HLA-A^*3303限制性WT1肽和包含此肽的药物组合物的制作方法

专利名称：HLA-A^*3303限制性WT1肽和包含此肽的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及HLA-A*3303限制性肽，具体地说所述肽包含由来自WTl蛋白的9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸选自Ala、lie、Leu、Val, Phe, Tyr, Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。此外，本发明还涉及编码此肽的多核苷酸和包含此肽的用于治疗或预防癌症的药物组合物等等。
背景技术：
WTl基因(Wilms肿瘤1基因(Wilms' tumor Igene))被认为是导致Wilms肿瘤即儿童肾癌的基因(非专利文献1和2)。WTl是具有锌指结构的转录因子。WTl基因起初被认为是肿瘤阻抑基因。然而随后的研究(非专利文献3、4、5和6)表明WTl基因在造血肿瘤和实体癌中起癌基因的作用。
WTl基因在许多类型的恶性肿瘤中高水平表达。对作为自体蛋白的未突变WTl基因产物在活体中是否具有免疫原性已做了验证。这些结果表明了在肿瘤细胞中高水平表达的 WTl基因所表达的蛋白经过在细胞内的加工而被片段化。产生的肽和MHC I类分子形成复合体，该复合体被呈递到细胞表面，通过肽的接种可以诱导识别该复合体的CTL(非专利文献7、8和9)。同样表明用WTl肽或WTl的cDNA免疫小鼠，被移植的表达WTl基因的肿瘤细胞被高几率地排斥(非专利文献7和10)；而生理性地表达WTl基因的正常组织没有受到被诱导的CTL的破坏(非专利文献7)。体外人类细胞的实验表明当具有结合HLA-A*0201分子(人类MHC I类分子之一)的高能力的DbU6肽或WH187肽(SEQ ID No 1的第187-195 位的氨基酸，SLGEQQYSV)用于刺激具有HLA-A*0201的人类外周血单核细胞时，WTl-特异性CTL被诱导。被诱导的CTL具有对高水平地内源表达WTl基因的肿瘤细胞特异的细胞毒活性，该CTL的细胞毒活性是HLA-A2限制性的(非专利文献11)。人类细胞的体外实验表明使用匹配HLA-A*2402(其是HLA-A等位基因之中最频繁地出现在日本人中的)的 WTl肽(WTl235 ；SEQ ID No 1的第235-243位的氨基酸，CMTWNQMNL)，可以诱导WTl特异性 CTL(TAK-I)(非专利文献12)。被诱导的CTL并不阻抑部分地生理表达WTl基因的正常造血干细胞形成集落的活性。这些报道强烈地表明WTl特异性CTL不止可以在小鼠中诱导而且可以在人类中诱导。此CTL具有抗高水平表达WTl基因的肿瘤细胞的细胞毒活性，但不具有抗生理地表达WTl基因的正常细胞的细胞毒活性。(非专利文献7、10、11、12、13和14)。WTl基因产物作为核内蛋白被呈递并在细胞质内经蛋白酶体加工而片段化成肽。片段化的肽被TAP (与抗原加工有关的转运体)转运到内质网腔中，与MHC I类分子形成复合体并呈递到细胞表面。出于CTL前体细胞经由TCR而识别WTl肽-MHC I类分子复合体的结果，WTl特异性CTL被诱导，从而施加细胞毒的作用于通过MHC I类分子呈递WTl基因产物的肿瘤细胞(非专利文献7、8和9)。那么，定靶WTl基因产物的癌症免疫疗法中所使用的 WTl肽至少需要是在活体中结合MHC I类分子的形式。然而MHC I类分子是多种多样的而且结合各自的MHC I类分子的WTl肽的氨基酸序列也是互不相同的。因此，需要提供与各自的MHC I类亚型匹配的肽。然而，迄今仅知道HLA-A1402分子限制性肽、HLA-A*0201分子限制性肽和HLA-AieOl分子限制性肽是HLA分子限制性的WTl肽(分别见专利文献1、 非专利文献11和专利文献2、。HLA-A*3303以紧随HLA_Ai402之后的最高百分比出现在日本人中。因此，有必要找出HLA-A*3303限制性的WTl肽。 专利文献 1 :W0 2003/106682 专利文献 2 :W0 2005/095598
