专利名称：一种小麦麦谷蛋白亚基基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程技术、农业育种领域，具体涉及一种西藏小麦麦谷蛋白基因及其表达的蛋白。
背景技术：
小麦是禾本科(Gramineae)小麦属CTriticum L.) 一年生或越年生草本植物，是世界三大粮食作物(小麦、水稻和玉米)之一。随着人民生活水平的提高和食品加工业的飞速发展，对小麦品质的要求也越来越高。蛋白质的含量和质量是影响小麦营养品质和加工品质的关键因素。根据蛋白质的溶解特性将小麦籽粒蛋白分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白以及麦谷蛋白。清蛋白和球蛋白统称代谢蛋白，麦谷蛋白和醇溶蛋白统称贮藏蛋白。小麦种子的贮藏蛋白占小麦种子总蛋白的80%以上，是面粉中的主要蛋白，与小麦面粉加工品质密切相关。醇溶蛋白和麦谷蛋白分别决定面团的延展性和弹性。良好的弹性和延展性是制作优质面包的基础，与小麦的加工品质密切相关。麦谷蛋白是由多个蛋白质亚基通过二硫键相互作用、相互交联而形成的多聚体，分子量有数百万道尔顿，可分为两种类型 高分子量麦谷蛋白亚基(High-molecular-weight glutenin subunits，HMW-GS)，分子量约为 70-140kDa 和低分子量麦谷蛋白亚基(Low-mo 1 ecu 1 ar-weight glutenin subunits, LMW-GS)分子量为20-50kDa。麦谷蛋白的肽链间的二硫键和分子内的二硫键能够相互结合，加之其蛋白质多为极性氨基酸组成，极易形成大分子聚合体，使面团具有一定的弹性。 低分子量麦谷蛋白含量较高，约占整个种子贮藏蛋白的1/3，占麦谷蛋白的60%。因此选择优良的HMW-GS和LMW-GS等位基因是小麦品质改良中标记辅助选择的主要目标之一。 HMW-GS基因拷贝数较少，分子量较大，易于用SDS-PAGE区分，其等位基因变异及其与小麦品质的关系已得到了广泛深入的研究，针对其重要亚基的功能标记也已经开发和广泛应用。LMW-GS及其编码基因的研究虽然已经取得了一定的进展，但由于LMW-GS数目较多、分子量较小、且在普通的SDS-PAGE电泳图谱上易与大量的醇溶蛋白相互重叠，因此对LMW-GS 及其编码基因的数目以及LMW-GS与品质参数之间关系的研究很难有效的展开，有关这方面的研究仍在不断加强。近年来，随着一些新的研究方法的使用及一些已有研究方法的不断改进，很多LMW-GS蛋白得到分离鉴定，大量的LMW-GS基因得到克隆，特别是LMW-GS在小麦加工品质的重要性以及研究的必要性逐步得到认识，开展对LMW-GS基因的研究对于小麦品质的改良和提高具有重要意义，有关LMW-GS及其编码基因的研究也越来越受到重视。
发明内容
本发明以我国西藏地方小麦品种帮达冬麦-3为材料，所要解决的技术问题是提供了一种新的小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因的核苷酸序列及其表达蛋白的氨基酸序列。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为扩增上述小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因的引物序列为Pl :5，-ATGAAGACCTTCCTCGTCTTTG-3，；
P2 5，-TCAGTAGGCACCAACTCCG--3，
该种新的小麦优质低分子量麦:谷蛋白亚基基因，其基因核苷酸序列为
1ATGAAGACCTTCCTCGTCTTTGCCCTTCTAGCCGTTGTGGCGACATCTGCCATTGCGCAG
61ATGGATACTAGCTGCATCCCTGGTTTGGAGAGACCATGGCAGCAGCAACCATTACAACCA
121CMCAGATATTTCCACMCAaccaccatttTCACMCAACAACAACCATTTCCTCAACM
181ACACCATTTTCGCAGCAACAACCATCATTTTTGCAGCAACCACTATTTTCACAACAACAA
241CMCTAGTTCTACCACAACAACCAGCATTTTCGCAGCAACAACAMCAGTTCTACCGCM
