专利名称：Dkk-1抗体的制作方法
DKK-1抗体本发明涉及抗DKK-I的人工程化的抗体，及其在治疗发病机理是由DKK-I介导的疾病中的用途。Dickkopf-I (Dkk-I)是dickkopf蛋白质家族的成员，表现为是规范的Wnt-信号通路的负调控子。该通路在骨骼发育和形成中发挥了关键作用。Dkk-I通过与Wnt共同受体 LRP5或LRP6和kremen蛋白的相互作用，抑制Wnt信号传递。Dkk-I抑制Wnt通路的成员与LRP5或LRP6的相互作用，从而抑制Wnt-介导的信号转导。DKKl还表现出涉及骨骼转移癌症，包括多发性骨髓瘤、乳腺癌、肾癌和非小细胞肺癌。已描述了结合Dkk-I的抗体(例如，参见W02006015373)，然而，仍然需要可抑制 Dkk-I与LRP5和LRP6相互作用的治疗性人工程化的DKK-I抗体。此外，鉴于Dkk-I参与调控骨骼形成，需要治疗性人工程化的抗Dkk-I抗体用于骨骼愈合。此外，考虑到Dkk-I参与癌症，需要人工程化的抗Dkk-I抗体用于治疗癌症，包括多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。本发明的抗体是具有多种理想特性的治疗性有效的DKK-I拮抗剂。该人工程化的抗体表现出对人DKK-1、猕猴DKK-1、大鼠DKK-1、小鼠DKK-I和兔DKK-I的高亲和力(Kd)。 本发明的抗体阻断DDK-I介导的碱性磷酸酶的抑制作用，后者是成骨细胞活性的标志物。 此外，本发明的抗体表现出在皮质缺陷的体内模型中增加前后皮质的骨量密度，并展现出在体内对非小细胞肺异种移植物的显著的生长抑制。本发明提供了在37 °C下，具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、猕猴 (cynomolgus)DKK-1 (SEQ ID NO 30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 33)和兔DKK-1 (SEQ ID NO 32)的Kd小于5. OXKTiiM的人工程化的DKK-1抗体，或其抗原
结合片段。本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其结合片段，其中IXDRl具有SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列，HCDRl具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列， 和HCDR3具有SEQ ID NO 44的氨基酸序列。本发明还提供了药物组合物，其包括本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明还提供了愈合骨骼的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了治疗癌症的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。本发明提供了如本文所述的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)的Kd小于1. 5X10_"M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)的Kd小于1.0Χ10-"Μ。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)的Kd小于5. 0Χ10_12Μ。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-I (SEQ ID NO 29)的Kd在0. 5Χ1(Γ12Μ和1. 5X10-"M之间。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-I (SEQ ID NO 29) 的Kd在LOXlO-12M和LOXlO-11M之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37°C的结合平衡确立的。本发明还提供了如本文所述的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人 DKK-I (SEQ ID NO 29)、猕猴 DKK-I (SEQ ID NO 30)、大鼠 DKK-I (SEQ ID NO :31)、小鼠 DKK-1(SEQID NO :33)和兔DKK-1 (SEQ ID NO 32)的 Kd 小于 5. OXKT11Mtj 更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人 DKK-I (SEQ ID NO 29)、猕猴 DKK-I (SEQ IDNO :30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID N0:31)、小鼠 DKK-I (SEQ ID NO 33)和兔 DKK-1 (SEQ ID NO 32)的 Kd 小于 3. OXKT11Mtj 更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、大鼠DKK-1 (SEQ ID NO :31)和小鼠DKK-1 (SEQ ID NO :33)的Kd小于2. OXKT11Mtj 更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、猕猴DKK-1 (SEQ ID NO :30)、大鼠DKK-1 (SEQ ID N0:31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 33)和兔 DKK-1 (SEQ ID NO 32)的 Kd 在 1. OXKTiiM 和 5. OXKTiiM 之间。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、大鼠DKK-1 (SEQ ID NO :31)和小鼠DKK-1 (SEQ ID NO 33) 的Kd在1. 5X10-"M和3. OXlO-11M之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37°C的结合平衡确立的。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段具有的对于人 DKK-1 (SEQID NO 29)、猕猴 DKK-1 (SEQ ID NO 30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO :33)和兔 DKK-1 (SEQ ID NO 32)的 Kd 小于 3. OXKT11Mtj 更优选的， 本发明提供了这样的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ IDNO 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的 HCVR,且其中所述人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、猕猴 DKK-1 (SEQ ID NO :30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO :31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO: 33)和兔DKK-1 (SEQ IDNO 32)的Kd小于2. 