芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物及其应用的制作方法

专利名称：芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物及其应用。
背景技术：
微量元素，是维持生命活动和生长发育的重要营养物质。微量元素的营养作用经历了四个发展阶段，第一代产品即无机盐类添加剂，如硫酸铜、硫酸锌等；第二代产品即一些简单的有机酸盐，如葡萄糖酸锌、富马酸亚铁等，这两类产品稳定性差，对胃肠刺激大，而且受肠内容物干扰大，吸收利用差，总的生物利用率低于20 %。第三代产品即氨基酸微量元素螯合盐具有抗干扰力强、稳定性好、易吸收等优点，其生物效价为无机盐类添加剂的2-3 倍。近年来，肽金属螯合物引起科学家的广泛关注。根据寡肽(主要是二肽、三肽)吸收理论，在粘膜纹状缘存在着肽载体，它可利用一种称为质子梯度主动转运机制来实现肽的吸收。与氨基酸的吸收相比，具有吸收快、不易饱和、耗能低，且与氨基酸的吸收无竞争等特点。肽金属螯合物可通过肽的吸收途径转运吸收，避免了与氨基酸之间的竞争，提高微量元素的利用率。有关这方面的研究已经成为动物营养学、食疗学和生理学研究的一个热点。肽本身容易消化吸收，可促进动物生长，改善饲料报酬，提高动物的免疫力和抗应急能力。一些寡肽还具有调味、抗菌、促进矿物质吸收、降血压和抗氧化等多种生理功能。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽混合物。本发明所提供的多肽混合物，是通过包括如下步骤的方法制备得到的用蛋白酶对芝麻蛋白进行水解，得到含有氨基酸序列为Asn-Cys-Ser的多肽的水解产物，即得到多肽混合物。所述芝麻蛋白为从芝麻粕中提取得到的蛋白。所述用蛋白酶对芝麻蛋白进行水解的方法包括如下步骤将芝麻蛋白与水混合，得到混合液；向所述混合液中加入蛋白酶，进行水解反应；所述水解反应的温度，依据所用蛋白酶的最适温度，为37°C 60°C或37°C或55°C 或 60°C ；所述水解反应的PH值，依据所用蛋白酶的最适PH值，为6. 2 8. 5或6. 2或8. 0 或 8. 5 ；所述水解反应的时间为2小时 8小时或2小时或5小时或8小时；所述混合液中所述芝麻蛋白的质量百分比浓度为2% 10%或2%或5%或10%;所述蛋白酶的加入量为20U-100U或20U或60U或100U每克芝麻蛋白；所述蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶。所述得到水解产物之后，还包括将所述水解产物进行离心分离，收集上清液，该上清液即为所述多肽混合物。本发明的另一个目的是提供一种复合金属螯合肽混合物。
本发明所提供的复合金属螯合肽混合物，是通过包括如下步骤的方法制备得到的将所述多肽混合物以金属螯合树脂为螯合介质进行金属螯合亲和层析，用含有浓度为0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸缓冲液作为流动相进行梯度洗脱；收集金属螯合率为20% -25%的洗脱峰，即得到复合金属螯合肽混合物。本发明的又一个目的是提供一种多肽。本发明所提供的多肽，其氨基酸序列为Asn-Cys-kr。本发明的又一个目的是提供一种肽微量元素螯合物。本发明所提供的肽微量元素螯合物，为由所述多肽混合物、所述复合金属螯合肽混合物或所述多肽与微量元素进行螯合反应得到的螯合物。所述微量元素为!^e、Si或Cu。所述螯合反应中所述多肽与所述微量元素的摩尔比为1 1-4 1或1 1或 3 1 或4 1 ；所述螯合反应的温度为20°C -80°C或50°C _80°C或20°C或50°C或80°C ；所述螯合反应的pH值为6-8或6或7或8 ；所述螯合反应的的时间为1小时-4小时或1小时或3小时或4小时。所述多肽混合物、所述复合金属螯合肽混合物或所述多肽在制备肽微量元素螯合物中的应用也属于本发明的保护范围。所述多肽混合物、所述复合金属螯合肽混合物、所述多肽或所述肽微量元素螯合物在制备促进人或动物对微量元素吸收的产品中的应用也属于本发明的保护范围。