γ-丁内酯的生产方法

专利名称：γ-丁内酯的生产方法
Y-丁内酯的生产方法
背景技术：
随着日益减少的石油资源、日益增加的能量价格和环境问题，开发节省能量的生物精制方法来从可再生的、低成本的、碳资源生产基于生物的化学制品，会提供克服基于石油的化学制品的日益增加的限制的独特解决方案。可以使用生物精制方法生产的、具有广泛工业和制药用途的一种化学制品是Y-丁内酯(GBL)。据估测，GBL的全球市场需求是8.5亿磅/年，换而言之，每年的总销售额是10亿美元。Y-丁内酯是一种无色的、弱气味的液体，主要用作下述商业上重要的化学制品的生产的中间体诸如1，4_ 丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2_吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)诸如此类。这些化学制品可以用于高性能溶剂中，用于电子学、润滑油提取、磁性丝涂层、工程 树脂、药物中间体、化妆品、喷发剂和高价值的聚合物。GBL本身具有许多用途，包括作为用于油漆剥离的溶剂、脱脂剂、聚氨酯的粘度调节剂、水溶性墨汁的分散剂、氨基甲酸酯和聚酰胺的固化剂、包被金属的塑料的蚀刻剂、橡胶添加剂和除草剂成分。通过几种不同的化学方法来生产基于石油的GBL。例如，可以通过Y-羟基丁酸(GHB)的脱水，通过乙炔与甲醛的反应或马来酸酐或琥珀酸酐和它们的酯的汽相氢化合成它。后两种方法分别称作Reppe方法和Davy方法。Reppe方法形成于二十世纪四十年代，在历史上是制备1，4_ 丁二醇的第一种商业途径。该方法从使乙炔和甲醛一起反应开始，然后进行一系列氢化级，以得到BD0，最后脱氢，以产生GBL。该方法的主要缺点是，起始反应物是非常危险的，通常会带给生产商操作挑战和环境挑战。另外，乙炔是相对昂贵的原料。Davy方法形成于二十世纪九十年代，该方法使用多级方法，从使熔化的马来酸酐与甲醇反应生成马来酸单甲酯开始。接着，在有酸性树脂催化剂存在下，将马来酸单甲酯从马来酸单甲酯转化成马来酸二甲酯。使用催化的汽相氢化，将马来酸二甲酯转化成琥珀酸二甲酯，最后通过一系列其它的反应，转化成GBL。精制终产物，以得到高纯度的GBL。许多专利描述了用于将马来酸酐或琥珀酸酐转化成GBL的不同类型的氢化催化剂。这些包括亚铬酸铜(参见美国专利号3，065，243)、含有镍的亚铬酸铜(美国专利号4，006, 165)和氧化铜、氧化锌或氧化铝的混合物(美国专利号5，347，021)以及还原的氧化铜和氧化铝混合物(美国专利号6，075，153)。尽管大量氢化催化剂可用于GBL生产，存在需要克服的催化剂性能的缺陷，诸如产率、选择性、产物回收的容易性和成本。因此，需要开发新的GBL生产方法，所述方法不仅解决了产率、纯度和生产成本的改进，而且使用对环境具有更积极影响的可持续的原料。

发明内容
本发明一般地涉及集成的生物精制方法，所述方法用于从可再生的碳资源生产高纯度的、高产率的、基于生物的Y-丁内酯(GBL)产物。在一个方面，描述了一种从经遗传工程化的微生物生物质生产Y-丁内酯(GBL)产物的方法，所述微生物生物质代谢葡萄糖或任何其它可再生的原料来在微生物细胞内生成4-羟基丁酸同聚物(P4HB)，随后与催化剂一起受控地加热含有P4HB的生物质，形成Y-丁内酯(GBL)产物。生物质中P4HB的水平应当大于总生物质的10重量％。该生物过程的优点是，它使用可再生的碳源作为原料，所述经遗传工程化的微生物以非常高的产率生产P4HB而对宿主细胞没有不利的毒性效应(这会限制过程效率)，且当与催化剂相混合并加热时，能够以高产率生产高纯度的基于生物的GBL。在某些方面，来自宿主生物体的重组工程化的P4HB生物质充当可再生源用于将4-羟基丁酸同聚物转化成有用的中间体GBL。在有些实施方案中，可再生原料源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或这些中的2种或更多种的组合。然后在有催化剂存在下处理生产的P4HB生物质 ，以生成Y-丁内酯(GBL)。在其它实施方案中，在与催化剂混合之前，干燥所述P4HB生物质。在特定实施方案中，所述方法另外包括回收Y-丁内酯产物。在某些实施方案中，所述回收是通过浓缩。在有些实施方案中，进一步加工所述GBL以用于生产其它希望的商品和专门产品，例如1，4_ 丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2_吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。已经通过如下方式遗传修饰用于生产含有P4HB的生物质的宿主生物体在野生型或经遗传工程化的P4HB生产生物体中导入基因和/或删除基因，从而建立从廉价的可再生的原料合成P4HB的菌株。在图I中提供了用于产生P4HB的一个示例性的途径，应当理解，也可以导入或抑制构成该途径的其它酶学变化以用于希望的P4HB生产。在一个方面，本发明提供了一种用于生产基于生物的Y-丁内酯产物的方法。在某些实施方案中，产物中的Y-丁内酯具有100%的基于生物的碳含量(例如，基于14C同位素分析来测定)。所述方法包括混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂；将所述生物质与催化剂一起加热，以将4-羟基丁酸转化成Y-丁内酯产物。在某些实施方案中，Y-丁内酯产物的产率是约85重量％或更大，这基于产物中的I克Y-丁内酯/克聚-4-羟基丁酸。所述经遗传工程化的重组宿主生产4-羟基丁酸聚合物。在另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。在另一个方面，所述宿主具有2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个或全部5个稳定掺入的、编码上面列出的酶的基因。在本发明的另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-Cok连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-Cok ；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛
