根据各类成员的区中相对缺乏的显著变体，可将免疫球蛋白的某些区定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区。术语“恒定区”和“可变区”在功能上也可用。在这点上，应了解免疫球蛋白或抗体的可变区决定抗原识别和特异性。相反地，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应子功能，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区折叠成域。术语“域”指包含(例如)用 β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包括3至4个肽环)的重链或轻链多肽的独立折叠球形区。免疫球蛋白轻链上的恒定区域可交换地称为“轻链恒定区域”、“CL区” 或“CL域”。重链上的恒定域(例如，铰链、CHl域、CH2域或CH3域)可交换地称为“重链恒定区域”、“CH区域”或“CH域”。轻链上的可变域可交换地称为“轻链可变区域”、“VL区域”或“VL域”。重链上的可变域可交换地称为“重链可变区域”、“VH区域”或“VH域”。按照惯例，随着可变区域和恒定区域离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端越远，可变区域和恒定区域的编号增加。各免疫球蛋白重链和轻链的N端为可变区，而 C端为恒定区；CH3域和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。因此，轻链免疫球蛋白域按VL-CL方向排列，而重链域按VH-CHl-铰链-CH2-CH3方向排列。本文根据欧盟索引编号系统(见1991年U. S. Dept. Health and Human Services H 5 片反中，Kabat ·的“Sequences of Proteins of Immunological Interest") X^SIjIfl定区中的氨基酸位置(包括CHl域、铰链域、CH2域和CH3域中的氨基酸位置)进行编号。 相反，在本文中，根据Kabat索引编号系统(见如上Kabat等)对轻链恒定区(例如CL域) 中的氨基酸位置进行编号。根据Kabat索引编号系统，本文所使用的术语“VH域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变域，且术语域”包括免疫球蛋白轻链的氨基端可变域。本文所使用的术语“CH1域”包括例如从EU位置约118-215延伸的免疫球蛋白重链的第一(最氨基端)恒定区域。CHl域邻近Vh域和免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端，并未形成免疫球蛋白重链的Fc区的部分。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自免疫球蛋白重链分子(例如，人IgGl或IgG4分子)的CHl域。本文所使用的术语“铰链区”包括将CHl域连至CH2域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且有挠性，从而使两个N端抗原结合区独立移动。铰链区可再分为三个不同的域上、中、下铰链域(Roux等，J. Immunol. 1998,161 :4083)本文所使用的术语“CH2域”包括例如从EU位置约231-340延伸的重链免疫球蛋白分子的部分。CH2域独特之处在于其并未与另外的域紧密配对。相反，两个N连接碳水化合物支链插入完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgGl分子(例如人IgGl分子)的CH2域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG4分子(例如人IgG4分子)的CH2域。在一个示例性实施方案中， 本发明的多肽包含CH2域(EU位置231-340)或其部分。本文所使用的术语“CH3域”包含从CH2域的N端(例如从位置约341_446b (欧盟编号系统))延伸约110个残基的重链免疫球蛋白分子的部分。CH3域通常形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的域可能从CH3域延伸以形成分子的C端部分(例如，IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4域)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgGl分子(例如，人IgGl分子)的CH3域。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自IgG4分子(例如，人IgG4分子)的CH3域。本文所使用的术语“CL域”包括例如从Kabat位置约107A-216延伸的免疫球蛋白轻链的第一(最氨基端)恒定区域。CL域邻近\域。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含源自κ轻链(例如，人κ轻链)的CL域。如上所示，抗体的可变区使其选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即，抗体的八域和Vh域联合形成限定三维抗原结合位点的可变区(Fv)。这种四元抗体结构形成存在于Y的每个臂末端处的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由每个重链可变区和轻链可变区上的三个互补决定区(OTR)限定。本文所使用的术语“抗原结合位点”包括特异性结合(与之免疫反应)抗原(如细胞表面或可溶性抗原)的位点。在一个实施方案中，结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。抗原结合位点由多肽不同的可变区形成。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有抗体分子的至少一个重链或轻链CDR(例如，其序列为本领域已知或如本文所描述)的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少两个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少三个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少四个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少五个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含含有至少六个来自于一个或多个抗体分子的CDR的抗原结合位点。本领域已知包含至少一个可包括在受试结合多肽内的CDR的示例性抗体分子， 且本文描述了示例性分子。 本文所使用的术语“⑶R”或“互补决定区”指重链和轻链多肽的可变区内存在的非邻接抗原结合位点。Kabat 等在 J. Biol. Chem. 252,6609-6616(1977)和“Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1991) ψ, Chothia ^ ^ J. Mol. Biol. 196 901-917(1987)中和 MacCallum 等在 J. Mol. Biol. 262 :732-745(1996)中已描述了这些特殊区，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。提出包含每个以上所引用的参考文献所定义的CDR的氨基酸残基以便进行比较。优选地，术语“CDR”为由Kabat根据序列比较定义的⑶R。
