结合反应的制作方法

专利名称：结合反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及在含有羧基或磷酸酯基(特别是磷酸酯(V)基团)的反应物和含有胺基的反应物之间的结合反应，和涉及用于这样的反应的试剂。
背景技术：
已知如何使用羧基活化试剂例如碳二亚胺(R1N=C=N R2),使含有羧基的反应物和含有胺基的反应物结合，这种碳二亚胺起零长度交联剂的作用。碳二亚胺与羧基的反应为最重要的反应之一，并且用于使分子或生物分子偶合到多种表面，包括用于亲和色谱法的载体；用于衍生化用于侧向流动试验或凝集分析的胶乳微粒；和用于衍生化芯片表面以使用表面等离子体(plasmon)共振研究分子间的相互作用。碳二亚胺也已用于量化蛋白中的羧基，和用于将抗原/分析物共价连接于载体蛋白，以 提高免疫原性。碳二亚胺与羧基的反应产生高度不稳定的O-酰基异脲(acylisourea),后者可进一步与胺反应形成酰胺。在没有氨基的情况下，O-酰基异脲与另一分子的酸反应形成酸酐，或者经历分子内的O-至N-酰基重排以形成稳定的N-酰基脲。在水溶液(但不是在有机溶剂)中，O-酰基异脲被水(浓度为 55M)快速水解，重新生成原来的羧基并将碳二亚胺转化成非反应性的取代脲。由于与水分子竞争，可能胺难以反应形成酰胺，除非胺前体以高浓度存在。最后，在没有羧基的情况下，碳二亚胺可与胺反应形成胍。碳二亚胺的主要应用之一是在生物偶联领域，在一种实体物质(例如蛋白、微粒或芯片表面)上的羧基官能团借以被活化，然后与另一种实体物质上的胺基反应，形成酰胺连接的轭合物，所述另一种实体物质通常为蛋白或肽或分析物。通常，在这样的反应中，实体物质的羧基在pH 4-pH 6的缓冲溶液中与胺化的分子接触，并加入水溶性的碳二亚胺以启动所述结合反应。在有机溶剂中进行的反应(例如肽的合成)通常采用疏水性碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)。然而，涉及生物分子的反应通常需要水性条件，或者基本上为水溶液，并且在这些情况下，水溶性的碳二亚胺例如I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC;也称为EDAC)或环己基-(β-DV-甲基吗啉代]乙基)碳二亚胺(CMC)为优选的。当不能获得足够高浓度的胺(例如由于水溶性有限或者成本高)时，通过加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以将高度不稳定的ο-酰基异脲中间体转化为更稳定的琥珀酰亚胺基(或‘NHS’)酯，后者也易于与胺反应，可增大结合反应的效率(Staros et. al.，Anal. Biochem. , 156，220-222，1986)。NHS可大大地加速反应并促使一些生物分子发生不受控制的交联，因此对于NHS的需要必须视情况的不同来确定。EDC 与竣基的反应在 pH 3. 5-4. 5 下最有效(Nakajima and Ikada, BonconjugateChem. 6，第123-130页，1995)。对于EDC介导的酰胺键形成最佳的pH通常稍高一点，通常在pH 4和pH 6之间。这种最佳值反映了多种因素的平衡，这些因素包括ο-酰基异脲的形成和水解速率、胺亲核试剂的pKa，其pH可基本上高于ο-酰基异脲中间体优先形成时的pH。考虑到胺与EDC在没有羧基时的潜在反应，假设目的是形成酰胺键，胺在加入羧基化物质种类之前通常不与EDC接触，尽管常见的实践是向包含含有胺-和羧基-的物质的溶液中加入新鲜制备的EDC。这样的反应混合物理想的情况下不存在带有能够与碳二亚胺或ο-酰基异脲中间体反应的官能团的其它组分。增大碳二亚胺介导的磷酸酯基与胺之间的缩合反应的反应效率的一种类似方法使用甲基咪唑作为稳定剂。通常认为碳二亚胺在水性溶液中是不稳定的。