非专利文献 1 :Daniel A. Haber 等·，Cell. 1990Jun 29 ；61 (7) :1257-69. 非专利文献 2 =Call KM 等·，Cell. 1990Feb9 ；60 (3) :509-20. 非专利文献 3 =Menke AL 等·，Int Rev Cytol. 1998 ；181 :151-212.综述· 非专利文献 4 Yamagami T 等.，Blood. 1996Apr 1 ；87 (7) :2878-84. 非专利文献 5 Inoue K 等·，Blood. 1998Apr 15 ；91 (8) :2969-76. 非专利文献 6 =Tsuboi A 等.，Leuk Res. 1999May ；23 (5) :499-505. 非专利文献 7 :0ka Y 等·，J Immunol. 2000Feb 15 ； 164 (4) :1873-80. 非专利文献 8 =Melief CJ 等.，Immunol Rev. 1995Jun ； 145 :167-77. 非专利文献 9 =Ritz J, J Clin Oncol. 1994Feb ； 12 (2) :237-8. 非专利文献 10 =Tsuboi A 等·，J Clin Immunol. 2000May ；20 (3) :195-202. 非专利文献 11 :0ka Y 等·，Immunogenetics. 2000Feb ；51 (2) :99-107. 非专利文献 12 =Ohminami H 等·，Blood. 2000Jan 1 ；95(1) :286-93. 非专利文献 13 :Gao L 等·，Blood. 2000Apr 1 ；95 (7) :2198-203. 非专利文献 14 =Ohminami H 等·，Blood. 2000Jan 1 ；95(1) :286-93. 发明公开
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是提供HLA-A*3303限制性的WTl肽和编码此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苷酸的用于治疗/预防癌症的药物组合物等等。 解决问题的方法
技术领域：
本发明人针对以上描述的情况做了深入的研究，结果发现具以下特征的肽能够高效诱导WTl特异性CTL 包含由来自WTl蛋白的9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸选自Ala、lie、Leu、Val, Phe, Tyr, Ser和Asp并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。因此，本发明已被完成。
本发明提供
(1)包含由来自WTl蛋白的9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸选自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp并且在氨基酸序列中第 9位氨基酸的是Arg;
(2)(1)中的肽，其中氨基酸序列选自
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、
Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)、
Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID No :4)和
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)；
(3)(2)中的肽，其中氨基酸序列是 Ser Asp Gln Leu Lys Arg His GlnArg(SEQ ID No :4)；
(4)用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组合物包含(1)中的肽；
(5)用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括对HLA-A*3303阳性受试者施用有效量的中的药物组合物；
(6)(1)中的肽在制备中的药物组合物中的应用；
(7)编码(1)中的肽的多核苷酸；
(8)包含(7)中的多核苷酸的表达载体；
(9)用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组合物包含(7)中的多核苷酸或者 (8)中的载体；
(10)治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的(9)中的药物组合物给予 HLA-A*3303阳性受试者。
(11)(7)中的多核苷酸或(8)中的载体在制备(9)中的药物组合物中的应用；
(12)WTl特异性CTL，其可通过(1)中的肽诱导；
(13)用于诱导WTl特异性CTL的方法，所述方法包括在(1)中的肽存在下培养外周血单核细胞以使其从外周血单核细胞诱导成为WTl特异性CTL ；
(14)用于诱导WTl特异性CTL的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的⑴中的肽；
(15)呈递WTl肽的抗原呈递细胞，其可通过(1)中的肽诱导；
(16)诱导呈递WTl肽的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在(1)中的肽存在下培养未成熟的抗原呈递细胞使之从未成熟的抗原呈递细胞诱导成为呈递WTl肽的抗原呈递细胞；