3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ；NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-轻基丁酰基-CoA ;并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏yneI、gabD、pykF、pykA、maeA 和 maeB。在另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自这样的重组宿主，所述重组宿主具有聚-4-羟基丁酸途径，并稳定地表达编码2种或更多种酶的2个或更多个基因、编码3种或更多种酶的3个或更多个基因、编码4种或更多种酶的4个或更多个 基因或编码5种或更多种酶的5个或更多个基因，所述酶选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H ；NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3 二磷酸甘油酸，形成NADH+H ;并任选地在选自下述的I个或多个基因、2个或更多个基因、3个或更多个基因、4个或更多个基因、5个或更多个基因或6个基因中具有破坏ynel、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。在另一个实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。在另一个实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-Cok连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-Cok连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ；NADP依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ；NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏ynel、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。在某些实施方案中，其中用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主具有稳定地掺入的、编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将 4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。在其它实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-Cok ；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3_ 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ;NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成I，3- 二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏ynel、gabD、pykF、pykA、maeA 和 maeB。在本发明的一个特定方面，使用可再生的原料培养重组宿主，以生产4-羟基丁酸生物质，然后在有催化剂存在下处理生产的生物质，以生产Y-丁内酯(GBL)产物，其中
Y- 丁内酯产物的产率是约85重量％。在某些实施方案中，可再生的原料源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组合。本发明也涉及通过本文所述的方法生产的基于生物的Y-丁内酯产物。在某些方面，生产的产物中的Y-丁内酯的量是85%或大于85%。在另一个方面，本发明涉及从可再生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质，所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为用于生产
Y- 丁内酯产物的原料，其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于生物质的50重量％。在本发明的某些实施方案中，所述生物质宿主是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。所述细菌包括、但不限于大肠杆菌、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus,重命名为真养产喊杆菌(Ralstonia eutropha))、芽抱杆菌属(Bacillus spp·)、广泛产喊菌(Alcaligenes latus)、固氮菌属(Azotobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、丛毛平胞菌属(Comamonas)、假单胞菌(Pseudomonads)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、聚球藻属(Synechococcus sp. )PCC7002、聚球藻属 PCC 7942、集胞藻属(Synechocystis sp. )PCC6803和嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-I (蓝细菌)、微温绿硫菌(Chlorobium tepidum)(绿硫细菌)、Chloroflexus auranticus (绿非硫细菌)、微温着色菌(Chromatium tepidum)和酒色着色菌(Chromatium vino sum)(紫色硫细菌)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。在其它实施方案中，所述重组宿主是藻类。