例如，EDC的特性普遍被描述为高度不稳定的分子，并且在先有技术中关于在生物结合反应中需要使用新鲜制备的EDC溶液存在许多警示。例如，BioconjugateTechniques (GT Hermanson 1996; ISBN 0_12_342335-χ ;Ρ170)指出“···.储备溶液应快速溶解并立即使用，以防止广泛丧失活性”。一个较新的版本的Bioconjugate Techniques (2008)指出EDC在水性环境中不稳定，并应在溶液制备之后立即使用(GT Hermanson 2008; ISBN 978-0-12-370501-3,第688 页)。在用于结合羧基SiMAG磁性颗粒的方法中，制造商Chemicell GmbH在方案Al中建议如下“向颗粒中仅加入新鲜制备的EDC···.(被下划线的文字在原始方案中以粗体显示)”。用于Carboxylink凝胶(Pierce,产品编码20266)的方案指出“注意EDC对水分敏感，并当溶解于水性缓冲液时快速水解….使用之前快速并立即溶解需要一定量的试齐U，并丢弃任何未使用的溶液。”
Sigma-Aldrich产品信息(EDC，产品编码E7750)指出“产品为水溶性的，但是不稳定。建议使用之前立即制备新鲜溶液。”
Nanopartz GmbH在描述其羧基聚合物球形金纳米颗粒结合试剂盒的正确使用中指出“仅使用必要量的EDC-—旦溶解于水中其使用期少于I小时。”
微米颗粒的另一个供应商(Seradyn)在‘推荐的吸附和共价偶联程序’(1999)中指出“请注意EDAC对水分非常敏感，并在水溶液中经历快速水解。”
EDC 一般作为盐酸盐得自商业供应商，并且常规地以粉末状，通常于_20°C下储存于玻璃瓶中。通常的实践是与干燥剂储存在一起，并在打开之前使储备瓶与室温平衡以免水分在瓶内冷凝。关于EDC在水性环境下的稳定性已进行几项研究(Gilles et al. , Anal.Biochem. 184, 第 244-248 页，[1990] ; Nakajima and Ikada, Bioconjugatechemistry, 6, 123-130 [1995] ; Williams and Ibrahim; J. Am. Chem. Soc. 103,7090-7095 [1981] ; Lei et al. , Anal Biochem. 310，122-124 [2002])。尽管不同的实验设计妨碍任何直接的数据比较，但是主要的研究结果可因此进行概述
随着pH从pH 7减少至约所述值(即约pH 4)，在该pH下发生ο-酰基异脲中间体的有效形成，EDC 的分解增大(Lei et al. , Anal Biochem. 310，122-124 [2002])。酸催化的EDC水解为相应的脲，这为酸性介质丧失的主要途径。确实，涉及EDC的反应有时用HCl猝灭。已在碱性缓冲液中观察到EDC的较低速率的分解(Nakajima and Ikada; BonconjugateChem. 6,第 123-130 页，1995),尽管 Williams and Ibrahim (J. Am. Chem. Soc. 103,7090-7095, 1981)记录了在氢氧化钠存在下的高速率水解。在Molecular Biology volume 394,沙门氏菌属方法和方案(SalmonellaMethods and Protocols) (SA Dunbar & J W Jacobsen;第 I5 页)的方法中，给出以下建议“EDC在水存在下不稳定。活性物质种类在水性溶液中以仅仅几秒钟的速率常数水解，因此应小心地最大限度的减少对空气和水分的暴露”。已知EDC在水溶液中的水解分解由于羧基的存在被大大加速，羧基催化循环反应，包括反复形成和水解高度不稳定的ο-酰基异脲中间体。在pH 4下观察到，在三羧酸(枸橡酸)存在下，EDC 损失速率增大 1000 倍(Wrobel et. al. , Anal. Biochem. 