专利名称：拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及拟穴青蟹基因工程，特别涉及拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用。
背景技术：
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属于梭子蟹科(Portunidae)暖水广盐性海洋蟹类，在中国大陆东南沿海分布最广，数量最多。随着拟穴青蟹集中养殖规模地不断扩大，由细菌、真菌和病毒等因素引起的疾病对蟹类养殖业带来巨大损失。众所周知，甲壳类动物主要依靠先天性免疫系统来抵御外界病原微生物，多种先天性免疫因子参与其抗感染过程，包括凝集素(agglutinin)、溶血素(hemolysin)、溶菌酶(lysozeme)、酚氧化酶 (phenoloxidase)系统、蛋白酶抑制剂、抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)等。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharidefactor, ALF)是最初发现于當(1. TanakaS, Nakamura T, Morita T, Iwanaga S. Limulus anti-LPS factor :an anticoagulant which inhibits the endotoxin mediated activation of Limulus coagulation system[J]. Biochem Biophys Res Commun,1982,105(2) :717-723)体内 的一种抗菌肽，与细胞内毒素(脂多糖，LPS)具有高亲和力，已证明它具有结合LPS的类脂A部位并能够在体外中和LPS的生物学活性，通过一些动物模型的体内研究，发现鲎抗脂多糖因子(LALF)和其环肽部分(LALF31-52，LALF35-52)在内毒素血症和对抗内毒素休克的效用。随后的研究也表明，鲎抗脂多糖因子(LALF)对R-型革兰氏阴性菌生长具有强烈的抑制作用，故认为LALF具有免疫调控功能，并对鲎抵御病原微生物感染具有重要意义。近年来，研究者们陆续从中国明对虾O.Liu F，Liu Y，Li F，Dong B，Ximg J. Molecular cloning and expression profile of putative antilipopolysaccharide factor in Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis)[J]Mar Biotechnol(NY)，2005， 7(6) :600-608)、南美白对虾(3.Vega Edl, 0，Leary NA，Shockey JE，Robalino J，Payne C，Browdy CL, Warr GW, Gross PS. Anti-lipopolysaccharide factor in Litopenaeus vannamei(LvALF) :a broad spectrum antimicrobial peptide essential for shrimp immunity against bacterial and fungal infection[J]. Mol Immunol,2008,45 (7) 1916-1925)、 草虫下(4.Somboonwiwat K， Marcos M， Tassanakajon A， Klinbunga S， Aumelas A， Romestand B， Gueguen Y， Boze H， Moulin G， Bachere E.Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide factor(ALF) from the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol，2005，29(10) 841-851) ^ (5. Yue F, Pan L, Miao J, Zhang L， Li J. Molecular cloning, characterization and mRNA expression of two antibacterial peptides :Crustin and anti-lipopolysaccharide factor in swimming crab Portunus trituberculatus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B :Biochemistry and Molecular Biology, 2010,156 (2) :77-85.)、中华绒螯蟹(6. Li C，Zhao J，Song L，Mu C，Zhang H，GaiY，Qiu LjYu Y，Ni DiXing K. Molecular cloning，genomic organization and functional analysis of an anti~lipopolysaccharide factor from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J]. Dev Comp Immunol，2008，32 (7) :784-794.)、锯缘青蟹(7. Yedery RD,Reddy KV. Identification,cloning,characterization and recombinant expression of an anti-lipopoIysaccharide factor from the hemocytes of Indian mud crab， Scylla serrata[J]. Fish Shellfish Immunol,2009,27(2) :275_284·)、日本囊对虾 (8. Mekata Τ,Sudhakaran R，Okugawa S，Kono T，Sakai M，Itami Τ. Molecular cloning and transcriptional analysis of a newly identified anti-lipopoIysaccharide factor gene in kuruma shrimp,Marsupenaeus japonicus[J]Lett Appl Microbiol，2010，50(1) 112-119.)等其他甲壳动物分离鉴定了抗脂多糖因子。