所述藻类包括、但不限于微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii) > 富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、捕圆形小球藻(Chlorellaellipsoidea)、小球藻属(Chlorella sp.)或原始小球藻(Chlorella protothecoides)。在本发明的某些实施方案中，所述加热是在下述温度下约100°C至约350°C，或约200°C至约350°C，或约225°C至300°C。在有些实施方案中，所述加热会将生物质的水含 量降低至约5重量％或更低。在所述的实施方案中，所述加热持续约30秒至约5分钟的时间段，或是约5分钟至约2小时。在某些实施方案中，所述Y-丁内酯包含小于5%的不希望的副产物。在某些实施方案中，所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。催化剂的重量百分比是在约4%至约50%的范围内。在具体实施方案中，催化剂的重量百分比是在约4%至约50%的范围内，且所述加热是在约300°C下。在某些实施方案中，进一步回收Y-丁内酯产物。在有些实施方案中，所述催化剂是4重量％的氢氧化钙，且所述加热是在300°C的温度下。另外，已消费的(残余的)PHA减少的生物质进一步用于能源开发，例如用作燃料，以产生过程蒸汽和/或热。


从在附图中图解的本发明的示例实施方案的以下更具体的描述会明白前述内容，在所述附图中，同样的参考符号表示在不同的视图中的相同部分。所述附图不一定按照比例绘制，而是重点在于图解本发明的实施方案。图I是示例性的大肠杆菌中心代谢途径的示意图，它显示了在实施例中修饰的或导入的或者可以修饰的反应。在图中的编号表示在表IA中的反应编号。用“X”标记通过删除对应的基因而消除的反应。缩写“GA3P”，D-甘油醛-3-磷酸；“G1，3P”，1，3-二磷酸甘油酸；“PEP”，磷酸烯醇丙酮酸；“PYR”，丙酮酸；“AcCoA”，乙酰辅酶A ;“CIT”，柠檬酸；“ICT”，异柠檬酸；“ a KG”，α -酮戊二酸；“SUC-CoA”，琥珀酰CoA ;“SUC”，琥珀酸;“Fum，，，富马酸；“MAL”，L-苹果酸；“0AA”，草酰乙酸；“SSA”，琥珀酸半醛；“4HB”，4-羟基丁酸；“4HB_CoA”，
4-羟基丁酰基CoA;“P4HB”，聚-4-羟基丁酸。编号的反应“ 1”，甘油醛_3_磷酸脱氢酶；“2”，丙酮酸激酶；“3”，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；“4”，苹果酸酶；“5”，异柠檬酸裂合酶；“6”，苹果酸脱氢酶；“7”，琥珀酸半醛脱氢酶；“8”，α-酮戊二酸脱羧酶；“9”，琥珀酸半醛还原酶；“10”，CoA转移酶；“ 11”，聚羟基链烷酸酯合酶；“12”，琥珀酸半醛脱氢酶，NADP+依赖性的。
图2根据不同的实施方案从生物质回收GBL而将残余物转化成固体燃料的示意图。图3是根据不同的实施方案在不加入石灰(实线)和加入5%石灰(虚线)时干燥的P4HB发酵液在300°C在N2中的重量减轻相对于时间的曲线。该曲线显示了重量减轻斜率和重量减轻完成的开始时间。图4 (A-C)是根据一个实施方案在300°C热解以后的P4HB纯聚合物、P4HB干燥发酵液和P4HB干燥发酵液+5%石灰(Ca(OH)2)催化剂的一系列气相色谱图。图5是根据一个实施方案在6. 2min处的GC-MS峰与GBL( Y - 丁内酯)的质谱文
库匹配。图6是根据一个实施方案在11. Imin处的GC-MS峰与GBL 二聚体的质谱文库匹配。
图7是用于P4HB生物质的大规模热解的装置的示意图。
具体实施例方式下面描述了本发明的示例实施方案。本发明提供了用于从生产聚-4-羟基丁酸聚合物的经遗传工程化的微生物(P4HB生物质)生产基于生物的Y-丁内酯(GBL)的工艺和方法。为了本发明的目的，将P4HB定义为也包括4-羟基丁酸与3-羟基丁酸的共聚物，其中4-羟基丁酸在共聚物中的百分比大于共聚物中单体的80%、85%、90%，优选地大于95%。在某些实施方案中，使用本文所述的重组宿主，通过改良的P4HB生产工艺来生产P4HB生物质。通过操纵(例如，抑制和/或过表达)P4HB途径中的某些基因来增加P4HB在生物质中的产率，已经遗传地构建这些重组宿主，以增加P4HB的产率。在发酵过程中生产P4HB生物质，其中给经遗传工程化的微生物供给可再生底物。可再生底物包括从植物作物材料生产的发酵原料,诸如糖类、植物油、脂肪酸或合成气体。从糖底物生产的生物质中的P4HB水平是生物质的总干重的大于10%(例如，约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80% )。然后将P4HB生物质与催化剂混合，并加热，以将P4HB热分解成基于生物的GBL。本文描述了一种用于生产GBL的替代方法，所述方法基于使用可再生的碳源来在生物质中生产基于生物的聚-4-羟基丁酸(P4HB)聚合物，然后将其转化成基于生物的Y-丁内酯。基于生物的、可生物降解的聚合物诸如聚羟基链烷酸酯(PHA)在生物质系统中天然地生成，诸如微生物生物质(例如，包括蓝细菌在内的细菌、酵母、真菌)、植物生物质或藻类生物质。已经开发了遗传修饰的生物质系统，所述系统以高产率生产多种可生物降解的 PHA 聚合物和共聚物(Lee (1996), Biotechnology&Bioengineering 49 :1-14 ；Braunegg等人(1998), J.Biotechnology 65 :127-161 ；Madison, L. L.和 Huisman, G. ff. (1999)，Metabolic Engineering of Poly-3-Hydroxyalkanoates ；From DNA to Plastic, 见Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 :21-53)。众所周知PHA聚合物是热不稳定的化合物，当被加热至和超过它们的熔点时会容易地降解(Cornelissen等人，Fuel，87，2523，2008)。