5X10—、。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1 (SEQ ID NO 29)、猕猴DKK-1 (SEQ ID NO: 30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO :31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 33)和兔 DKK-1 (SEQ ID NO: 32)的Kd小于2. OXlO-11M0更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段具有的对于人 DKK-1 (SEQ ID NO 29)、猕猴 DKK-1 (SEQ ID NO :30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO 33)和兔 DKK-1 (SEQ ID NO 32)的 Kd 在 0. 5Χ1(Γ12Μ 禾口 3. 0Χ10_"Μ之间。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ IDNO 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO :12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-I (SEQ ID NO :29)、猕猴DKK-I (SEQ ID NO :30)、大鼠DKK-1 (SEQ ID NO :31)、 小鼠 DKK-I (SEQ ID NO 33)和兔 DKK-I (SEQ IDNO 32)的 Kd 在 1. OXliT12M 和 2. 5Χ1(Γ"Μ 之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37°C的结合平衡确立的。本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区(LCVR) 和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR) LCDRl、LCDR2和LCDR3，而HCVR包含 CDR HCDR1、HCDR2 和 HCDR3，其中 LCDRl 具有 SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，HCDRl 具有 SEQ ID NO 1的氨基酸序列，和HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中IXDRl具有SEQ ID NO 46的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO 48的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO 50 的氨基酸序列，HCDRl具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO :43的氨基酸序列，和HCDR3具有SEQ ID NO :45的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I 抗体或其抗原结合片段，其中IXDRl具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列，IXDR2具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列，HCDRl具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，和HCDR3具有SEQ ID NO 44的氨基酸序列。本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中IXDRl具有SEQ ID NO :5的氨基酸序列，LCDR2具有选自SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8和SEQ ID N0:10的氨基酸序列，LCDR3具有选自SEQID NO 7和SEQ ID NO 9的氨基酸序列，HCDRl具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，和HCDR3具有选自SEQ ID NO 3 和SEQ ID NO 4的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中LCDR1、 LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2和HCDR3具有选自以下的氨基酸序列(i) LCDRl 是 SEQ ID NO :5，LCDR2 是 SEQ ID NO :6，LCDR3 是 SEQ ID NO :7，HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 3 ；(ii) LCDRl 是 SEQ ID NO 5，LCDR2 是 SEQ ID NO :8，LCDR3 是 SEQ ID NO :7，HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 4 ；(iii) LCDRl 是 SEQ ID NO 5，LCDR2 是 SEQ ID NO :6，LCDR3 是 SEQ ID NO 9, HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 3 ；(iv)LCDRl 是SEQ ID NO 5，LCDR2是SEQ ID NO :10，LCDR3 是SEQ ID NO 9,HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO :3。本发明提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中LCVR包括SEQ ID NO 52的氨基酸序列，HCVR包括SEQ ID NO 51的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中LCVR包括选自 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中HCVR包括选自SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中LCVR和HCVR包括选自以下的氨基酸序列(i)包括SEQ ID NO 13的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 11的氨基酸序列的HCVR ；(ii)包括SEQ ID NO 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的HCVR ；(iii)包括SEQ ID NO 15的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 11的氨基酸序列的HCVR ；(iv)包括SEQ ID NO 16的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 11的氨基酸序列的HCVR。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列的LCVR，和包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列的HCVR。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自 SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO 22