权利要求
1.一种包含嵌合Fc区的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含至少一个来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和至少一个来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定Fc氨基酸。
2.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中所述嵌合Fc区包含铰链、来自IgG4同种型的 IgG抗体的CHl域和CH2域和来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域，并且其中所述抗体包含位于氨基酸位置2 (欧盟编号)的脯氨酸。
3.一种包含来自IgG4抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自 240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、 399S和427F(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
4.根据权利要求3所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置四7的谷氨酰胺。
5.一种包含来自IgGl抗体的Fc区的CH2部分的稳定多肽，其中所述稳定多肽包含位于一个或多个选自四91(和四70(欧盟编号规定)的氨基酸位置的一个或多个稳定氨基酸。
6.根据权利要求4所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置四9的赖氨酸。
7.根据权利要求5所述的稳定多肽，其包含位于氨基酸位置四9的赖氨酸和位于氨基酸位置四7的天冬氨酸。
8.根据权利要求4所述的稳定多肽，其中所述Fc区为无糖基化Fc区。
9.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中IgG抗体为人源抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏稳定氨基酸的亲本多肽，所述稳定多肽的解链温度(Tm)至少升高1°C。
11.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中所述稳定Fc多肽的解链温度(Tm)升高约 1°C或更多、约2°C或更多、约；3°C或更多、约4°C或更多、约5°C或更多、约6°C或更多、约7°C 或更多、约8°C或更多、约9°C或更多、约10°C或更多、约15°C或更多和约20°C或更多。
12.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中在中性pH(约6.5至约7.5)下所述解链温度CTm)升高。
13.根据权利要求10所述的稳定多肽，其中在约6.5或更低、约6. 0或更低、约5. 5或更低、约5.0或更低、约4. 5或更低和约4.0或更低的酸性pH下，所述解链温度(Tm)升高。
14.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏稳定突变的亲本多肽，所述稳定多肽以更高的产量表达。
15.根据权利要求14所述的稳定多肽，其中在细胞培养物中稳定Fc多肽以产量为约 5mg/L或更高、约10mg/L或更高、约15mg/L或更高、约20mg/L或更高表达。
16.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中相对于缺乏所述稳定氨基酸的亲本多肽，所述稳定多肽的浊度降低。
17.根据权利要求16所述的稳定多肽，其中所述浊度以选自以下各项的倍数降低约 1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约6倍或更高、约 7倍或更高、约8倍或更高、约9倍或更高、约10倍或更高、约15倍或更高、约50倍或更高和约100倍或更高。
18.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中与缺乏所述稳定突变的亲本Fc 多肽相比，所述稳定多肽的效应子功能降低。
19.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述降低的效应子功能为降低的ADCC活性。
20.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述降低的效应子功能为降低的与选自 FcyRI.FcyRII 禾口 Fc γ RIII 的 Fc 受体(FcR)的结合。
21.根据权利要求18所述的稳定多肽，其中所述效应子功能以选自以下各项的倍数降低约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
22.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中与亲本Fc多肽相比，所述稳定多肽的半衰期增加。
23.根据权利要求22所述的稳定多肽，其中所述半衰期增加归因于与新生儿受体 (FcRn)的结合增强。
24.根据权利要求22所述的稳定多肽，其中所述半衰期以选自以下各项的倍数增加 约1倍或更多、约2倍或更多、约3倍或更多、约4倍或更多、约5倍或更多、约6倍或更多、 约7倍或更多、约8倍或更多、约9倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约50倍或更多和约100倍或更多。
25.根据权利要求1至M中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区为包含两条多肽链的二聚Fc区。
26.根据权利要求1至M中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区为单链Fc区。
27.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区的所有Fc部分均被无糖基化。
28.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区包含位于Fc区的位置四9(欧盟编号规定)的取代。
29.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区由于其在细菌宿主细胞中生成而被无糖基化。
30.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区由于通过化学或酶促方法的去糖基化作用而被无糖基化。
31.根据权利要求7所述的稳定多肽，其中所述无糖基化Fc区包含嵌合铰链域。
32.根据权利要求31所述的稳定多肽，其中所述嵌合铰链域包含位于氨基酸位置 228(欧盟编号规定)用脯氨酸残基进行的取代。