305,135-138 [2002])。这些作者也显示在pH 4下单羧酸(乙酸盐)和磷酸盐的显著加速作用。也注意到各种缓冲剂，包括Tris、M0PS和HEPES的催化效果，尽管在这些情况下的催化机制尚不清楚。对于无机磷酸盐和对于三磷酸腺苷也观察到加速分解，推测无机磷酸盐的加速分 解是通过形成不稳定的O-磷酰异脲(phosphoisourea)衍生物发生的(Gilles et al.,Anal. Biochem. 184，第 244-248 页，[1990])。乙二胺(其广泛用于EDC介导的反应中，以向羧酸载体或聚合物中引入胺)和单胺(甘氨酸甲酯，其用于封闭/量化羧基)，也可加速EDC的分解(Gilles et al.，Anal.Biochem. 184，第 244-248 页，[1990])。碳二亚胺的水解分解不是EDC独有的，例如I-乙基-3-(4-氮阳离子_4，4_ 二甲基戊基)碳二亚胺(EAC)比EDC在各种添加剂存在下降解快一个数量级(Gilles et al.，Anal. Biochem. 184， 244-248， [1990])。在当代EDC结合方案中，含蓄或明确地承认先前技术中关于以下方面的各种叙述，这些叙述涉及EDC缺乏稳定性，O-酰基异脲中间体对水解极其敏感，和在通常用于生物结合反应的物质(例如羧基)存在下大大加速分解。事实上所报道的EDC的不稳定性，和由于多元羧酸加速的分解，毫无疑问已经形成了一些非常详细的用于产生含有EDC的干燥混合物的程序，例如采用通过相变暂时间隔反应物的方法(美国专利6809186)。在这种方法中，依序通过闪冻溶液，然后冷冻干燥生成的分层结构，以得到干燥产品，使反应物结合。如果人们希望优化多个反应参数并且不适合于对任何商业应用按比例放大，这种方法是极其乏味的。美国专利6809186的作者也提到‘在接近中性PH下EDAC的使用期短…’(第8列第47排)。本发明人已经意外地发现，羧基活化的物质，例如碳二亚胺，实际上不像文献中反复指出的那样不稳定，并且已经使用该发现开发了一些方法，这些方法使得羧基活化的物质，例如EDC，易于与含有羧基-或胺-的物质(例如蛋白、小分子、微粒)结合，形成均匀的溶液或混悬液，它们可被冻干而没有各种组分的显著分解，并且成功用于生物结合反应。发明概述
一方面，本发明提供一种产生试剂的方法，该试剂用于含有羧基或磷酸酯基的第一反应物与含有胺基的第二反应物之间的结合反应，方法包括
a)形成以下组分的溶液或混悬液
i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物质，这种物质能够作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分，以促使在羧基和胺基之间形成酰胺键，或在磷酸酯基和胺基之间形成氨基磷酸酯键，和
)第一反应物或第二反应物；和
b)干燥所述溶液或混悬液。提及的羧基和磷酸酯基包括以解离或未解离形式的这类基团。本领域的技术人员应意识到，通常磷酸酯基将以解离形式存在，而羧基的解离或其它状态将根据PH变化。所生成的试剂用于结合反应，特别是与生物分子的结合(生物结合反应)，例如用于偶联分子例如蛋白与微粒，和用于制备免疫原，如以下更详细讨论的那样。这种试剂通过重新构成为溶液或混悬液并与第二反应物或第一反应物接触(无论哪一种不存在于试剂中)来使用。这可通过加入第二或第一反应物的溶液，以单一步骤进行，或者以几个步骤进行(步骤的顺序通常不重要)。提供合适的反应条件，例如温度、pH (pH优选地为少于8、 少于7或少于6)，以使得能够发生结合反应，第一反应物和第二反应物通过酰胺键连接在一起。通常，在合适的反应时间之后，例如通过加入合适的猝灭剂终止所述结合反应。步骤b)优选地在步骤a)之后不久进行，例如在约I小时内，尽管这不一定是关键的。