的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18的氨基酸序列。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含重链和轻链，其氨基酸序列选自(i)包括SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链；(ii)包括SEQ ID NO 18的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 20的氨基酸序列的轻链；(iii)包括SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 21的氨基酸序列的轻链；和(iv)包括SEQ ID NO 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 22的氨基酸序列的轻链。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO: 19的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID N0:17的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO :21的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID N0:17的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO :22的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID N0:17的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-I抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID N0:18的氨基酸序列。
本发明还提供了通过抗体竞争测定确定的，与本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段竞争结合人DKK-I (SEQ ID NO 29)的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了药物组合物，包括本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此外，本发明提供了药物组合物，包括本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选的其它治疗性成分。在另一方面，本发明提供了愈合骨骼的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-I 抗体或其抗原结合片段。在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-I 抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。此外，本发明提供了本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，用于治疗。优选的，本发明提供了本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，用在愈合骨骼的治疗或癌症治疗中，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。此外，本发明还提供了本发明的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗、愈合骨骼或治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。全长抗体正如其天然存在的，是包括通过二硫键互联的2条重(H)链和2条轻 (L)链的免疫球蛋白分子。每一链的氨基酸末端部分包括主要通过其中所含的互补决定区 (CDR)来负责抗原识别的、约100-110个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。⑶R被较保守的，称作框架区(“FR”)的区域分散。每一轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR和4个FR构成，它们按下述顺序从氨基末端到羧基末端排列 FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的 3 个 CDR 称作 “ LCDRl、LCDR2 和 LCDR3” 并且重链的3个⑶R称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶R含有与抗原形成特异相互作用的大多数残基。在LCVR和HCVR区域内的CDR氨基酸残基的编号和位置是根据公知的Kabat编号协定。轻链分为κ或λ，并且表征为本领域已知的特定恒定区。重链分为Y、μ、α、 δ或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以进一步划分为亚型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。每种重链类型表征为具有本领域公知序列的特定恒定区。如在此使用，术语“单克隆抗体”(Mab)指源自单拷贝或克隆包括如任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而并不是生产它的方法。本发明的Mab优选以均一的或基本上均一的群体存在。完整的Mab含有2条重链和2条轻链。此种单克隆抗体的“抗原结合片段” 包括例如，Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段和单链Fv片段。可以例如通过重组技术、噬菌体展示技术、合成技术如CDR-移植、或此类技术的组合或者其他本领域已知的技术来生产本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段。例如，可以用人DKK-I或其片段免疫小鼠，得到的抗体可以回收并纯化，并且可以通过在下面实施例中公开的方法来评估确定它们是否拥有与本文公开的抗体化合物相似或相同的结合和功能特性。抗原结合片段也可以通过常规方法来生产。生产和纯化抗体及抗原结合片段的方法是本领域公知的并且可见于，例如 Harlow禾口Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, H 5-8 以及 15 章，ISBN 0-87969-314-2。