本发明又一个目的是提供一种促进人或动物对微量元素吸收的产品。本发明所提供的促进人或动物对微量元素吸收的产品，其活性成分为所述肽微量元素螯合物。本发明所制备的芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物，原料成本低，芝麻粕一般用于制作饲料的原料，而成品具有高附加值；本发明提供的金属螯合肽是2 3个氨基酸的金属螯合肽，分子量小，更易被消化道直接吸收；且生产技术对设备要求不高，具有投资少，易开发利用。本发明所制备的金属螯合肽的金属螯合作用强，不仅可以替代无机盐类和简单的有机酸盐等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分。该产品可以用于食品、保健品甚至动物食品和饲料等，应用范围极其广泛，社会效益和经济效益都很显著。本发明所制备的芝麻蛋白源金属螯合肽，可同时作营养强化剂和助鲜剂，既增加了常用调味料酱油的，又提高产品蛋白质含量，此外还可以增加鲜味，可作为绿色、安全、健康的多功能食品配料。芝麻蛋白金属螯合肽溶液作为新一代饲料用营养补充剂能作为运输钙、 铁、锌等微量元素的载体，提高微量元素的肠吸收效率和生物利用度。活性肽溶液本身还可迅速补充动物蛋白营养，促进生长以及增强动物的免疫力等。


图1为芝麻蛋白水解液经金属亲和层析柱(锌柱)分离的洗脱曲线(图1中B) 及四个组分(1、2、3和4)的金属螯合率和抗氧化能力(图1中A)。图2为图1中组分2经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离的谱图(图1中A)，及Pl峰纯化后的RP-HPLC谱图(图1中B)。图3为pi组分的质谱图(图1中A)及其中m/z = 353. 4的串联质谱图(图1中 B)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、酶法制备含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物方法I一、超声波辅助碱溶酸沉法提取芝麻蛋白芝麻粕(购于北京市茂芝源商贸有限责任公司)的预处理将芝麻粕充分粉碎后， 用石油醚浸提2次，去残油，得到预处理芝麻粕。称取经预处理的芝麻粕100g，加入300mL 水，用NaOH调pH值至11，超声波提取Ih，然后于4000rpm离心20分钟，收集上清液，反复提取2次。合并上清液，用HCl调pH至4. 0，于SOOOrpm离心15分钟，收集沉淀，冷冻干燥， 得到芝麻蛋白。二、用酶法制备含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物将芝麻蛋白与纯净水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比浓度为2%，用2mol/L NaOH调节混合液的pH值至6. 2，然后向混合液中加入木瓜蛋白酶 (papain)(蛋白酶(0. 5_2u/mg)(购自sigma，产品目录号为p3250)，木瓜蛋白酶的加入量为 20U/g芝麻蛋白，于37°C进行水解反应8. 0小时；水解结束时，将水解产物在90°C加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。将得到水解产物室温下进行离心分离，转速为SOOOg的条件下离心15分钟，除去脂肪和大分子蛋白和杂质，收集上清液，该上清液即为含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后冻干，得到冻干粉。将上述得到的冻干粉配制成质量百分比浓度为0. 2%的水溶液，即样品溶液；测定其金属螯合能力。金属螯合能力测定方法取5. OmL样品溶液，加入2mM FeSO4 · 7H20溶液0. ImL和 5mM ferrozine溶液0. 2mL。充分反应10分钟，在562nm下测吸光值。空白以去离子水代替样品。