当该聚合物加工用于塑料用途时，这通常是一个限制因素，但是，可以对其加以影响以建立从100%可再生资源开始的基于生物的、化学生产方法。当将纯的聚-4-羟基丁酸(P4HB)(使用石油衍生的1，4_ 丁二醇生产)加热至250-350°C时，它通过聚合物链的解链而专门地热降解成挥发性的GBL(Kim等人(2006)，Polymer Degradation and Stability,91 :2333-2341)。如本文所述，将低成本的催化剂加入具有增加的P4HB产量的经遗传工程化的生物质以加速向Y - 丁内酯的降解反应。回收Y-丁内酯，且廉价的催化剂可以遗留在残余的生物质一起或者可以任选地在适当的再生(包括热再生)以后再循环利用到该方法中。将催化剂反应物与特别地遗传修饰的、高产率地生产P4HB的生物质相混合是对于传统的基于石油的方法的经济的且环境友好的替代方法。具有用于生产P4HB的代谢途径的重组宿主作为改良的和新材料的生产平台的宿主(例如，细菌、真菌、藻类、植物等)的基因工程提供了用于生产化学制品的高价值的、环境友好的工业应用的可持续解决方案。本文描述了从遗传修饰的重组聚羟基链烷酸酯P4HB生物质生产基于生物的Y - 丁内酯的工艺方法。本文所述的方法通过在培养后或收获后生产基于生物的化学制品来避免对宿主生物体的毒性效应，是节省成本的且高效的(例如，使用更少的能量来制备)，减少温室气体排放，使用可再生资源，且可以进一步加工以从GBL高产率地生产高纯度产物。在本文所述的方法中使用的PHA生物质进行遗传工程化以生产聚-4-羟基丁酸(P4HB)。在图I中提供了用于生产P4HB的一个示例性的途径，在下面提供了所述途径、生产P4HB生物质的重组宿主的更详细描述。所述途径可以工程化以增加来自碳进料源的P4HB产量。本文使用的“P4HB生物质”意图指来自重组宿主(例如，细菌)的任何经遗传工程化的生物质，所述生物质包括非天然存在量的聚羟基链烷酸聚合物例如聚-4-羟基丁酸(P4HB)。在有些实施方案中，P4HB生物质的来源是细菌、酵母、真菌、藻类、植物作物、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。在某些实施方案中，与没有过表达或抑制P4HB途径中的一个或多个基因的宿主相比，P4HB的生物质滴度(g/L)已经增加。在某些实施方案中，所述P4HB滴度被报告为干细胞重量百分比dew)或P4HB克数/Kg生物质。

“过表达”表示由导入宿主细胞中的DNA编码的多肽或蛋白的表达，其中所述多肽或蛋白通常不存在于宿主细胞中，或其中所述多肽或蛋白以比编码所述多肽或蛋白的内源基因通常表达的水平更高的水平存在于宿主细胞中。“抑制”或“下调”表示编码多肽或蛋白的基因的抑制或删除。在有些实施方案中，抑制是指灭活产生该途径中的酶的基因。在某些实施方案中，从异源生物体导入所述基因。已经开发了使用快速生长的宿主(诸如大肠杆菌)的经遗传工程化的微生物PHA生产系统。在某些实施方案中，基因工程也允许修饰野生型微生物以提高P4HB聚合物的生产。在 Steinbuchel&Valentin，FEMS Microbiol. Lett. 128 :219-28(1995)中描述了 PHA产生修饰的实例。PCT公开号WO 98/04713描述了用于控制分子量的方法，其中使用基因工程来控制 PHA 合酶的水平。在 Lee, Biotechnology&Bioengineering, 49 1-14 (1996)和Braunegg 等人，(1998), J. Biotechnology 65 :127-161 中，公开了用于生产 PHA 的、商业上有用的菌株，包括真养产碱菌(重命名为真养产碱杆菌)、广泛产碱菌、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)和假单胞菌。美国专利号 6，316，262、7，229，804、6，759，219 和6，689，589描述了用于生产含有4-羟酸的PHA聚合物的生物系统，它们通过弓I用并入本文。尽管已经报道从可再生资源(诸如糖或氨基酸)生产4-羟基丁酸共聚物，从可度量的可再生底物生产的共聚物中4HB的水平远远小于共聚物中单体的50%，因此不适用于实施所公开的发明。之前尚未实现使用可再生资源、使用工程化的微生物生产P4HB生物质，其中生物质中的P4HB水平足以实施公开的发明(即，大于总生物质干重的40%、50%、60%或 65% )。野生型生物质中的PHA重量百分比随生物质的来源而变化。对于通过发酵过程从基于可再生资源的原料(诸如糖类、植物油或甘油)生产的微生物系统，野生型生物质中的PHA的量可以是生物质总重量的约65重量％或更多。对于植物作物系统、尤其是生物质作物(诸如甘蔗或柳枝稷)，PHA的量可以是生物质总重量的约3%或更多。对于藻类或蓝细菌系统，PHA的量可以是生物质总重量的约40%或更多。在本发明的某些方面，所述重组宿主已经被遗传工程化，以与野生型宿主相比生产增加的量的P4HB。野生型P4HB生物质是指生物体通常在自然界中生产的P4HB的量。例如，在某些实施方案中，所述P4HB与野生型相比增加了约20%至约90%，或约50 %至约80 %。在其它实施方案中，所述重组宿主生产的P4HB与野生型相比增加了至少约 20 %，与野生型相比增加了至少约30 %，与野生型相比增加了至少约40 %，与野生型相比增加了至少约50%，与野生型相比增加了至少约60%，与野生型相比增加了至少约70%，与野生型相比增加了至少约75%，与野生型相比增加了至少约80%，或与野生型相比增加了至少约90%。在其它实施方案中，与野生型宿主生产的量相比，所述P4HB增加了约2倍至约 400 倍。根据在 Doi, Microbial Polyesters, John Wiley&Sons,第 24 页，1990 中所述的方法，通过气相色谱法测定宿主或植物中的P4HB的量。在某些实施方案中，实现了100-120g P4HB/Kg生物质的生物质滴度。在其它实施方案中，将P4HB滴度的量表示为干细胞重量百分比(％ dew)。合适的宿主菌株在某些实施方案中，宿主菌株是大肠杆菌K-12菌株LS5218 (Spratt等人，J. Bacteriol. 146(3) 1166-1169 (1981) ； Jenkins 和 Nunn, J. Bacteriol. 