(17)诱导呈递WTl肽的抗原呈递细胞的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的(1) 中的肽；
(18)用于诊断癌症的方法，所述方法包括使用(12)中的CTL或者(15)中的抗原呈递细胞；
(19)用于测定WTl特异性CTL在HLA-A*3303阳性受试者中存在或量的方法，所述方法包括
(a)使WTl肽和HLA-A*3303分子的复合体与来自受试者的样品反应；
(b)测定识别样品中含有的复合体的CTL的存在或量；
(20)(19)中的方法，其中所述复合体是四聚体的形式。
发明效果
本发明提供了 HLA-A*3303限制性WTl肽、编码此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苷酸的用于治疗或预防癌症的药物组合物等等。因此有可能在具有HLA-A*3303的受试者的体内或体外诱导WTl特异性CTL。因为约的日本人具有至少一个HLA-A*3303分子， 所以可以在非常广范围的受试者中诱导WTl特异性CTL。
附图简述


图1代表用WTl337诱导的CTL的细胞毒活性。 图2代表用WTl364诱导的CTL的细胞毒活性。 图3代表用WTl367诱导的CTL的细胞毒活性。 图4代表用WTl4tl9诱导的CTL的细胞毒活性。
图5代表用WTl364诱导CTL的抗内源表达WTl基因的细胞的细胞毒活性。 图6代表用WTl367诱导CTL的抗内源表达WTl基因的细胞的细胞毒活性。 图7代表用WTl4tl9诱导CTL的抗内源表达WTl基因的细胞的细胞毒活性。 图8代表用WTl367诱导CTL的抗表达WTl基因的细胞的细胞毒活性。 实施本发明的最佳模式
人类WTl蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID No:l。WTl基因以其天然的形式高水平地表达于例如，诸如白血病、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤的造血肿瘤中以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、 膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌的实体癌中。此外对HLA-A*3303的锚定基序的特征为第2位的氨基酸是Ala、lie. Leu, Val, Phe, Tyr, Ser和Asp中的任意一个并且第 9位的氨基酸是Arg。因此另一方面，本发明涉及HLA-A*3303限制性WTl肽，所述肽包含由来自WTl蛋白的9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸优选选自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸优选Arg (下文称为肽)。
本发明的肽所包含的由9个氨基酸组成的氨基酸序列优选是LeuSer His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)、Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID No :4)或者 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。最优选是 kr Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg(SEQ ID No 4)。此外，在SEQ ID No :2-5中任一个的9个氨基酸中，可以用其他氨基酸代替一个至多个，优选一个至五个氨基酸。可以适当地修饰9个氨基酸的任意一个或者其他代替的氨基酸。在任何情况下本发明的肽保持结合HLA-A*3303分子的能力。
如前文所述，本发明的目的是要获得HLA-A*3303限制性WTl肽。因此，本发明的肽可以是任何一种，只要此肽包含来自WTl蛋白的氨基酸序列并且是由9个连续的氨基酸组成。 因此，本发明的肽可以是例如仅由在SEQ ID No :2-5的任意一个中所表示的氨基酸序列的肽、包含在SEQ ID No :2-5的任意一个中所表示的氨基酸序列的WTl蛋白或其部分。可以在本发明的肽中由9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端连接各种物质。例如可以连接氨基酸、肽或者所述的氨基酸或肽类似物。倘若使这些物质连接到本发明的肽，则它们可以被加工，例如通过活体中的酶或者通过诸如细胞内加工的加工过程，最后可以产生此由9个连续的氨基酸组成的氨基酸序列并与HLA-A*3303分子作为复合体被呈递到细胞表面，从而达到诱导CTL的效果。这些物质可以是调节本发明的肽的溶解性的物质或者是增加所述肽的稳定性(对蛋白酶的抗性等等)的物质。或者这些物质可以是特异性地传递本发明的肽的物质，例如传递到特定的组织或者器官；或者它们可以具有提高被抗原呈递细胞摄取效率的作用等等。这些物质可以是诸如辅助肽等能提高诱导CTL 能力的物质。