吸光值越低，表示金属螯合能力越强。同时，以l.OmM EDTA溶液为阳性对照，测定阳性对照的金属螯合率。金属螯合率(％) = 1_(样品的吸光值/空白的吸光值)X 100%。结果含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物的金属螯合率为70. 5% ；阳性对照的金属螯合率91%。方法II一、超声波辅助碱溶酸沉法提取芝麻蛋白与方法I相同。二、用酶法制备含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物将芝麻蛋白与纯净水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比浓度为5%，用2mol/L NaOH调节混合液的pH值至8.0，然后向混合液中加入胰蛋白酶 (tyrpsin)(蛋白酶(250u/mg)(购自Sigma，产品目录号为0458)，胰蛋白酶的加入量为60U每克所述芝麻蛋白，于进行水解反应5小时；水解结束时，将水解产物在90°C加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。将得到水解产物常温下进行离心分离、转速为8000*g的条件下离心15分钟，除去脂肪和大分子蛋白和杂质，收集上清液，该上清液即为含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后冻干，得到冻干粉。将上述得到的冻干粉配制成质量百分比浓度为0. 2%的水溶液，测定其金属螯合能力。含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物的金属螯合能力的测定方法与方法I相同。结果含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物的金属螯合率为88. 1% ；阳性对照的金属螯合率91%。方法III—、超声波辅助碱溶酸沉法提取芝麻蛋白与方法I相同。二、用酶法制备含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物将芝麻蛋白与纯净水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比浓度为10%，用2mol/L NaOH调节混合液的pH值至8. 5，然后向混合液中加入碱性蛋白酶 (Alcalase)(蛋白酶(2. 4Au/ml)(购自Sigma，产品目录号为P4860)，碱性蛋白酶的加入量为20U每克所述芝麻蛋白，于60°C进行水解反应2小时；水解结束时，将水解产物在90°C 加热5分钟，然后煮沸后再保持3分钟，停止酶解反应。将得到水解产物室温下进行离心分离，转速为8000*g的条件下离心15分钟，除去脂肪和大分子蛋白和杂质，收集上清液，该上清液即为含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后冻干，得到冻干粉。将上述得到的冻干粉配制成质量百分比浓度为0. 2%的水溶液，测定其金属螯合能力。金属螯合肽混合物的金属螯合能力的测定方法与方法I相同。结果含金属螯合肽的芝麻蛋白水解物的金属螯合率为75. 1% ；阳性对照的金属螯合率91%。实施例2、制备复合金属络合肽一、分离纯化金属螯合肽将实施例1中方法I得到的冻干粉用少量去离子水溶解，用金属螯合亲和层析柱 (锌柱)进行分离，首先用水洗脱锌柱，分离出来的是金属螯合能力较差的肽；然后用含有浓度为0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸缓冲液(pH = 6)作为流动相梯度洗脱，流速为Iml/分钟，温度为室温，混合物中的肽按金属螯合能力由弱到强依次洗脱下来，这样将肽的混合物分成四个组分，在254nm下检测肽的浓度，并检测各洗脱液对应的金属螯合能力(金属螯合能力的测定方法与实施例1中相同)，如图1所示，其中图1中B为芝麻蛋白水解液经金属亲和层析柱(锌柱)分离的洗脱曲线；图1中A为四个组分(组分1、组分2、 组分3和组分4)的金属螯合率和抗氧化能力(柱图中未显示的部分是因为活性值太低)。 其中四个组分所用的洗脱液分别为水、含0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的pH = 6的磷酸缓冲液。收集金属螯合率较高的组分2和组分3 (金属螯合率为20% -25%的洗脱峰)，即得到复合金属络合肽；然后用冻干机冻干成粉状。