发明内容
本发明的目的在于提供拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用。 根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和抗脂多糖因子 -Iipopolysaccharide factor, ALF)可将拟穴青蟹抗脂多糖因子简写为Sp-ALF。 所述拟穴青蟹抗脂多糖因子的基因序列为
cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa t 所述拟穴青蟹抗脂多糖因子的氨基酸序列为 Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr
1
Trp
Arg Arg
5
His Asn Asn 20 Lys
10
Gly His
Cys 50
Ser
Pro
35
Pro
Ser Val Asp Phe Met 25
Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr 40
Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg 55
Glu Ala lie
Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp 7075
Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala 8590
Thr Cys His 30
His Glu Gly 45
Ser Arg Thr 60
Phe Val Arg Thr Val Trp
Trp
Arg 65 Leu
Asn
所述拟穴青蟹抗脂多糖因子的制备方法包括以下步骤
1)构建拟穴青蟹抗脂多糖因子重组表达载体；
2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得
Gly Leu 15
Phe Arg
Lys Phe
Lys Ser
Lys Ala 80 Val Asn 95
60 120 180 240 291
表达产物；
4
3)分离纯化步骤幻所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗脂多糖因子。在步骤1)中，所述表达载体可选用pPICTk等。在步骤幻中，所述宿主细胞可为毕赤酵母等。在步骤幻中，所述分离纯化可为先将表达产物进行透析，再进行亲和层析。所述拟穴青蟹抗脂多糖因子对革兰氏阴性菌弗氏志贺氏菌、解藻朊酸弧菌、副溶血性弧菌、施氏假单胞菌和荧光假单胞菌，革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌具有明显抑制生长作用和杀菌作用，在制备抑菌新药和作为动物饲料抗菌添加剂中具有潜在的应用价值。本发明分离出拟穴青蟹抗脂多糖因子Sp-ALF的基础上，根据Sp-ALF基因序列特征成功构建重组表达载体并在毕赤酵母系统中表达并纯化获得Sp-ALF蛋白，该重组蛋白具有广谱的抗菌活性，表明Sp-ALF可能广泛参与了拟穴青蟹抗微生物感染的先天免疫反应，重组蛋白在动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物开发上显示出诱人的应用前景。
图1为pPICTk载体双酶切前后电泳图谱。1为酶切前的pPICTk载体；2为酶切后 pPIC9k 载体，bp 为碱基，2000 为分子量；M 为 DS2000DNA Marker。图 2 为表达载体 pPIC9k、pPIC9k/Sp-ALFl 和 pPIC9k/Sp_ALF2Sal I 线性化前后电泳图谱。1 为 pPIC9k，2 为酶切后 pPIC9k，3 为 pPIC9k/Sp_ALF，4 为酶切后的 pPIC9k/Sp_ALF， M 为 DS2000DNA Marker, bp 为碱基，2000 为分子量。图3为pPIC9k/Sp_ALF重组毕赤酵母克隆子甲醇诱导表达检测SDS-PAGE电泳图谱。1为诱导前表达情况；2 4分别为甲醇诱导12h、Mh、48h的表达产物；M为SDS-PAGE 标准蛋白质Marker，18和14为电泳的重组蛋白Sp-ALF。图4为pPIC9k/Sp_ALF重组毕赤酵母甲醇诱导表达产物纯化检测电泳图谱。1 上样前产物；2 3 穿过峰的产物；4 8 溶液D洗脱峰的产物；M =SDS-PAGE标准蛋白质 Marker, 18和14为电泳的重组蛋白Sp-ALF。
具体实施例方式以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。实施例1拟穴青蟹抗脂多糖因子Sp-ALF真核重组表达载体的构建根据pPIC9k载体多克隆位点，设计扩增编码拟穴青蟹Sp-ALF(cDNA)基因ORF的特异性上游引物Fl和下游引物R1。在上游引物Fl的5'端添加SnaB I酶切位点和编码 His-tag的碱基；在下游引物Rl的5'端添加终止密码子和Avr II酶切位点上游引物Fl:5' -CGTACGTACACCATCATCATCATCATCAGTATGAAACTCTGATAG-3'，下游引物Rl:5' -AA CCTAGGTTAATTATTCACCCACACCGTAG-3‘。扩增Sp-ALF的编码区片段。PCR反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，重复30个循环；72°C延伸IOmin。将PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，回收的PCR产物用SnaB I和Avr II 进行酶切后纯化回收，与用SnaB I和Avr II双酶切线性化pPICTk载体连接，构建好酵母表达重组载体pPIC9k/Sp-ALF，点样进行电泳检测(参见图1)。实施例2pPIC9k/Sp_ALF重组质粒在毕赤酵母GS 115中的诱导表达