本发明的肽可以通过在本领域中所使用的一般的方法或其修改形式合成。所述方法描述于例如 P印tide Synthesis (Jft合成)，Interscience, New Y 或 k (纽约)，1966、The Proteins (蛋白)，Vol 2 (第 2卷)，Academic Press Inc.(学术出版社公司)，New York(M ), 1976> Peptide-Gosei, Maruzen Co. , Ltd. (Maruzen 有限公司)，1975、P印tide—Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co.，Ltd. (Maruzen 有限公司)，1985 禾口 Iyakuhin No Kaihatsu(Zoku), Vol.14(第 14 卷)，Peptide-Gosei, Hirokawa-Book store (Hirokawa 书店)，1991。
本发明的肽同样可以根据编码本发明的肽的核苷酸序列信息使用基因工程技术制备。 所述基因工程技术为本领域技术人员所熟知。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组合物包含 HLA-A*3303限制性WTl肽。WTl基因高水平地表达于例如白血病、骨髓增生异常综合征、 多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤的造血肿瘤中以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、 肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌的实体癌中。因此本发明的药物组合物可以应用于治疗或预防癌症。当将本发明的药物组合物给予HLA-A*3303阳性受试者时，WTl特异性CTL被包含在药物组合物中的HLA-A*3303限制性WTl肽所诱导，并由这种 CTL破坏受试者的癌细胞。
除作为有效成分的HLA-A*3303限制性WTl肽以外，本发明的药物组合物还可以包含 例如载体、赋形剂等。包含在本发明的药物组合物中的HLA-A*3303限制性WTl肽诱导WTl 特异性CTL。因此本发明的药物组合物可以包含合适的佐剂或者可以与合适的佐剂一起给药以增强诱导效果。优选佐剂的实例包括但不限于完全的或不完全的弗氏佐剂和氢氧化
ο
本发明的药物组合物的给药方法可以根据以下条件适当地作出选择例如疾病类别、 受试者的状态或靶位点。所述方法的实例包括但不限于皮内给药、皮下给药、肌内给药、静脉给药、鼻内给药以及口腔给药。包含在本发明的药物组合物中肽的含量，以及本发明的药物组合物的剂型、给药次数等等可以根据以下条件适当地作出选择例如疾病类别、受试者的状态或靶位点。肽的单次剂量通常是0. OOOlmg-lOOOmg，优选0. OOlmg-lOOOOmg。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的药物组合物给予HLA-A*3303阳性受试者。待治疗或预防的癌症可以是任何一种，其实例包括诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤的造血肿瘤以及诸如胃癌、结肠癌、 肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌的实体癌。
另一方面，本发明涉及HLA-A*3303限制性WTl肽在制备药物组合物中的应用。
再一方面，本发明涉及用于测定WTl特异性CTL在HLA-A*3303阳性受试者中的存在或量的方法，所述方法包括
(a)使WTl肽和HLA-A*3303分子的复合体与来自受试者的样品反应；
(b)测定识别样品中含有的复合体的CTL的存在或量。取自受试者的样品可以是任何一种，只要样品中有可能含有淋巴细胞。样品的实例包括诸如血液或淋巴的体液和组织。 WTl肽和HLA-A*3303分子的复合体可以按以下方式制备例如使用诸如生物素_链霉亲和素法的本领域技术人员所熟知的方法制备为四聚体或者五聚体。识别此复合体的CTL的存在或量可以通过本领域技术人员所熟知的方法检测。本发明的此方面中，此复合体可以被标记。诸如荧光标记或者放射性标记的众所周知的标记可以用作标记。通过标记使CTL存在或量的测定简易快速。本发明的此方面的方法可以用于诊断癌症、预测癌症等等。