169(1)42-52(1987))。其它合适的大肠杆菌K-12宿主菌株包括、但不限于MG1655 (Guyer等人，Cold Spr.Harb. Symp. Quant. Biol. 45 135-140(1981))> WGl 和 W3110(BachmannBacteriol. Rev. 36 (4) :525-57 (1972))。或者，大肠杆菌菌株 W(Archer 等人,BMC Genomics2011，12 9doi :10. 1186/1471-2164-12-9)或大肠杆菌菌株 B(Delbruck 和 Luria, Arch.Biochem. I :111-141(1946))和它们的衍生物诸如 REL606 (Lenski 等人，Am. Nat. 138 1315-1341 (1991))是其它合适的大肠杆菌宿主菌株。其它示例性的微生物宿主菌株包括、但不限于真养产碱杆菌、Zoogloearamigera、Allochromatium vinosum、赤红球菌(Rhodococcus ruber)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、集胞藻属 PCC 6803、Synechococcus elongatus PCC 7942、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfenigii)、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacterbaylyi、克鲁氏梭状芽抱杆菌(Clostridium kluyveri)、甲基营养菌(Methylobacteriumextorquens)、Nocardia corralina、澄红诺卡菌(Nocardia salmonicolor)、突光假单胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌属6-19、假单胞菌属61-3和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、广泛产减菌、催产克雷白杆菌(催产克雷白杆菌)、产玻 自酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产玻 自酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、Mannheimia succiniciproducens、Rhizobium etli、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳乳球菌(Lactococcus Iactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)。不例性的酵母或真菌包括选自下述的物种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。 不例性的藻类菌株物种包括、但不限于小球藻属菌株物种，其选自微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、富油小球藻(Chlorellasorokiniana)、椭圆形小球藻、小球藻属或原始小球藻。重组基因的来源P4HB途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如，任意物种，其中编码的基因产物能够催化所提及的反应。这样的物种包括原核和真核生物体，包括、但不限于，细菌，包括古细菌和真细菌，和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人。这种来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁氏酵母菌、克鲁氏梭状芽抱杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、拜氏梭菌、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、Clostridium perjringens、难辨梭菌、肉毒梭菌、酪丁酸梭菌、破伤风形梭菌(Clostridiumtetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌、Clostridiumaminobutyricum、近端梭菌、斯蒂克兰德梭菌、真养产碱杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、銀紫单胞菌、拟南芥、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、假单胞菌属物种，包括铜绿假单孢菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属、原始小球藻、智人、日本大耳白兔、Rhodobacter spaeroides、Thermoanaerobacter brockii、Metallosphaera sedula、肠膜明串珠菌、ChloroJlexusaurantiacusλRoseiflexus castenholzii、赤杆菌属、好好霸树(Simmondsia chinensis)、不动杆菌属包括醋酸妈不动杆菌和Acinetobacter baylyi、銀紫单胞菌、Sulfolobustokodaii、Sulfolobussolfataricus、酸热硫化叶菌、枯草芽孢杆菌、錯状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、褐家鼠、克雷伯菌肺炎、催产克雷白杆菌、小眼虫(Euglena gracilis)、齿垢密螺方定体(Treponema denticola)、Moorella thermoacetica、喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima)、Halobacterium salinarum、嗜热脂肪土芽抱杆菌、Aeropyrum