301CMCCAGCATTTTCTCAGCAACAACACCAACAACTTCTGGACCAACAAATCCCTATTGTT
361CATCCATCCATTTTGCAGCAGCTAAACCCATGCAAGGTATTCCTCCAGCAGCAGTGTAGC
421CCTGTGGCAATGCCACMCGTCTTGCCAGGTCGCAGATGTGGCAGCAGAGCAGTTGCCAT
481GTGATGCAGCMCAATGTTGCCAACMTTGCCGCGAATCCCCGAACAATCCCACTATGAG
541GCAATCTGTGCTATCATCTTCTCCATCATCATGCMGAACAACAACAGGGTTTTGTCCM
601cctcagcagcmcaaccccaacagtcggttcaaggtgtctACCAACCCCAacagcagtcg
661CAGCAGCAACtcggacmtgTTCTTTCCAACAACCTCAACaactgggtcaacagcctcm
721cmcaactggtacaacatggtacctttttgcagccacaccagatagctcgccttgaggtg
781atgacttccaTTGCACTCCGtaccctgccaacgatgtgcagtgtcaatgtgccgttgtac
841agctccatcaCTAGTGTGCCATTCGGCGTTGGCAGCGGAGTTGGTGCCTACTGATAA
其表达蛋白的氨基酸序列为
1MKTFLVFALLAVVATSAIAQ
21MDTSCIPGLERPffQQQPLQP
41QQIFPQQPPFSQQQQPFPQQ
61TPFSQQQPSFLQQPLFSQQQ
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本发明从西藏地方小麦品种帮达冬麦-3中克隆了一个低分子量麦谷蛋白亚基基因 LMW--2基因，全长为897bp，在其编码区与其他LMW-GS基因和醇 容蛋白基因一 样都是双终
止密码子终止且中间无终止子。该基因编码297个氨基酸，分子量为31622. 89Da。该蛋白结构与典型的LMW-GS基因编码蛋白的结构相似，分为信号肽、N-末端、重复区和C-末端四个区域。C-末端又可进一步划分为C-I、C-II、C-III三个区。由于N-末端的第一个氨基酸是甲硫氨酸，因此这个基因属于LMW-m类。LMW-2基因编码的蛋白的氨基酸序列与其他已发表的LMW-GS基因编码的蛋白的氨基酸序列相比较发现，在不同的位点存在很多氨基酸替换、缺失、插入等等，这些特征可能导致具有该基因的小麦在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉烘烤加工品质主要指标上出现明显的变化。LMW-GS中普遍存在的8个半胱氨酸残基，且在蛋白质序列中的分布是很保守的，其中第一和第七个半胱氨酸形成分子间二硫键，其他6个半胱氨酸残基可以彼此连接形成分子内的二硫键。 麦谷蛋白的肽链间的二硫键和分子内的二硫键能够相互结合，加之其蛋白质多为极性氨基酸组成，极易形成大分子聚合体，使面团具有一定的弹性。但是本发明中LMW-2基因编码的蛋白除了与典型的LMW-GS基因一样在相似位置具有8个半胱氨酸残基外，由于碱基C突变成了 T，使得在其氨基酸序列的183位一个精氨酸突变成了一个半胱氨酸残基，从而使得这个LMW-GS基因编码的蛋白具有9个半胱氨酸残基。前人的研究发现具有9个半胱氨酸残基的LMW-GS与小麦的优良性状呈现正相关，因此LMW-2基因可能与小麦的优良品质相关。 基于上述原因，LMW-2基因可作为小麦品质改良过程中的候选基因。SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳)和蛋白飞行时间质谱(M0LDI-T0LF)对这个新发现LMW-GS基因编码的蛋白进行了分离和鉴定。与现有技术相比，本发明具有的优点如下1.本发明首次从西藏地方小麦品种帮达冬麦-3中克隆出了一种低分子量麦谷蛋白亚基基因。2.本发明中的测序和序列分析结果表明，LMW-2基因与已经公布的典型LMW-GS基因具有相似之处，但其具有独特之处，并且其独特之处是导致优良性状的潜在因素。一种具有SEQ ID NO :1所示核酸序列的小麦优质低分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法包括下述步骤1.