金属螯合亲和层析柱的制备方法如下取2g壳聚糖溶解在IOOmL质量分数为3%的CH3COOH溶液中，搅拌至完全溶解。取 250ml三角瓶，加入液体石蜡(IOOml)与span80 (Iml)，充分混勻，在120rpm的搅拌速度下， 缓慢加入2%的壳聚糖溶液，待形成壳聚糖微球后滴入戊二醛至浓度为2%，在40°C恒温水浴振荡器中反应2h。加入适量石油醚和2mol/L的NaOH溶液，去除石蜡并沉淀壳聚糖微球， 水洗并用布氏漏斗抽干。将得到的戊二醛交联湿状壳聚糖微粒加入50ml NaBH4与NaOH混合液(8. 76g Na0H+0. 75g NaBH4定容至100ml)，在室温下反应池，涮洗抽滤，将收集的壳聚糖微球定容到100ml，并按1 1体积比加入环氧氯丙烷溶液，在室温下反应池，水洗并用布氏漏斗抽干。以活化壳聚糖(g)为基准，按1 2(g mmol/L)的比例加入适量浓度的亚氨基二乙酸(IDA)溶液50ml，在65°C水浴摇床中反应Mh，水洗并用布氏漏斗抽干。将制备好的IDA-壳聚糖装柱，用纯净水流洗3-5个床体积，加入0. lmol/L的ZnCl2溶液50ml， 在恒温下反应2h，使填料充分吸附锌离子，得到Si-IDA-壳聚糖IMAC填料，即得到金属螯合树脂。再用去离子水流洗3-5个床体积，除去未结合的金属离子，并用3-5个床体积含有 0. 05mol/L的pH = 6. 0的磷酸缓冲溶液进行平衡。所用试剂来源壳聚糖购自山东奥康生物科技有限公司；亚氨基二乙酸(IDA)购于美国sigma公司；乙酸、液体石蜡、span80、戊二醛、NaBH4, NaOH、环氧氯丙烷、硫酸锌、 EDTA-2Na、铬黑T均为分析纯，购于北京化学试剂公司。实施例3、制备金属螯合肽纯净物一、制备金属螯合肽NCS将上述实施例2制备得到的复合金属络合肽用反相高效液相色谱HPLC分离纯化。 用 HPLC 分离时，使用 ODS 柱(YMC ODS-AQ S_5 120A, 4. 6 X 250mm, USA)。上样量为 20 μ L0 洗脱溶剂为Α，含0. 三氟乙酸(TFA)的纯水(ν/ν) ；B，添加0. 1 % TFA的80%乙腈溶液。 用A和B的混合液进行梯度洗脱，(溶剂B的体积百分数从10%到60% )。流速1. Oml/ 分钟，洗脱时间30分钟。210nm下检测肽的出峰位置，如图2所示，其中图2中A为图1中组分2经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离的谱图；收集并测定各吸收峰对应的洗脱液的金属螯合能力(金属螯合能力的测定方法与实施例1中相同)，其中Pl组分的金属螯合能力较强；将Pl组分收集后冻干，用水溶解，再次用HPLC进行分离，图2中B为A中pi峰纯化后的RP-HPLC谱图。使用液相色谱-质谱连用法(HPLC-MS)、串联质谱(MS/MS)法进一步鉴定肽的氨基酸序列，如图3所示。图3中A为pi组分的质谱图(MS谱图)；从图中可以看出，pi中含有多个分子量在450以下的寡肽；将其中质荷比为345的寡肽进行串联质谱分析，图3中B 为其中m/z = 345. 0的串联质谱图(MS/MS谱图)。通过分析谱图鉴定出金属螯合肽的氨基酸序列为Asn-Cys-kr，将其命名为金属螯合肽NCS，分子量为322。查找已发表的有关芝麻蛋白的氨基酸序列，Asn-Cys-Ser对应于芝麻蛋白的 sesamum indicum 片段 7 (113-115)，8 (113-115)，9 (113-115)，10(114-116)， 从而进一步验证了此金属螯合肽来源于芝麻蛋白。采用化学合成法(多肽合成仪)合成金属螯合肽NCS (纯度在90%以上)，其氨基酸序列为Asn-Cysler。二、测定金属螯合肽NCS对微量元素Fe和Si的螯合率