因此本发明同样提供了用于测定WTl特异性CTL在HLA-A*3303的阳性受试者中的存在或量的组合物，所述组合物包含WT1肽与HLA-A*3303分子的复合体。
此外本发明提供了用于测定WTl特异性CTL在HLA-A*3303的阳性受试者中的存在或量的试剂盒，所述试剂盒包含WT1肽与HLA-A*3303分子的复合体。
再一方面，本发明涉及用于使用WTl肽与HLA-A*3303分子的复合体产生WTl特异性CTL 的方法，所述方法包括
(a)使复合体与样品反应；
(b)获得识别样品中含有的复合体的CTL。WTl肽与HLA-A*3303分子的复合体在上文已做描述。样品可以是任何一种，只要样品中有可能含有淋巴细胞。样品的实例包括诸如血液的来自受试者的样品和细胞培养物。识别复合体的CTL可以通过使用诸如FACS或者 MACS的本领域技术人员所熟知的方法获得。本发明使得能够培养获得的WTl特异性CTL并用其治疗或预防各种癌症。
因此本发明同样涉及WTl特异性CTL，其可通过使用WTl肽与HLA-A*3303分子的复合体产生WTl特异性CTL的方法获得。此外本发明涉及用于产生WTl特异性CTL的试剂盒，所述试剂盒包含WTl肽与 HLA-A*3303分子的复合体。
另一方面，本发明涉及编码HLA-A*3303限制性WTl肽的多核苷酸(下文称为WTl多核苷酸)。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本发明的多核苷酸的碱基序列可以基于 HLA-A*3303限制性WTl肽的氨基酸序列而确定。所述多核苷酸可以通过例如合成DNA或 RNA的方法、PCR法等方法制备。
另一方面，本发明涉及包含此多核苷酸的表达载体(下文称为WTl表达载体)。表达载体的类别、所包含的除此多核苷酸序列以外的序列等可以根据引入本发明的表达载体的宿主类型、使用意图等而适当地进行选择。有可能通过将本发明的表达载体给予HLA-A*3303 阳性受试者以在活体中产生WTl肽并诱导WTl特异性CTL，随后通过破坏受试者中的造血肿瘤细胞或实体癌细胞，从而治疗或预防造血肿瘤或实体癌。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组合物包含WTl 多核苷酸或WTl表达载体。这个方面中的本发明的药物组合物的组成、施用方法等均已在上文描述。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的包含 WTl肽或WTl表达载体的药物组合物给予HLA-A*3303阳性受试者。待治疗或预防的癌症的实例包括诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤的造血肿瘤以及诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌的实体癌。
另一方面，本发明涉及WTl多核苷酸或WTl表达载体在制造包含WTl多核苷酸或WTl 表达载体的药物组合物中的应用。
另一方面，本发明涉及含有表达载体的细胞。本发明的细胞可以通过以下方式制备例如通过用表达载体转化诸如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞的宿主细胞。用于将表达载体导入宿主细胞的方法可以适当地选自各种方法。通过培养转化过的细胞、回收并纯化产生的WTl肽，本发明的肽得以制备。
再一方面，本发明涉及WTl特异性CTL，其通过HLA-A*3303限制性WTl肽诱导。本发明的CTL识别WTl肽和HLA-A*3303分子的复合体。因此本发明的CTL可以应用于特异性地破坏HLA-A*3303阳性并高水平表达WTl的肿瘤细胞。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将WTl特异性CTL 给予HLA-A*3303阳性受试者。给予WTl特异性CTL的方法可以根据以下条件适当地选择 例如疾病的类型、受试者的状态或靶位点。此方法的实例包括但不限于静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药、鼻内给药和口腔给药。
另一方面，本发明涉及用于诱导WTl特异性CTL的方法，所述方法包括在HLA-A*3303 限制性WTl肽存在下培养外周血单核细胞以从外周血单核细胞诱导WTl特异性CTL。外周血单核细胞所得自的受试者可以是任何一个，只要是HLA-A*3303阳性受试者。通过在 HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培养外周血单核细胞，WTl特异性CTL从包括于外周血单核细胞内的CTL前体细胞诱导得到。有可能通过将本发明的WTl特异性CTL给予受试者以治疗或预防在HLA-A*3303阳性受试者中的造血肿瘤或实体癌。