短语“嵌合抗体”指含有来自不同物种(一般是2种物种)的结构域的抗体。抗体 V是这样的嵌合抗体，其中轻链和重链可变结构域含有来自鼠抗体的残基，而恒定区轻链结构域含有包含大鼠κ轻链的残基，恒定区重链结构域含有包含大鼠IgGl抗体的残基。抗体V是小鼠/大鼠嵌合体，用于在长期的临床前模型中研究降低免疫应答可能性。短语“人工程化的抗体”指具有根据本发明的结合和功能特性，并且具有围绕源自于非人抗体的CDR的基本上是人的或者完全是人的框架区的单克隆抗体。此类人工程化的抗体的“抗原结合片段”包括例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。“框架区”或“框架序列”指框架区1至4中任一。本发明所涵盖的人工程化的抗体和其抗原结合片段包括其中框架区1至4中一或多个为基本上或完全是人源的分子，即其中存在任何的单个基本上是人源的或者完全是人源的框架区1至4的可能组合。例如，这包括其中框架区1和框架区2、框架区1和框架区3、框架区1、2和3等基本上是或者完全是人源的分子。基本上是人源的框架是与已知的人胚系框架序列具有至少约80%序列同一性的那些。 优选地基本上是人源的框架与已知的人胚系框架序列具有至少约85%、约90%、约95%或约99%的序列同一性。完全人框架是与已知的人胚系框架序列相同的那些。人框架胚系序列可以通过其 _立占 http //imgt. cines. fr ■自 ImMunoGeneTics (IMGT)，^#1 自 Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc 的 The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press,2001, ISBN 012441351o 例如，胚系轻链框架可以选自下组A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、 L12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02和08，并且胚系重链框架区可以选自下组VH2_5、VH2-26、 VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、 VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-5I。除了本文公开的那些，根据本发明展现类似功能特性的人工程化的抗体可以使用若干不同的方法来产生。本文公开的特定抗体化合物可用作模板或亲本抗体化合物，来制备其它的抗体化合物。在一种方法中，亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架中。新框架的序列同一性通常将与亲本抗体化合物中相应框架的序列有至少约80 %，至少约85 %，至少约90 %，至少约95 %或至少约99 %的同一性。这一移植可造成相比于亲本抗体而言减小的结合亲和性。如果是这种情况，那么可以根据Queen 等人，(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 J869公开的特定规则，将框架回复突变成亲本框架。描述用于人源化鼠抗体的其他参考文献包括美国专利No. 4，816，397 ；5, 225，539和 5,693，761 ；Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168 :595-620 所述的计算机程序 ABMOD 和 ENCAD ； 以及 Winter 和同事的方法(Jones 等人，(1986)Nature 321 :522-525 ;Riechmann 等人， (1988) Nature 332 :323-327 ；以及 Verhoeyen 等人，(1988) Science 239:1534-1536)。可以按照下面进行考虑用于回复突变的残基鉴定当氨基酸落入下述目录时，被使用的人胚系序列的框架氨基酸(“受体框架”)由来自亲本抗体化合物的框架的框架区氨基酸(“供体框架”)所替代(a)在该位置，受体框架的人框架区的氨基酸对于人框架是不寻常的，而在该位置供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人框架是典型的。(b)氨基酸的位置紧挨着⑶R之一；或者(c)在三维免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任何侧链原子都在约5-6埃(中心到中心)的CDR氨基酸的任何原子内。当受体框架的人框架区的每个氨基酸以及供体框架中的相应氨基酸在该位置对于人框架通常是不寻常的时，此氨基酸可以由在该位置对于人框架是典型的氨基酸所取代。这一回复突变原则使得其能够恢复亲本抗体化合物的活性。另一种产生与在此公开的抗体化合物展现相似的功能特性的人工程化的抗体的方法涉及随机突变移植CDR内的氨基酸而不改变框架，并且筛选与亲本抗体化合物一样好甚至比它们更好的结合亲和性以及其他功能特性的得到的分子。也可以在每个CDR内的每个氨基酸位置引入单突变，随后评估此种突变对结合亲和性以及其他功能特性的影响。产生改善的特性的单突变可以组合以评估它们与其他组合的作用。此外，前述两种方法的组合是可能的。在⑶R移植后，除了在⑶R中引入氨基酸改变外，可以使特异框架区回复突变。这一方法描述于mi等人，(1999) J. Mol. Biol.四4: 151-162。应用本发明的教导，本领域技术人员可以使用诸如定点诱变的常用技术来置换本发明公开的CDR和框架内序列的氨基酸，从而产生源自本发明序列的其他可变区氨基酸序列。所有可选的天然产生的氨基酸都可以被引入特异置换位点。在此公开的方法可以随后用于筛选这些其他的可变区氨基酸序列以鉴定具有所示体内功能的序列。以此方式，可以鉴定其他适于制备根据本发明的人工程化的抗体及其抗原结合部分的序列。优选地，框架内的氨基酸置换限于在此公开的4条轻链和/或重链框架内中任何一或多条内的一、二或三个位置。优选地，CDR内的氨基酸置换限于3条轻链和/或重链CDR中任何一或多条内的一、二或三个位置。上述这些框架区和⑶R内的多种改变的组合也是可能的。最优选的， 使用这些技术来产生其他可变区氨基酸序列，所述序列分别利用在SEQ ID N0:12和SEQ IDNO 14中描述的可变重链和轻链氨基酸序列。与本文公开的分子“竞争”的人工程化的抗体或其抗原结合片段是那些在与本发明分子结合的位点相同或重叠的位点结合人DKK-I (SEQ IDNO 29)的分子。通过例如抗体竞争测定，可以鉴别竞争性人工程化的抗体或其抗原结合片段。例如，将纯化的或部分纯化的人DKK-I (SEQ IDNO :29)样品结合在固体支持物上。然后添加本文公开的抗体和测试的单克隆抗体或抗原结合片段，其中标记了所述测试或本发明的抗体。如果标记的抗体和未标记的抗体结合DKK-I上分离的和不相连的位点，则不论是否存在怀疑的竞争性抗体，标记的抗体都以相同的水平结合。然而，如果相互作用位点是相同或重叠的，则未标记的抗体将发生竞争，与抗原结合的标记抗体的量将降低。如果存在过量的未标记抗体，则不会结合标记的抗体。出于本发明的目的，竞争性人工程化的抗体或其抗原结合片段是降低本发明抗体与DKK-I的结合约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约85 %、约90 %、约95 %或约 99%的抗体或其抗原结合片段。