1、锌螯合率的测定取1. OmL 0. 02M ZnCl2 (用乙醇溶解)于25mL圆底烧瓶中，缓慢滴入含有上述制备得到的金属螯合肽NCS的50%乙醇溶液(质量百分比)10mL，得到混合溶液，混合溶液中 NCS的浓度为20g/L。然后加入100 μ L三乙胺，室温下搅拌反应lh，至有白色沉淀生成，即得到反应液。总量锌含量的测定准确移取反应液5mL于50mL容量瓶中，定容，摇勻，用EDTA络合滴定法滴定锌的总量。螯合肽锌含量的测定另移取反应液5mL于烧瓶中浓缩至近干，加入15mL无水乙醇离心分离，将所得白色沉淀用水溶解定容在50mL容量瓶中，定容，摇勻。用EDTA络合滴定法测定螯合态锌的含量。结果NCS的锌螯合率为73. 7士0. 02%。EDTA络合滴定分别取容量瓶中溶液20mL于锥形瓶中，加两滴二甲酚橙指示剂， 滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺至溶液呈稳定的紫红色，再加入4mL六亚甲基四胺， 用0.02M EDTA滴定至溶液由紫红色变成黄色时为终点。实验重复三次，结果取平均值。螯合率(％) = C(V1-V0)/C(V2-V0) X100%= (V1-V0)/(V2-V0) X 100%其中=C-EDTA溶液的浓度，M 空白，即用水代替样品滴定所消耗的EDTA溶液体积，mL ;Vr滴定螯合态锌所消耗的EDTA溶液体积，mL ;V2-滴定总锌所消耗的EDTA溶液体积。2、铁螯合率的测定在两只烧瓶中加入质量百分比浓度为2%的NCS水溶液10mL，一口抽真空一口通氮气，以除去其中的氧气，然后依次加入IOmL 0. 02M FeSO4 · 7H20和0. 05g铁粉，继续通氮气，室温，搅拌反应lh，即得到反应液。总量铁含量的测定准确移取IOmL反应液于50mL容量瓶中，定容摇勻。用EDTA 络合滴定法测定铁的总量。螯合态铁含量的测定另移取反应液IOmL于锥形瓶中，加入30mL丙酮，离心分离， 将所得的沉淀用水溶解定容在50mL容量瓶中，定容，摇勻。用EDTA络合滴定法测定其中铁的含量(即螯合铁部分)。EDTA络合滴定各取总量铁与螯合态铁容量瓶中溶液20mL于锥形瓶中，分别加入 30% H2023mL,用乙酸控制体系的pH为2. 0，分别加热至50_60°C，放凉，加入2%的磺基水杨酸5-8滴，用0. OlM EDTA滴定至溶液由紫色变成红色时为终点(试样中铁含量低时，滴定终点为无色)。实验重复三次，结果取平均值。螯合率(％) = C (V1-V0) /C (V2-V0) X100%= (V1-V0) / (V2-V0) X 100 %。其中=C-EDTA溶液的浓度，M ；Vtl-空白，即用水代替样品滴定所消耗的EDTA溶液体积，mL ;Vr滴定螯合肽铁所消耗的EDTA溶液体积，mL ;V2-滴定总铁所消耗的EDTA溶液体积。结果NCS的铁螯合率为61. 3 士 0.01%。二、测定金属螯合肽对微量元素狗和Si的螯合率1、锌螯合率的测定测定方法与方法I相同。测定结果与方法I无显著差异。
2、铁螯合率的测定测定方法与方法I相同。测定结果与方法I无显著差异。实施例4、制备肽微量元素螯合物一、制备含有小肽锌螯合物的混合物将实施例1制备得到的含有金属螯合肽的芝麻蛋白水解物与锌盐(ZnSO4 ·Η20)水溶液按照摩尔比为3 1的比例混合，调节ρΗ至8，在室温下搅拌，进行螯合反应，反应时间为4h，边反应边搅拌，反应产物即为含有小肽锌螯合物的混合物。将产物在70°C下真空浓缩后，在80°C下真空干燥，产品可作为动物饲料添加剂使用。二、制备复合小肽锌鳌合物将上述得到含有小肽锌螯合物的混合物继续纯化，即向上述浓缩后的反应产物添加3倍体积的95%乙醇水溶液，在室温下进行离心，收集沉淀，即得到复合小肽锌鳌合物。三、制备小肽锌螯合物方法I将含有2%金属螯合肽NCS的乙醇水溶液(质量百分比)与0.02M的锌盐溶液 (ZnSO4 · H2O)按照摩尔比为1 1的比例混合，调节ρΗ至6，在温度为20°C下进行螯合反应，边反应边搅拌，反应时间为2小时。