种子基因组DNA提取a.干种子30mg (取胚乳部分)，研成粉沫，转入2ml离心管中。b.加入 200 μ 1 提取缓冲液 QOOmM Tris-HCl pH7. 5,2. 88Μ NaCl, 25mM EDTA, 0. 5% SDS)浸泡 30min。c.加入600 μ 1提取缓冲液，剧烈震荡lmin，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清液至新管。d.加入等体积预冷的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(Tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25 24 1)，混勻，4°C 12000rpm离心lOmin，小心将上清转入新管。e.加入等体积预冷氯仿/异戊醇(氯仿、异戊醇的体积比为M 1)，混勻， 40C 12000rpm离心lOmin，上清至新管。f.向上清液中加入600μ 1预冷的异丙醇，轻轻颠倒几次，-20°C沉淀30min， 4°C IOOOOrpm离心，弃上清。g.用500 μ 1 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C 8000rpm离心5min，重复一次。h.沉淀放超净工作台中室温干燥。i.加入 50 μ 1 灭菌 ddH20，4°C溶解 12h。j. 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。2. PCR 扩增(1)引物设计
LMW-GS基因的N-端和C-端序列高度保守，参照Ikeda和Pei等人的研究，选取了特异引物扩增低分子量麦谷蛋白基因的编码区。引物序列如下Pl :5’ -ATGAAGACCTTCCTCGTCTTTG-3，；P2 :5， -TCAGTAGGCACCAACTCCG-3，
(2) PCR反应 a.反应体系为20 μ 1
2 χ GC Buffer II
dNTP混合物(各2.5 mM)
Pl (20 Um
P2 (20 uM)
DNA 模板(IOOng)
TransTap HiFi DNA Polymerase (5 U/ul)
ddH20
2 μ 2 μ 0.4μ1 0.4μ1 Ιμ 0.2 μ 14 μ 20 μ b.
Total
反应条件
95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸50秒，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。1 %琼脂糖胶检测PCR产物，Ikb DNALadderMarkers为鼎国生物公司生产。(3) PCR产物的回收纯化琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带，用BI0MIGA公司的DNA凝胶回收试剂盒进行回收。
3. PCR产物的克隆 (1)连接反应
回收的PCR产物与pGEM-T vector (Tiangen) 16°C连接过夜，反应体系如下
IOxrapid ligation buffer pGEM-T Eesy Vector T4 DNA Ligase
PCR回收产物 Total
Ιμ Ιμ Ιμ 7μ1 10 μ (2)感受态细胞的制备与大肠杆菌的转化a.划板复壮宿主菌DH-5 α。b.挑取1个生长良好的单菌落(直径2-3mm)至含有30ml LB液体养基的锥形瓶中，37°C 200rpm振荡培养过夜。
取
Lu-Myiiw υ
500 μ 1菌液接种50ml LB液体培养基，37°C震荡培养至0D600 = 0. 3-0. 4。