另一方面，本发明涉及用于诱导WTl特异性CTL的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的HLA-A*3303限制性WTl肽。优选试剂盒在诱导WTl特异性CTL的方法中使用。本发明的试剂盒可以除包含HLA-A*3303限制性WTl肽以外，还包含例如获得外周血单核细胞的工具、佐剂和反应容器等等。一般来说，说明手册附于试剂盒中。通过使用本发明的试剂盒， 可高效地诱导WTl特异性CTL。
又一方面，本发明涉及通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，所述抗原呈递细胞通过HLA-A*3303限制性WTl肽诱导。通过使用本发明的抗原呈递细胞，可高效地诱导WTl特异性CTL。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将通过HLA-A*3303 分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞给予HLA-A*3303阳性受试者。给予抗原呈递细胞的方法可以根据以下条件适当地进行选择例如疾病的类型、受试者的状态或靶位点。所述方法的实例包括但不限于静脉给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药、鼻内给药和口腔给药。
另一方面，本发明涉及用于诱导通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培养未成熟的抗原呈递细胞，使未成熟的抗原呈递细胞诱导成为通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞。未成熟的抗原呈递细胞是指可以成熟变为抗原呈递细胞的细胞，例如未成熟的树突细胞。未成熟的抗原呈递细胞所得自受试者可以是任何一个，只要是HLA-A*3303阳性受试者。因为未成熟的抗原呈递细胞包括于例如外周血单核细胞中，所以所述的未成熟的抗原呈递细胞可以在 WTl肽的存在下培养。
另一方面，本发明涉及用于诱导通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的HLA-A*3303限制性WTl肽。优选该试剂盒应用于诱导抗原呈递细胞的方法。本发明的试剂盒中所包含的其他组分等已在上文描述过。本发明的试剂盒可以用于高效地诱导通过HLA-A*330分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞。
另一方面，本发明涉及抗HLA-A*3303限制性WTl肽的抗体或抗编码此肽的多核苷酸的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
又一方面，本发明涉及用于诊断癌症方法，所述方法包括使用WTl特异性CTL ；使用通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞或者使用抗HLA_A*3303限制性WTl肽的抗体或抗编码此肽的多核苷酸的抗体。优选WTl特异性CTL应用于本发明用于诊断的方法。 例如有可能通过以下方式诊断癌症将CTL、抗原呈递细胞或抗体与来自HLA-A*3303阳性受试者的样品一起温育；或者将其给予HLA-A*3303阳性受试者，然后测定例如其位置、位点或含量。CTL、抗原呈递细胞或抗体可以被标记。通过标记的附着，可以高效地实施本发明用于诊断的方法。
另一方面，本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的WTl 特异性CTL、通过HLA-A*3303分子呈递WTl肽的抗原呈递细胞或抗HLA_A*3303限制性WTl 肽的抗体或抗编码此肽的多核苷酸的抗体。
以下实施例更详细地说明了本发明，但不能将其解释为对本发明范围的限制。 实施例
实施例1 选择WTl肽
用 NetMHC2. 0 程序(Technical University of Denmark (丹麦技术大学))从来自 WTl 蛋白(SEQ ID No 1)的WTl肽中选择出WT1337、WT1364、WTl367和WTl4tl9，这些肽是由9个氨基酸组成的具有适合HLA-A*3303的锚定基序的亲水肽(N-末端起的第二个氨基酸是Ala、 lie、Leu、Val, Phe, Tyr、Ser和Asp中的任意一个并且C-末端的氨基酸是Arg)，并预期其具有与HLA-A*3303分子高度的结合亲和力。这些肽的氨基酸序列以及与HLA_A*3303分子结合亲和力示于表1中。
