专利名称：包含dreb功能域的四翅滨藜基因及抗逆基因工程应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcDREB。
背景技术：
自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫， 限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是， 当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的抗受力提供更多的候选基因。四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、 半干旱地区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5°C左右，极端最低温度_40°C的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，种6. 07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收It以上的盐分，是荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶含12% 以上的粗蛋白，生物量达15t/hm2，同时有积累硒的能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主要还是用于牧场改良。在印度，从美国等国引进了 12种滨藜品种改良了 700万 hm2的盐碱地，突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm2荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、北非、以色列和北美地区滨藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一， 也是绿化和水土保持的优良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的抗干旱、抗低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。酿酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达系统还被广泛地应用到植物抗盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的抗盐性，从而表明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表达系统研究大豆SAL 13-2蛋白功能，将大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体PYES2上，并转化酵母菌INV&1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的抗盐能力。酿酒酵母菌株INVkl (基因型为MATa his3Dlleu2 trpl-289ura3-52)是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。DREB(Dehydration responsive element-binding protein)转录因子艮口脱水应答元件结合蛋白质，对调控逆境诱导基因的表达具有非常重要的作用。它能特异结合启动子中含有的DRE/CRT顺式元件(核心基序G/ACCGAC)，激活许多逆境诱导基因的表达，增强植物对逆境的忍抗力植物在逆境胁迫应答反应中存在着复杂的信号传递途径，并且各种胁迫信号传递途径间通过某些共同的组分联系在一起，构成一个复杂的信号传递网络。 DREBla/CBF3、DREBlb/CBFl、DREBlc/CBF2及DREB2主要参与不依赖ABA的信号传导途径， 而CBF4主要参与依赖ABA的信号传导途径。细胞膜感知低温等逆境信号，通过信号传导激活以CBF/DREB信号途径为主、兼与其它途径交谈和交叠所构成的信号网络，改变基因的时空表达，继而调控下游相应功能蛋白的表达，赋予植物低温等逆境抗性。正常生长情况下， 植物体内几乎检测不到DREB转录物的存在，转录因子的这种快速表达使人们推测植物体存在调控DREB转录的上游转录因子ICE (Inducer of CBF expression)，它在正常生长状态下以非活性形式存在，受低温胁迫时，ICE因子则被激活并与DREB基因的启动子结合从而诱导DREB的转录。DREB转录因子能识别DRE顺式作用元件，当植物受到外界环境胁迫时，DREB转录因子与DRE顺式作用元件结合，犹如一个开关被打开一样，rdl7、rc^9A、kinl、 erdl0,cor6.6,corl5a,cor78a等相应的胁迫抗受基因得到表达，最终使植物的抗逆性获得增强。kki等(2008年)研究DREBlA的超表达将激活至少40个逆境应答基因的表达，其产物包括一些转录调控因子、糖转运蛋白、碳水化合物代谢相关蛋白、胚胎发育晚期丰富蛋白、冷诱导蛋白、渗透保护生物合成蛋白等，通过这些基因产物的表达以及协同作用综合提高植物对逆境的抵抗能力。所以DREB类转录因子在基因的表达调控方面起着非常重要的作用。应当看到，在利用DREB类转录因子进行抗逆基因工程改良的过程中，转基因植株的抗旱、抗盐及抗寒性等得到不同程度的改良，达到了预期目的REB转录因子感受胁迫信号，短时间内表达量迅速增加，调控下游抗逆相关功能基因的表达，增加植株的抗逆性。提高植物的抗逆性是农业、林草业发展的迫切需要，利用转基因技术构建具有优良抗性的粮食作物和经济作物正方兴未艾。DREB转录因子的分离和鉴定工作为采用基因工程技术将获得的外源基因导入植物，获得抗逆基因超表达的转基因植物奠定了坚实的基础，因此该类研究具有重要的理论研究价值和广泛的应用前景。其中，转化pYES-AcDREB重组载体的酵母INVkl菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表现出较强抗性，在众多研究中，还无有关含DREB功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。
发明内容
本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10°C )和盐GOOmM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用hvitrogen公司 SuperScript Full-LengthcDNA Library Construction Kit 构建全长 cDNA 文库，并通过 Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVkl，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用抗盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜抗盐碱和抗低温分子机制研究提供依据。本发明使用酵母表达载体pYES_DEST52(购自^witrogen公司)，插入本发明 AcDREB蛋白DNA编码序列以及得到重组表达载体pYES_AcDREB，它除了携带有AcDREB蛋白 DNA编码序列外，还有T7启动子、GALl启动子、CYCl终止转录信号、URA3基因、fl复制基因、PUC复制基因、酵母2 μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、Vkpitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。从四翅滨藜全长uncut cDNA文库中EST测序得到AcDREB (Atriplex canescens Dehydration responsive element-binding protein)基因，并通过 Gateway 技术 LR 重组到酵母表达载体PYES-DEST52中。AcDREB基因由1576个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame) 1162bp，同时还提供 5，-UTR 和 3，-UTR 序列，AcDREB 为序列表中的SEQ ID N0:1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。本发明的一个目的是提供含DREB功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因并进行应用。本发明提供一种植物抗逆相关蛋白抗Na2C03、NaHCO3、高温、活性氧和干旱等胁迫，名禾尔为 AcDREB(Atriplex canescens Dehydration responsive element-binding protein)，来源于四翅滨藜。一种植物抗逆相关蛋白AcDREB，其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB，的编码序列为序列表中SEQ ID NO :1的5，端第4-1165位脱氧核苷酸，序列表中的SEQ ID No :1由1576个脱氧核苷酸组成。序列表中SEQ ID NO 2由386个氨基酸残基组成，其中88个疏水氨基酸，298个亲水氨基酸，亲水性极强，48个碱性氨基酸，60个酸性氨基酸，蛋白质分子量为42. 7kD，等电点为4. 61，运用DNAMAN软件预测，不含信号肽。四翅滨藜AcDREB蛋白未见报道。植物抗逆性相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；2)编码序列表中SEQ ID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白 AcDREB的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码植物抗逆相关蛋白AcDREB 的核苷酸分子。以上4)中所述高严谨条件是指可为在0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜的条件。
一种重组表达载体，其特征在于含有植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因 AcDREB0一种重组菌，其特征在于含有植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB (以下简称编码基因AcDREB)。为了使(a)中的AcDREB便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或梭基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
权利要求
1.一种植物抗逆相关蛋白AcDREB，其特征在于其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)将序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。
2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB，其特征在于所述的编码基因AcDREB的编码序列为序列表中SEQ ID NO=I的5，端第4-1165位脱氧核苷酸。
3.按权利要求2所述植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB，其特征在于所述编码基因AcDREB的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示；2)编码序列表中SEQID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDREB的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDREB的核苷酸分子。
4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的植物抗逆相关蛋白 AcDREB的编码基因AcDREB。
5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述的植物抗逆相关蛋白AcDREB的编码基因AcDREB。
全文摘要
包含DREB功能域的四翅滨藜基因及抗逆基因工程应用属植物基因工程技术领域，本发明提供的AcDREB包含由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成、将SEQ ID NO2的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基取代或缺失或添加且与由SEQ ID NO2衍生的蛋白质；编码基因AcDREB的编码序列如下之一a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；b.编码SEQ ID NO2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcDREB导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母抗干旱抗高温抗盐碱抗活性氧胁迫能力。
文档编号C07K14/415GK102492031SQ20111040116
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者余刚, 刘金亮, 张世宏, 李敬涛, 李桂华, 潘洪玉, 贾承国, 陈宣明 申请人:吉林大学