d.菌液转入无菌一次性使用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置lOmin。e. 4°C 4100rpm 离心 lOmin，收集细胞。f.弃上清，用IOml冰预冷的0. IM CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置lOmin， 4°C 4100rpm离心lOmin，重复此步骤一次。g.用2ml冰预冷的0. IM CaCl2溶液悬浮细胞，加入灭菌甘油至终浓度30%，分装后放至0°C备用或存于-70°c。h.力Π 10 μ 1连接产物至100 μ 1的感受态细胞中，轻弹管壁混勻内含物，冰上放置 30minoi. 42°C热激90秒，立即插入冰中冷却anin。j.加入800 μ 1 37°C预热的LB液体培养基，37°C，200rpm,振荡培养45分钟。k. 4000rpm离心4秒，吸掉700 μ 1上清，剩下的吹散细胞，均勻的铺于涂有IPTG， X-Gal和Amp 80 μ g/mlLB平板，37°C倒置培养12-16小时，置4°C冰箱中显色4_6小时。(3)质粒的小量提取用于酶切验证或PCR检测a.挑取单菌落于IOml LB+(Amp 80 μ g/ml)液体培养基，37°C培养过夜。b.取1.5ml菌液至的2ml离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体，重
复一次。c.加 ΙΟΟμ 1 冰预冷的溶液 I(50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8. OUOmM EDTA PH8.0)，震荡，充分悬浮菌液，室温放置5分钟。d.加新鲜配制的200 μ 1的溶液II (0. 2MNa0H、1 % SDS)，上下颠倒不超过5次，冰
上放置5分钟。e.加 150 μ 1 冰预冷的溶液 III (60ml 5M 乙酸钾、11. 5ml 冰乙酸、28. 5ml ddH20)上下颠倒不超过5次，冰上放置，直至形成紧实的团块，12000rpm离心10分钟，上
清移至新离心管。f.加等体积的酚/氯仿(1 1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，上清移至新离心管。g.加2倍体积的无水乙醇，混勻，_20°C放置1小时，12000rpm离心10分钟。h.用75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复一次。i.吹干，溶于50μ 1灭菌ddH20(含0. 02mg/ml RNase)中，做电泳检测。(4)重组质粒PCR和酶切鉴定a.按PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定。b.酶切鉴定体系如下
EcoRIΙμ IOXHBuffer2 μ 重组质粒5 μ 灭菌水12 μ Total20 μ
370C酶切4小时，然后1 %琼脂糖凝胶电泳检测，限制性内切酶EcoRI购自大连宝生物工程公司(TaKaRa)。(5)序列测定以上经鉴定的质粒，以SP6和T7为引物，由SIN0GEN0MAX公司进行DNA序列测定。综上可知，本发明中获得的LMW-2基因不仅扩大了小麦低分子量麦谷蛋白亚基的基因库，而且因其具有独特的特征，可作为小麦品质改良过程中的优良的候选基因。
具体实施例方式实施例1帮达冬麦-3和帮达冬麦-4是遗传背景相似的西藏地方小麦品种，亲缘关系很近， 且这两个小麦品种在品质、性状方面也相似。序列分析表明帮达冬麦-3具有LMW-2基因， 帮达冬麦-4不具有LMW-2基因。实验测定帮达冬麦-3的沉降值为38mL，帮达冬麦_4的沉降值为18mL，前者较后者提高了 111%。实施例2本发明采用软件PSIPRED3.0来预测LMW-2基因编码蛋白的二级结构。蛋白质二级结构是蛋白质复杂的空间构象的基础，由4种结构单元组成a-螺旋，β-折叠、β-转角和无规则卷曲。在PSIPRED的预测结果中，不区分β-折叠和转角，仅分为3类，即 a-螺旋，β-折叠和无规则卷曲。前人研究发现β-折叠能赋予蛋白显著抗变形的能力。 优质亚基与劣质亚基相比，在二级结构上的差别主要表现为折叠含量的不同，折叠折叠含量高的亚基表现为优良品性。前人的研究还发现，a-螺旋的个数和含量等都会极大影响小麦的加工品质。NCBI登录号为AY214452的基因编码的低分子量麦谷蛋白亚基可以改善面筋品质，被用作二级结构预测的对照。其中AY214452基因编码的蛋白质的二级结构中有7个a-螺旋和2个β-折叠，β-折叠含量为1.21%。LMW-2基因编码的蛋白质的二级结构中有9个a-螺旋和2个β -折叠，β -折叠含量为1.81%。LMW-2编码的亚基比 ΑΥ214452多2个a-螺旋。虽然两个基因编码亚基β _折叠的个数是相等的，但是从含量上来看，LMW-2高于ΑΥ214452。因此LMW-2基因可作为小麦品质改良过程中的优质候选基因。