肽ID No: 1中的氨基酸序号氨基酸序列与 HLA-A*3303 分子结合亲和力WTl337337-345LSHLQMHSR18.827(SEQ ID No: 2)WTl364364-372FSRSDQLKR15.143(SEQ ID No: 3)WTl367367-375SDQLKRHQR14.496(SEQ ID No: 4)WTl409409-417TSEKPFSCR15.310(SEQ ID No: 5)
制备B-LCL细胞
通过FicolI-Hypaque梯度密度离心方法从取自HLA_A*3303阳性的健康捐赠者 (HLA-A*3303/0207)的外周血中分离外周血单核细胞(PBMCs)。然后将PBMCs在含有10% FCS的RPMI 1640培养基中以约1 X IO7的密度接种到M孔细胞培养板，并加入B95-8细胞 (产生EB病毒的细胞)的培养上清液。使它们在371、5%0)2的条件下培养约1个月。由此获得经EB病毒转化过的B-LCL细胞，其为B细胞肿瘤细胞。可以确定得到的B-LCL细胞不表达WTl基因。用20 μ g/ml的WT1337、WT1364、WT1367或WTl409温育B-LCL细胞2小时以对其进行脉冲并用80Gy的辐射对其进行放射。得到的B-LCL细胞(下文称为用WTl肽脉冲过的B-LCL细胞)作为抗原呈递细胞用于以下的实验。
诱导 CTL 特异性 WTianduction ofCTL specific WTl)
3 X IO6 的 PBMCs (HLA-A*3303/1101)于含 20 μ g/ml 的 WT1337、WT1364、WTl367 或 WTl彻的完全培养基(45% RPMI，45% AMI-V培养基和10%人类AB血清)中的M孔细胞培养板中以37°C、5% CO2的条件培养1周以获得应答细胞。获得的2X106的应答细胞与IXlO6的用同样的WTl肽脉冲过的B-LCL细胞在完全培养基中共培养1周(首轮刺激)。PBMCs与用 WTl肽脉冲过的B-LCL细胞再共培养三次(第二至第四轮刺激)；培养条件为按照以下方式加入20IU/ml (终浓度)的IL-2 第二轮刺激刺激开始3天后隔天加入共2次；第三和第四轮刺激刺激开始后的第2天隔天加入共3次。获得的细胞使用Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (阴性选择柱重力进料试剂盒)(StemSp)浓缩致使CD8阳性 T细胞的比率达到大约80%，然后与用WTl肽脉冲过的B-LCL细胞共培养(第五轮刺激)。 最后一次刺激5天后收获的CD8阳性T细胞(CTL)用于检测细胞毒活性。
CTL的细胞毒活性
使用51Cr释放法检测CTL的细胞毒活性。CTL细胞(在下文称为效应细胞)以1 1、 5 1或10 1的比例(E/T比)与掺入51Cr的靶细胞在200 μ 1的培养基中混合，并在96 孔细胞培养板中以37°C、5% CO2的条件培养4小时。用WTl肽脉冲过的B-LCL细胞(BLCL-P) 与未用WTl肽脉冲过的B-LCL细胞(BLCL-NPs)作为靶细胞使用，所述的WTl肽与曾用于诱导CTL的一样。培养后，离心收集上清液。用液体闪烁计数器检测释放到上清液的51Cr的量。使用以下公式计算细胞毒活性(％ )
(样品上清液中的51Cr释放-自发的51Cr释放)/(最大量的51Cr释放-自发的51Cr释放)X 100
其中自发的51Cr释放是指当掺入了 51Cr的靶细胞在同样的条件下单独培养时所观测到的51Cr的释放；最大量的51Cr释放是当使用1 % Triton X-100完全地裂解掺入51Cr的靶细胞时所观测到的51Cr的释放。结果在图1-4出示。图中，纵坐标代表特异性的裂解(％) 而横坐标代表E/T比。实线代表BLCL-P ；点线代表BLCL-NP。由此证实，与BLCL-NP相比， 呈递WTl肽(与HLA-A*3303分子一起形成复合体)的BLCL-P被用WT1337、WT1364、WTl367或 WTl409诱导的CTL特异性地破坏。用WT1364、WTl367或WTl4tl9诱导的CTL用于以下进一步的实验。
抗内源表达WTl基因细胞的CTL细胞毒活性
使用以上所描述方法测定抗TF-I细胞(表达WTl基因(HLA-A*3303阳性)的肿瘤细胞)的用WT1364、WTl367或WTl4tl9诱导的CTL细胞毒活性。使用表达WTl基因的HLA-A*3303 阴性的K562细胞作为对照。结果在图5-7中出示。图中，纵坐标代表特异性裂解(％ )而横坐标代表E/T比。实线代表TF-I ；点线代表K562。由此证实用WT1364、WT1367或WTl4tl9诱导的CTL同样具有抗外源表达WTl基因细胞的细胞毒活性。
使用以上所描述方法测定抗表达WTl的B-LCL细胞的用WTl367诱导的CTL细胞毒活性。 表达WTl的B-LCL(B-LCL-WTl)是指导入了人类WTl基因的、在细胞中表达WTl蛋白的并且呈递由HLA-A*3303分子上的加工而产生的由约9个氨基组成的肽的B-LCL细胞。使用导入非WTl基因的对照基因的B-LCL细胞(B-LCL-CV)作为对照。结果在图8中出示。图中，纵坐标代表特异性裂解(％ )而横坐标代表E/T比。实线代表B-LCL-WTl而点线代表 B-LCL-CV。由此证实用WTl367诱导的CTL仅破坏HLA_A*3303阳性并表达WTl的细胞。 产业适用性