进行此类竞争性测定的方法细节是本领域普遍已知的，可见于例如 Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，第 567-569 页，ISBN 0-87969-314-2 中。通过使用纯化的抗体可以定量进行此类测定。通过用一种抗体滴定被标记的所述抗体的形式，来确立标准曲线。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与平板结合的能力。绘制所述结果，比较实现理想程度的结合抑制所必需的浓度。通过本文实施例中公开的方法，可以确定在此类竞争性测定中，与本发明的人工程化的抗体或其抗原结合片段竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段是否具有与本发明的人工程化的抗体相同或相似功能特性。术语“抑制”意指基本上拮抗、阻止、预防、限制、减慢、干扰、消除、终止、降低或逆转DKK-I的生物学效应的能力。术语“治疗”指这样的过程，所述过程涉及减慢、干扰、停止、控制、终止、降低或逆转症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度，但并非必需涉及完全消除与DKK-I活性相关的所有疾病相关症状、病况或病症。术语“预防”意指阻止、限制或抑制症状、病症、病况或疾病的出现或发生。可以治疗和预防急性事件和慢性病况。在急性事件中，在症状、病症、病况或疾病的开始时施用抗体或其抗原结合片段，当急性事件结束时停止。相反，在更延长的时间框架中治疗慢性症状、病症、病况或疾病。术语“有效量”指本发明抗体化合物的量或剂量，所述量或剂量在向患者的单次或多次剂量施用时，提供了理想的治疗或预防。本发明抗体化合物的治疗有效量可以包含单次剂量从约0. lmg/kg至约20mg/kg的范围内的量。可以通过健康护理供应商监控抗体化合物对生物标志物的效应，来确定对任何个体患者的治疗有效量。术语“骨骼愈合”指通过阻断DKK-1，在损伤位点刺激骨骼形成。骨骼愈合指征的实例包括但不限于骨折愈合、植入物固定/保持，和牙科植入物固定/保持。本发明的人工程化的抗体可用作通过多种途径施用的人药物中的药物。最优选的，此类组合物是用于肠胃外的施用的。此类药物组合物可通过本领域普遍已知的方法制备(参见例如，Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，(1995), A. Gennaro等人，Mack PublishingCo.)，并包含如本文公开的人工程化的抗体，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。下列测定的结果证实，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段可用作DKK-I抑制剂。本发明的抗体具有多种理想的特性。例如，本发明的抗体II具有增加的化学和物理稳定性，和溶解度。通过在不同的缓冲液条件下(pH和NaCl差异)孵育本发明的抗体，和在 4°C、25°C和40°C下孵育4周，来实施加速研究(Accelerated study)评估抗体的化学稳定性。通过阳离子交换(CEX)层析分离带电的变体(例如，天冬酰胺脱酰胺化为天冬氨酸) 和LC-MS分析鉴别降解的特定位点，来检测本发明抗体的化学修饰。抗体II具有通过CEX 检测的最少量的降解，该结果得到LC-MS数据的进一步验证，LC-MS数据显示，在40°C下pH 8的缓冲液中孵育4周后，相比本文所述的其他抗体，所述CDR中全部三个天冬酰胺残基具有最少量的脱酰胺化作用。当在PH 6+150mM NaCl下配制时，抗体II的溶解度比抗体I更有利。此外，储藏在4°C时，抗体II维持了 > 105mg/mL的溶解度，而抗体I的溶解度仅为 48mg/mL,并在这些相同的条件下沉淀。如本文中使用的，“EC50”指产生对所述物质的50% 的最大可能响应时的物质浓度。“Kd”指可以通过公式k。ff/k。n = Kd计算的平衡解离常数。实施例1——抗体的生产可以如下制造和纯化抗体I、II、III和IV。用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定的转染恰当的宿主细胞，例如HEK 293EBNA或CH0，所述表达系统使用优化的预先确定的 HC LC载体比例或者编码HC (例如SEQ IDNO 23或SEQ ID NO 24)和LC (例如SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 27或SEQ ID NO 28)的单个载体系统。使用多种常用技术的任一种纯化已分泌了抗体的澄清培养基。例如，常规的可将培养基用于已经用相容的缓冲液平衡了的蛋白A或G Sepharose FF柱，所述缓冲液例如磷酸盐缓冲的盐溶液(pH 7.4)。洗涤柱子，去除非特异性结合的组分。例如通过pH梯度(例如0. IM磷酸钠缓冲液， pH 6. 8至0. IM柠檬酸钠缓冲液，pH 3. 0)洗脱结合的抗体。例如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后混合。进一步的纯化是任选的，取决于预期的用途。可以使用常规技术浓缩和/ 或无菌过滤抗体。可以通过常规技术有效去除可溶性聚集物和多聚体，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换或羟磷灰石层析。在这些层析步骤之后的抗体纯度大于99%。产物可以在-70°C立即冷冻，或者可以冻干。下文提供了这些抗体的氨基酸序列。SEQ ID NOs
权利要求
1.人工程化的DKK-I抗体，或其抗原结合片段，所述抗体具有对于人DKK-I(SEQ ID NO 29)、猕猴 DKK-I (SEQ ID NO :30)、大鼠 DKK-1 (SEQ ID NO :31)、小鼠 DKK-1 (SEQ ID NO: 33)和兔 DKK-1 (SEQ IDNO 32)而言小于 5. OX IiT11M 的 Kd0
2.权利要求1的人工程化的抗体或其抗原结合片段，其中Kd是使用KinExA3000仪器在37 °C下确定的。
3.权利要求1或2的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区 (LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包括互补决定区(⑶R)IXDR1、IXDR2和IXDR3，且 HCVR 包括 CDR HCDRUHCDR2 和 HCDR3，其中 LCDRl 具有 SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，HCDRl 具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列和HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
4.权利要求3的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中IXDRl具有SEQID NO 5的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列，HCDRl具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列和HCDR3具有SEQ ID NO 44的氨基酸序列。