权利要求
1.一种小麦麦谷蛋白亚基基因，其特征是具有如下核苷酸序列SEQID NO 11ATGAAGACCTTCCTCGTCTTTGCCCTTCTAGCCGTTGTGGCGACATCTGCCATTGCGCAG61ATGGATACTAGCTGCATCCCTGGTTTGGAGAGACCATGGCAGCAGCAACCATTACAACCA121CAACAGATATTTCCACAACAACCACCATTTTCACAACAACAACAACCATTTCCTCAACAA181ACACCATTTTCGCAGCAACAACCATCATTTTTGCAGCAACCACTATTTTCACAACAACAA241CAACTAGTTCTACCACAACAACCAGCATTTTCGCAGCAACAACAAACAGTTCTACCGCAA301CAACCAGCATTTTCTCAGCAACAACACCAACAACTTCTGGACCAACAAATCCCTATTGTT361CATCCATCCATTTTGCAGCAGCTAAACCCATGCAAGGTATTCCTCCAGCAGCAGTGTAGC421CCTGTGGCAATGCCACAACGTCTTGCCAGGTCGCAGATGTGGCAGCAGAGCAGTTGCCAT481GTGATGCAGCAACAATGTTGCCAACAATTGCCGCGAATCCCCGAACAATCCCACTATGAG541GCAATCTGTGCTATCATCTTCTCCATCATCATGCAAGAACAACAACAGGGTTTTGTCCAA601CCTCAGCAGCAACAACCCCAACAGTCGGTTCAAGGTGTCTACCAACCCCAACAGCAGTCG661CAGCAGCAACTCGGACAATGTTCTTTCCAACAACCTCAACAACTGGGTCAACAGCCTCAA721CAACAACTGGTACAACATGGTACCTTTTTGCAGCCACACCAGATAGCTCGCCTTGAGGTG781ATGACTTCCATTGCACTCCGTACCCTGCCAACGATGTGCAGTGTCAATGTGCCGTTGTAC841AGCTCCATCACTAGTGTGCCATTCGGCGTTGGCAGCGGAGTTGGTGCCTACTGATAA 。
2.根据权利要求1所述的小麦麦谷蛋白亚基基因，其特征是其表达蛋白的氨基·列为SEQID NO 21MKTFLVFALL AVVATSAIAQ21MDTSCIPGLE RPffQQQPLQP41QQIFPQQPPF SQQQQPFPQQ61TPFSQQQPSF LQQPLFSQQQ81QLVLPQQPAF SQQQQTVLPQ101QPAFSQQQHQ QLLDQQIPIV121HPSILQQLNP CKVFLQQQCS141PVAMPQRLAR SQMWQQSSCH161VMQQQCCQQL PRIPEQSHYE181AICAIIFSII MQEQQQGFVQ201PQQQQPQQSV QGVYQPQQQS221QQQLGQCSFQ QPQQLGQQPQ 241 QQLVQHGTFL QPHQIARLEV 261 MTSIALRTLP TMCSVNVPLY 281 SSITSVPFGV GSGVGAY**
3.权利要求1或2所述的小麦麦谷蛋白亚基基因在作物遗传育种中的用途。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种西藏小麦低分子量麦谷蛋白亚基的基因及其表达的蛋白。本发明以我国西藏地方小麦品种帮达冬麦-3为材料，首次从帮达冬麦-3中克隆出了LMW-GS基因，提供一种新的小麦低分子量麦谷蛋白基因的核苷酸序列和表达蛋白的氨基酸序列。其核苷酸序列和氨基酸序列具有与优良品质相关的特征，可作为小麦品质改良中的优质候选基因。
文档编号C07K14/415GK102367445SQ20111036115
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者兰秋霞, 冯波, 徐智斌, 王涛, 赵国君 申请人:中国科学院成都生物研究所