反应后，添加2倍体积无水乙醇，采用旋转蒸发仪进行浓缩，并将沉淀离心分离，70°C下真空干燥，即得到小肽锌鳌合物。方法II将实施例2中的复合金属螯合肽溶液与0. 02M的锌盐(ZnSO4 · H2O)溶液按照摩尔比为3 1的比例混合，调节ρΗ至7.0，在温度为50°C进行螯合反应，反应过程中进行搅拌，3小时后，得到反应产物；对反应产物进行浓缩，然后添加2倍体积的95%乙醇水溶液， 将沉淀离心分离，即得到小肽锌鳌合物。方法III将实施例2中的复合金属螯合肽溶液与锌盐(ZnSO4 ·Η20)溶液按照摩尔比为4 1 的比例混合，得到混合溶液；调节PH至8. 0，添加混合溶液体积的的三乙胺，在80°搅拌反应4小时，然后添加2倍体积的95%乙醇，将产生的沉淀进行离心分离，65°C下真空干燥，即得到小肽锌鳌合物。四、制备小肽铁螯合物方法I将实施例2中的复合金属螯合肽溶液与亚铁盐(FeSO4 · 7H20)溶液按照摩尔比为
1 1的比例混合，调节PH至6.5，加入铁粉，在温度为50°C进行螯合反应，同时加以搅拌， 反应时间为2小时。反应后在60°C条件下浓缩，添加2倍体积的95%乙醇水溶液，将沉淀分离，即得到小肽铁鳌合物。方法II将实施例2中的复合金属螯合肽溶液与亚铁盐(FeSO4 · 7H20)溶液按照摩尔比为
2 1的比例混合，调节ρΗ至6. 0，加入0. 5g/ml的异抗坏血酸钠，在温度为50°C进行螯合反应，边反应边搅拌，反应时间为1小时。反应后，添加2倍体积的丙酮，浓缩，将沉淀离心分离，得到小肽铁鳌合物。方法III将金属螯合肽NCS (2%的水溶液)与亚铁盐溶液(FeSO4 · 7H20，浓度0. 02M)按照摩尔比为1 1的比例混合，调节PH至7. 5，加入1. Og/ml的异抗坏血酸钠，在25°C下进行螯合反应，不停地搅拌，反应时间为2小时。反应后，添加2倍体积的丙酮，采用旋转蒸发仪进行浓缩，并将沉淀离心分离，得到小肽铁鳌合物。五、制备复合肽微量元素螯合物将微量元素Fe，Zn, Cu按动物(家畜或家禽)的生理需要配合成复合微量元素溶液，再与实施例2中的复合金属螯合肽按2 1(摩尔比)的比例混合，调节最适pH值在6， 室温下搅拌反应2小时，形成混合多元微量元素肽螯合物溶液；加入沸石粉吸附，然后继续烘干(控制在50°C -80°C )、粉碎，即得到混合微量元素肽饲料添加剂。实施例5、肽微量元素螯合物的应用一、使用本发明的肽金属螯合作为营养强化剂添加到阿胶口服液中阿胶铁口服液生产配方如下A 阿胶 0.08mg/mlB小肽铁0. 5mg/ml (由实施例4中实验四的方法I制备得到)C 维生素 C 2. Omg/mlD 红糖芝麻蛋白源小肽铁，可作营养强化剂，和阿胶以及红糖等协同作用，提高产品的营养功效，作为适合妇女使用的营养品。二、使用本发明的肽金属螯合作为营养强化剂添加到全脂奶粉中强化锌奶粉生产配方如下A 奶粉B 卵磷脂C 小肽锌(由实施例4中实验三的方法I制备得到)强化铁生产配方(重量比)如下将上述配方中C替换为小肽铁。三、使用本发明的肽微量元素螯合物作为营养强化剂添加到酱油中强化锌酱油生产配方(重量比)如下A 生酱油，5%，主料；B 焦糖色素，按生产需要(0.05%左右)；C 味精及[I+G]，两者按重量比；35 45 1混合，0.6% 0. 7% ；D 小肽锌，添加量0. 3mg/ml ( 一般每人每天摄入10 15mg就能满足生理需求)(由实施例4中实验三的方法II制备得到)；E 乳酸，0.05%，风味剂，增加口感，提高营养；F 甘草，0. 008%，甜味剂，甜度为蔗糖200倍；I 氯化钠和氯化钾，按生产需要(2-3% )，咸味剂；K 尼泊金乙酯或丙酯，0.01 0.03%，防腐剂，延长产品保质期。强化铁酱油生产配方(重量比)如下