33.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中所述稳定氨基酸独立地选自以下氨基酸 (i)位于位置四7的不带电氨基酸、(ii)位于位置四9的带正电的氨基酸、(iii)位于位置 307的极性氨基酸、(iv)位于位置309的带正电的氨基酸或极性氨基酸、(ν)位于位置399 的极性氨基酸、(vi)位于位置409的带正电的氨基酸或极性氨基酸和(vii)位于位置427 的极性氨基酸。
34.根据权利要求1所述的稳定多肽，其中至少一个稳定氨基酸为位于氨基酸位置四7(欧盟编号)的谷氨酰胺。
35.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置四9的赖氨酸(K)或酪氨酸(Y)。
36.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置307的脯氨酸⑵或甲硫氨酸(M)。
37.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定氨基酸为位于位置309的脯氨酸⑵、甲硫氨酸(M)或赖氨酸⑷。
38.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中至少一个所述稳定突变为位于位置399的丝氨酸⑶。
39.根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽，其中所述Fc区可操作地连接至结合位点。
40.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点选自抗原结合位点、受体的配体结合部分或配体的受体结合部分。
41.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点源自选自以下各项修饰的抗体scFv、Fab、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体和Dab。
42.根据权利要求39所述的稳定多肽，其为稳定的全长抗体。
43.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体和人源化抗体。
44.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述稳定的全长抗体与常规或稳定的scFv 分子融合。
45.根据权利要求39所述的稳定多肽，其为稳定的免疫粘附素。
46.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中结合位点覆盖在所述稳定多肽的Fc区的表
47.根据权利要求39所述的稳定多肽，其中所述结合位点源自非免疫球蛋白结合分子。
48.根据权利要求47所述的稳定多肽，其中所述非免疫球蛋白结合分子选自 adnectin、亲合体、DARPin 禾口 anticalin。
49.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述受体的配体结合部分源自选自以下各项的受体免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCR) 超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质源神经营养因子(GDNF)受体家族的受体和细胞因子受体超家族。
50.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述配体的受体结合部分源自抑制性配体。
51.根据权利要求40所述的稳定多肽，其中所述配体的受体结合部分源自活化配体。
52.根据权利要求50或51所述的结合多肽，其中所述配体结合选自以下各项的受体 免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G蛋白偶联受体(GPCI )超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLI )超家族和细胞因子受体超家族。
53.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的稳定多肽的组合物和一种药学上可接受的载体。
54.一种包含编码前述权利要求中任一项所述的稳定结合多肽的核苷酸序列的核酸分子。
55.一种包含编码权利要求25所述的稳定结合多肽的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。
56.一种包含权利要求M或55所述的核酸分子的载体。
57.一种表达权利要求56所述的载体的宿主细胞。
58.一种生成本发明的稳定Fc多肽的方法，所述方法包括在培养基中培养权利要求57 所述的宿主细胞以便生成所述稳定Fc多肽。
59.一种稳定包含无糖基化嵌合Fc区或其部分的亲本Fc多肽的方法，所述方法包括用稳定氨基酸取代Fc区的至少一个Fc部分中的所选氨基酸从而生成相对于所述原多肽稳定性增强的稳定Fc多肽，其中对选自297、299、307、309、399、409和427(欧盟编号规定)的 Fc部分的氨基酸位置进行所述取代。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述嵌合Fc区包含来自IgG4同种型的IgG抗体的CH2域和来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域。
61.根据权利要求58所述的方法，其中存在于所述稳定Fc多肽的氨基酸位置和氨基酸选自 297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399E、399S、409K、409M 和 427F。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述稳定Fc多肽包含位于位置297(欧盟编号) 的谷氨酰胺。
63.一种大批生产包含稳定Fc区的多肽的方法，所述方法包括(a)将至少一个稳定Fc部分基因融合至多肽以形成稳定的融合蛋白；(b)用编码所述稳定的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞；(c)在使得稳定的融合蛋白表达的条件下，在IOL或更多的培养基中培养步骤(f)的宿主细胞；从而生成稳定的融合蛋白。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述稳定的Fc区为包含来自IgG4同种型的IgG 抗体的CH2域和来自IgGl同种型的IgG抗体的CH3域的嵌合Fe。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述稳定的Fc区包含位于氨基酸位置四7(欧盟编号)的谷氨酰胺。
66.一种治疗或预防受试者疾病或病症的方法，所述方法包括对患有所述疾病或病症的受试者施用权利要求53所述的组合物从而治疗或预防疾病或病症。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病或病症选自炎症性疾病、神经障碍、自身免疫性疾病和肿瘤性疾病。
全文摘要
本发明提供一种生成含Fc的多肽的方法，如具有稳定的Fc区的抗体。本发明还提供了根据这些方法生成的稳定Fc多肽以及将此类抗体用作治疗剂的方法。
文档编号C07K16/00GK102369291SQ201080013454
公开日2012年3月7日 申请日期2010年1月22日 优先权日2009年1月23日
发明者B.R.米勒, C.L.雷耶斯, E.加伯, E.钱, F.R.泰勒, S.德马雷斯特, S.格拉泽 申请人:比奥根艾迪克Ma公司