用Ml I对测序正确的质粒pPIC9k/Sp_ALF进行酶切线性化(参见图2)，再将其用电击法转化至毕赤酵母GSl 15感受态细胞中，并诱导表达。以pPICTk空质粒转化的毕赤酵母GSl 15为对照，以pPIC9k/Sp_ALF重组质粒转化的毕赤酵母GS115为实验组，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达。结果显示，以pPIC9k/Sp_ALF重组质粒转化的毕赤酵母GSl 15在经过诱导后与诱导前相比具有明显的蛋白质诱导表达，蛋白条带在14kDa左右(参见图幻，与计算的理论分子量相似，另外重组子的诱导表达产物中还有一条ISkDa左右大小的条带，经质谱鉴定后亦为Sp-ALF，推测是表达分泌过程中可能发生潜在的糖基化修饰。实施例3pPIC9k/Sp-ALF重组质粒在毕赤酵母GS115中诱导表达产物的纯化及抗菌活性鉴定 1、亲和层析法纯化目的蛋白将重组阳性毕赤酵母GS115菌株大量诱导表达后，离心去除菌体收集培养基上清 1L，PBS透析两次(12h换一次新透析液)后，4°C，12000rpm离心35min，取上清，得到上柱样品。接着采用金属鏊合层析柱对透析后的蛋白进行亲和层析。收集洗脱峰，经SDS-PAGE 电泳分析及质谱鉴定为Sp-ALF重组蛋白(参见图4)。2、Sp-ALF重组蛋白抗菌活性鉴定应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线。根据公式可计算出 Sp-ALF重组蛋白的浓度。Sp-ALF重组蛋白抗菌活性的测定目的蛋白的稀释按照最低抑菌浓度(MIC)设定浓度进行，用口皿为单位进行稀释配比，如25、12.5、6.25、3. 12和1.6μΜ为梯度在96孔微量培养板上进行。蛋白样品要经过0. 22 μ m过滤膜过滤除菌菌再进行稀释配比，每个浓度设置一个平行孔。取被测细菌，在MH或2216平板上划线，倒置培养12 16h;挑取单克隆接种于MH或2216斜面，继续培养过夜达到中期对数生长阶段；用DPBS (1. 58mM NaH2PO4, 8. 42mMNa2HP04,pH 7. 2 7. 4)清洗斜面培养物，调整稀释至 OD600 = 0. 1，取 18 μ 1 OD600 = 0. 1的稀释菌加入终体积为Iml的MH稀释培养基(DPBS :600μ 1,MH :400 μ 1)中，该菌浓度则为MIC工作浓度。其中大肠杆菌模式株、谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和弗氏志贺氏菌培养温度为37°C，副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、荧光假单胞菌和施氏假单胞菌培养温度为^°C。MIC在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，加样体系分别为①空白对照组力卩50 μ 1蛋白样品和50 μ 1 DPBS ；②阴性对照组力口 50 μ 1菌悬液和50 μ 1 DPBS ；③样品实验组加50 μ 1待测各浓度蛋白样品和50 μ 1菌悬液。28 "C 培养 24h 后，判定 Sp-ALF 重组蛋白对细菌的 MIC (Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌浓度)，判定标准为该浓度细菌数少于或等于对照(未添加抗菌肽)中的一半。利用测定最小抑菌浓度(MIC)以上各孔培养物，分别吸取5μ1，移种在琼脂培养基上，经孵育过夜，判定Sp-ALF重组蛋白对细菌的MBC (Minimum Bactericidal Concentration，最低杀菌浓度)，即杀死某种菌株的药物最低浓度。
6
结果显示，真核表达的Sp-ALF蛋白产物能够对受试菌大肠杆菌模式株、弗氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、解藻朊酸弧菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌，谷氨酸棒杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌(均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)均具有较强杀伤作用(参见表1)。表 权利要求
1.拟穴青蟹抗脂多糖因子，其特征在于所述拟穴青蟹抗脂多糖因子的基因序列为 c
2.如权利要求1所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子，其特征在于所述拟穴青蟹抗脂多糖因子的氨基酸序列为
3.如权利要求1所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)构建拟穴青蟹抗脂多糖因子重组表达载体；2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤幻所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗脂多糖因子。
4.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤1)中， 所述表达载体选用pPICTk。
5.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤2)中， 所述宿主细胞为毕赤酵母。
6.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子的制备方法，其特征在于在步骤3)中， 所述分离纯化为先将表达产物进行透析，再进行亲和层析。
7.如权利要求1所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子在制备抑菌药中的应用。
8.如权利要求1所述的拟穴青蟹抗脂多糖因子在制备动物饲料抗菌添加剂中的应用。
全文摘要
拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用。涉及拟穴青蟹基因工程，提供拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用。制备方法包括以下步骤构建拟穴青蟹抗脂多糖因子重组表达载体；将所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化步所得的表达产物，获得重组蛋白，即拟穴青蟹抗脂多糖因子。拟穴青蟹抗脂多糖因子对革兰氏阴性菌弗氏志贺氏菌、解藻朊酸弧菌、副溶血性弧菌、施氏假单胞菌和荧光假单胞菌，革兰氏阳性菌谷氨酸棒杆菌具有明显抑制生长作用和杀菌作用，在制备抑菌药和作为动物饲料抗菌添加剂中具有潜在的应用价值。
文档编号C07K14/435GK102212124SQ201110127379
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者丁建, 刘海鹏, 王克坚, 陈荣元 申请人:厦门大学