将上述配方中D替换为小肽铁，添加量O.^ig/ml (成人铁适宜摄入量男子15mg/d， 女子为20mg/d)四、使用本发明的肽微量元素螯合物作为营养强化剂添加到狗食中狗食配方如下以鸡胸肉(49wt% )、大豆粉(27wt% )、精制面粉)组成的混合物为基料，添加占基料重量6wt%的白砂糖，l-2wt%的芝麻蛋白金属螯合肽(由实施例2制备得到)，&iS04，添加量10-15mg/kg(干重)，添加0. 5wt%的食盐以突出风味，再加入2wt %的复合膨松剂(小苏打40wt %，烧明矾52wt %，轻质碳酸钙3wt %，淀粉5wt % ) 进行挤压膨化。
权利要求
1.一种多肽混合物，是通过包括如下步骤的方法制备得到的用蛋白酶对芝麻蛋白进行水解，得到含有氨基酸序列为Asn-Cys-Ser的多肽的水解产物，即得到多肽混合物。
2.根据权利要求1所述的多肽混合物，其特征在于 所述用蛋白酶对芝麻蛋白进行水解的方法包括如下步骤将芝麻蛋白与水混合，得到混合液；向所述混合液中加入蛋白酶，进行水解反应； 所述水解反应的温度为37°C 60°C或37°C或55°C或60°C ； 所述水解反应的PH值为6. 2 8. 5或6. 2或8. 0或8. 5 ； 所述水解反应的时间为2小时 8小时或2小时或5小时或8小时； 所述混合液中所述芝麻蛋白的质量百分比浓度为2% 10%或2%或5%或10% ； 所述蛋白酶的加入量为20U-100U或20U或60U或100U每克芝麻蛋白； 所述蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的多肽混合物，其特征在于所述得到水解产物之后，还包括将所述水解产物进行离心分离，收集上清液，该上清液即为所述多肽混合物。
4.一种复合金属螯合肽混合物，是通过包括如下步骤的方法制备得到的将权利要求1所述的多肽混合物以金属螯合树脂为螯合介质进行金属螯合亲和层析， 用含有浓度为0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸缓冲液作为流动相进行梯度洗脱；收集金属螯合率为20% -25%的洗脱峰，即得到复合金属螯合肽混合物。
5.一种多肽，其氨基酸序列为Asn-Cys-kr。
6.一种肽微量元素螯合物，为由权利要求1-3中任一所述的多肽混合物、权利要求4所述的复合金属螯合肽混合物或权利要求5所述的多肽与微量元素进行螯合反应得到的螯合物。
7.根据权利要求6所述的肽微量元素螯合物，其特征在于所述螯合反应中所述多肽与所述微量元素的摩尔比为1 1-4 1或1 1或3 1 或4 1 ；所述螯合反应的温度为20°C -80°C或50°C -80°C或20°C或50°C或80°C ； 所述螯合反应的pH值为6-8或6或7或8 ；所述螯合反应的的时间为1小时-4小时或1小时或3小时或4小时。
8.权利要求1-3中任一所述的多肽混合物、权利要求4所述的复合金属螯合肽混合物或权利要求5所述的多肽在制备肽微量元素螯合物中的应用。
9.权利要求1-3中任一所述的多肽混合物、权利要求4所述的复合金属螯合肽混合物、 权利要求5所述的多肽或权利要求6或7所述的肽微量元素螯合物在制备促进人或动物对微量元素的吸收产品中的应用。
10.一种促进人或动物对微量元素吸收的产品，其活性成分为权利要求6或7所述的肽微量元素螯合物。
全文摘要
本发明公开了芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物及其应用。本发明提供了一种多肽混合物。本发明所提供的多肽混合物是通过包括如下步骤的方法制备得到的用蛋白酶对芝麻蛋白进行水解，得到含有氨基酸序列为Asn-Cys-Ser的多肽的水解产物，即得到多肽混合物。本发明所制备的芝麻蛋白源金属螯合肽与肽微量元素螯合物，原料成本低，芝麻粕一般用于制作饲料的原料，而成品具有高附加值；本发明提供的金属螯合肽是2～3个氨基酸的金属螯合肽，分子量小，更易被消化道直接吸收；且生产技术对设备要求不高，具有投资少，易开发利用。
文档编号C07K19/00GK102286105SQ20111015945
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者李博, 汪婵 申请人:中国农业大学