本发明提供了 HLA-A*3303限制性WTl肽、编码此肽的多核苷酸以及包含此肽和多核苷酸的药物组合物等等。因此本发明可以应用于医学等领域，例如应用于为预防或治疗高水平表达WTl基因的造血肿瘤和实体癌而开发并制备各种药物组合物的领域。
权利要求
1.由选自以下的氨基酸序列组成的肽Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
2.用于治疗或预防HLA-A*3303阳性受试者的癌症的药用组合物，所述组合物包含由选自以下的氨基酸序列组成的肽Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
3.由选自以下的氨基酸序列组成的肽在制备用于治疗或预防HLA-A*3303阳性受试者的癌症的药物中的应用Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
4.编码权利要求1的肽的多核苷酸。
5.包含权利要求4的多核苷酸的表达载体。
6.用于治疗或预防HLA-A*3303阳性受试者的癌症的药用组合物，所述组合物包含由选自以下的氨基酸序列组成的肽的编码多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
7.由选自以下的氨基酸序列组成的肽的编码多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体在制备用于治疗或预防HLA-A*3303阳性受试者的癌症的药物中的应用Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
8.WTl特异性CTL，其可通过由选自以下的氨基酸序列组成的肽诱导 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
9.诱导WTl特异性CTL的方法，所述方法包括在由选自以下的氨基酸序列组成的肽存在下培养外周血单核细胞，以从外周血单核细胞诱导WTl特异性CTL Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
10.用于诱导WTl特异性CTL或用于诱导呈递WTl肽的抗原呈递细胞的试剂盒，所述试剂盒包含作为必需组分的由选自以下的氨基酸序列组成的肽Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
11.呈递WTl肽的抗原呈递细胞，其可通过由选自以下的氨基酸序列组成的肽诱导 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
12.用于诱导呈递WTl肽的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括在由选自以下的氨基酸序列组成的肽存在下培养未成熟的抗原呈递细胞，以从未成熟的抗原呈递细胞诱导呈递 WTl肽的抗原呈递细胞Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg (SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg (SEQ ID No :5)。
13.WTl肽和HLA-A*3303分子的复合体，其中所述WTl肽由选自以下的氨基酸序列组成Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg(SEQ ID No :2)、 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg(SEQ ID No :3)禾口 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg(SEQ ID No :5)。
14.权利要求13的复合体，其中所述复合体是四聚体的形式。
全文摘要
本发明公开了包含由来自WT1蛋白的连续九个氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸残基选自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸残基是Arg；编码此肽的多核苷酸；包含此肽的药物组合物；以及其它。
文档编号C07K7/06GK102250211SQ20111015692
公开日2011年11月23日 申请日期2007年2月21日 优先权日2006年2月22日
发明者杉山治夫 申请人:株式会社癌免疫研究所