pernix、野猪、漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒杆菌、发酵氛基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳乳球菌(Lactococcus Iactis)、植物乳杆菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、念珠菌属、土曲霉、Pedicoccus pentosaceus、Zymomonasmobilus、Acetobacter pasteurians、乳酸克鲁维酵母、Eubacterium barkeri、多毛拟杆菌、Anaerotruncus colihominis、Natranaerobius thermophilusm、空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷菌、丙二酸盐阴性梓檬酸杆菌、黄色粘球菌、Fusobacterium nuleatum、产黄青霉海洋Y变形杆菌和生产丁酸的细菌。例如，具有Ρ4ΗΒ生物合成生产的微生物宿主(例如，生物体)在本文中用大肠杆菌宿主来例证。但是，目前可得到超过550个物种的完整基因组序列(它们中超过半数可在公开的数据库诸如NCBI上得到)，包括395个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，从相近的或远亲的物种的一个或多个基因中鉴别出编码必需的Ρ4ΗΒ生物合成活性的基因(包括，例如，已知基因的同系物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，以及生物体之间的遗传改变的交换)，是本领域常规的和众所周知的。因此，能够使特定生物体(诸如大肠杆菌)生物合成本文所述的本发明的Ρ4ΗΒ和其它化合物的代谢改变，可以容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物体等。鉴于本文提供的教导和指南，本领域技术人员会知道，在一种生物体中例证的代谢改变同样可以应用于其它生物体。用于生产4ΗΒ的转基因宿主的产生使用本领域已知的常规技术，遗传工程化用于生产Ρ4ΗΒ的转基因的(重组的)宿主。在下面的表IA中显示了克隆的基因，和/或评估了生产含有Ρ4ΗΒ的PHA和4-碳化学制品的宿主菌株，以及适当的酶委员会编号(EC编号)和索引。为了密码子优化合成了一 些基因，而其它基因经由PCR从天然的或野生型宿主的基因组DNA中克隆。本文使用的“异源”是指来自另一个宿主。所述宿主可以是相同的或不同的物种。图I是用于生产Ρ4ΗΒ的示例性的途径。表1Α.生产含有Ρ4ΗΒ的PHA和4_碳化学制品的微生物宿主菌株中的基因。在基
因名称后面的星号(*)表示为了在大肠杆菌中表达对核苷酸序列进行了优化。
权利要求
1.一种用于生产基于生物的Y-丁内酯产物的方法，所述方法包括 a)混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂；和 b)将所述生物质与所述催化剂一起加热，以将所述聚4-羟基丁酸转化成Y-丁内酯产物，其中所述Y-丁内酯的产率
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有所述抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA;和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-Cok连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-Cok ；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ；NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-轻基丁酰基-CoA ;并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏yneI、gabD、pykF、pykA、maeA 和 maeB。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括下述初始步骤用可再生的原料培养重组宿主，以生成聚-4-羟基丁酸生物质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可再生的原料的来源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组口 o
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物质宿主是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物质宿主是细菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌选自大肠杆菌、真养产碱菌(重命名为真养产碱杆菌)、芽孢杆菌属、广泛产碱菌、固氮菌属、气单胞菌属、丛毛平胞菌属、假单胞菌、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、克雷伯菌属、聚球藻属的种PCC7002、聚球藻属的种PCC 7942、集胞藻属的种PCC 6803、嗜热蓝细菌聚球藻BP-I、微温绿硫菌、Chloroflexusaurant i cus、微温着色菌和酒色着色菌、深红红螺菌、荚膜红细菌和沼泽红假单胞菌。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组宿主是藻类。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中加热是在约100°C至约350°C的温度下。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述催化剂的重量百分比是在约4%至约50%的范围内。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中加热将所述生物质的水含量降低至约5重量％或更低。