5.权利要求3或4的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，其中IXDR1、IXDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2和HCDR3具有选自以下的氨基酸序列(i)LCDRl 是 SEQ ID NO :5，LCDR2 是 SEQ ID NO :6，LCDR3 是 SEQ ID NO -J, HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 3 ；(ii)LCDRl 是 SEQ ID NO :5，LCDR2 是 SEQ ID NO :8，LCDR3 是 SEQ ID NO :7，HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 4 ；(iii)LCDRl 是 SEQ ID NO 5，LCDR2 是 SEQ ID NO :6，LCDR3 是 SEQ ID NO :9，HCDRl 是 SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO 3 ；(iv)LCDRl是 SEQ ID NO 5，LCDR2 是 SEQ ID NO 10，LCDR3 是 SEQ ID NO 9, HCDRl Mi SEQ ID NO :1，HCDR2 是 SEQ ID NO :2，禾口 HCDR3 是 SEQ ID NO :3。
6.权利要求3或4的人工程化的DKK-I抗体，其中LCVR包括SEQIDNO 52的氨基酸序列，且HCVR包括SEQ ID NO :51的氨基酸序列。
7.权利要求3至6的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中LCVR包括选自SEQID NO 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。
8.权利要求3至7的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中HCVR包括选自SEQID NO: 11和SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
9.权利要求3至8的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中LCVR和HCVR包括选自以下的氨基酸序列(i)包括SEQID N0:13的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的 HCVR ；(ii)包括SEQID NO 14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列的 HCVR ；(iii)包括SEQID NO 15的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO :11的氨基酸序列的 HCVR ；(iv)包括SEQID NO 16的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO 11的氨基酸序列的 HCVR0
10.权利要求9的人工程化的DKK-I抗体，其中LCVR包括SEQIDNO 14的氨基酸序列， 且HCVR包括SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
11.权利要求3至9的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21和SEQ ID NO 22的氨基酸序列。
12.权利要求3至9或权利要求11的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ IDNO 17和SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
13.权利要求3至9或权利要求11至12的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其中人工程化的DKK-I抗体包含选自以下的重链和轻链氨基酸序列a.包括SEQID NO: 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链；b.包括SEQID NO 18的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO :20的氨基酸序列的轻链；c.包括SEQID NO 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO :21的氨基酸序列的轻链；和d.包括SEQID NO 17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO :22的氨基酸序列的轻链。
14.权利要求3至13的任一项的人工程化的DKK-I抗体，其包括两条轻链和两条重链， 其中每条轻链包括SEQ ID NO :20的氨基酸序列，其中每条重链包括SEQ ID N0:18的氨基酸序列。
15.抗体或其抗原结合片段，通过抗体竞争测定确定的，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求3至14的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段竞争结合人 DKK-I(SEQ ID NO 29)。
16.药物组合物，其包括权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17.药物组合物，其包括权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以及任选的其它治疗性成分。
18.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于治疗。
19.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于骨骼愈合的治疗。
20.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段在生产用于骨骼愈合的药物中的用途。
21.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于癌症治疗中。
22.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用于癌症治疗中，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
23.权利要求1-15的任一项的人工程化的DKK-I抗体或其抗原结合片段在生产用于治疗癌症的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
全文摘要
本发明提供了与人DKK-1结合并抑制其活性的人工程化的抗体及其抗原结合片段，并且它们在治疗发病机理是由DKK-1介导的疾病中是有效的。
文档编号C07K16/18GK102388065SQ201080015994
公开日2012年3月21日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月10日
发明者B·A·斯万森, M·谢迪德, R·J·达林, R·J·高尔文 申请人:伊莱利利公司