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述加热温度是约200°C至约350。。。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述加热温度是约225°C至约300°C。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述加热持续约30秒至约5分钟的时间段。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述时间段是约5分钟至约2小时。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其另外包括回收所述Y-丁内酯产物。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述Y-丁内酯产物包含小于5重量％的副产物。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中进一步加工所述Y-丁内酯，以形成下述的一种或多种1，4- 丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2_吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
21.根据权利要求I所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主任选地在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-Cok ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。
22.根据权利要求I所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-Cok ；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3- 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ；NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛_3_磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成l，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏ynel、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。
23.根据权利要求所述的方法1，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ;琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-Cok聚合成聚-4-羟基丁酸。
24.根据权利要求I所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA ；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3_ 二磷酸甘油酸，形成NADPH+H+ ;NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成I，3- 二磷酸甘油酸，形成NADH+H+ ;丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA ;并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏ynel、gabD、pykF、pykA、maeA 和 maeB。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述催化剂的重量％是在约4%至约50%的范围内，且所述加热是在约300°C下。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述催化剂是约4重量％的氢氧化钙，且所述加热是在300°C的温度下。
27.通过前述权利要求中任一项所述的方法生产的基于生物的Y-丁内酯产物。
28.根据权利要求27所述的产物，其中所述Y-丁内酯产物包含小于5重量％的副产物。
29.从可再生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质，所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为用于生产Y-丁内酯产物的原料，其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于所述生物质的50重量％。
30.根据权利要求27所述的基于生物的Y-丁内酯产物，其中所述产物中的所述Y-丁内酯具有100%的基于生物的碳含量。
31.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中基于所述产物中的I克Y-丁内酯/克聚-4-羟基丁酸，所述产物是约85重量％或更大。
全文摘要
本申请涉及用于制备基于生物的γ-丁内酯产物的方法，包括混合含有聚4-羟基-丁酸的遗传工程化的生物质和催化剂并加热该生物质和催化剂以将聚4-羟基-丁酸转化为γ-丁内酯产物。
文档编号C07D307/33GK102781926SQ201180009250
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月11日 优先权日2010年2月11日
发明者A·达姆布罗索, C·米尔利, E·安德森, F·A·斯克拉利, J·A·比克梅尔, J·利卡塔, J·范瓦尔森, K·A·斯帕克斯, M·S·希瓦苏布拉玛尼安, T·M·拉姆塞尔, W·R·法默, Y·沙布泰 申请人:梅塔玻利克斯公司