羧基活化或磷酸酯活化的物质(为了简便起见将其称为活化物质)和第一或第二反应物优选地以溶液，优选地以水溶液的形式混合。溶液或混悬液优选地为均匀的。活化物质在本领域为已知的，并且包括碳二亚胺、伍德沃德氏(Woodward)试剂K(WRK)和各种其它物质。活化物质的选择应考虑反应混合物中的溶剂类型。对于在水性条件或基本上水性条件下的反应，至少部分溶于水的活化物质为优选的。适用于本发明的特别优选的活化物质为I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺.HCl (EDC,也称为EDAC)。其它优选的活化试剂包括例如N-乙基-5-苯基异噁唑鎗-3 ’ -磺酸盐(伍德沃德氏(Woodward)试剂K)、N_环己基tV’ - ( β - [N-甲基吗啉代]乙基)碳二亚胺(CMC)、4-氮阳尚子-4，4-二甲基戍基)碳二亚胺(EAC)、2，2-二氯-5-(2-苯基乙基)-4-三甲基甲娃烧基)-3-呋喃酮(DPTF) [Murakama et al. , TetrahedromLetters 37，7541-7544 (1996)]和 4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎗氯化物(DMT-MM) [Kuniishima et al. , Tetrahedron 57，1551-1558 (2001)]。其它活化物质的实例包括N，N’- 二环己基碳二亚胺(DCC)和N，N’- 二异丙基碳二亚胺(DIC)、氰胺、1，I’羰基二咪唑(⑶I)、N，N’ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、1，2-苯并异噁唑-3-基-二苯基磷酸酯(BDP)和2-乙氧基-I-乙氧基羰基-1，2- 二氢喹啉(EEDQ)。Montalbetti 和Falque [Tetrahedron 61, 10827-10852，(2005)]也描述了这些试剂以及可用于促使自含有羧基和胺的物质形成酰胺键的其它试剂中的一些试剂。步骤b)优选地包含冷冻干燥。合适的方案为本领域熟知的。其它可能的干燥技术包括喷雾干燥、超临界干燥和旋转蒸发。该方法优选地使用第一反应物，即含有羧基的反应物进行，含有羧基的第一反应物用于与含有胺的第二反应物例如蛋白的结合反应，例如生物结合反应。所述反应物可含有一个或多个羧基。
用于所述方法的第一或第二反应物通常包含标记，后者提供可测量性，但不需要这样做。合适的标记为熟知的，并且特别感兴趣的那些标记例如包括有色或荧光微粒、磁性微粒或珠粒、量子点(Quantum dots) (Q点)、金颗粒、荧光染料、荧光蛋白和酶。第一或第二反应物不必起标记作用，例如当生成的结合物用作生产抗体的免疫原时。其它合适的试剂包括核酸和寡核苷酸、羧基化或胺化的葡聚糖、适当官能化的珠粒包括琼脂糖和玻璃；蛋白，包括抗体、抗体片段；糖蛋白、代谢物、分析物、肽，以及具有羧基、胺或磷酸酯基或者这些基团的组合的其它物质或表面。微粒优选地具有保护性涂覆层，以减少颗粒聚集的可能性。涂覆层便利地包含糖聚合物，例如葡聚糖。合适的涂覆层材料和技术为熟知的。溶液或混悬液合乎需要地也包括多羟基材料例如糖，海藻糖为目前优选的材料。 这种材料可起稳定剂作用，特别是在冷冻干燥方法中，并且也可助于所生成的干燥产物随后在使用中溶解。溶液或混悬液通常包括缓冲剂。这不是必需的，但是缓冲剂可助于在冷冻干燥过程期间稳定，并且也可在使用所生成的干燥产物中带来稳定性益处。合适的缓冲剂包括MES、HEPES、MOPS、EPPS (或HEPPS)和CHES。如果存在的话，缓冲剂适当地以相对低的浓度使用，优先地为IM或者更少，更优先地为100 mM或者更少，还更优先地为10 mM或者更少，例如在1-10 mM范围内。溶液或混悬液的pH —般地等于或大于4，优选地等于或大于6，更优选地等于或大于7或者等于或大于8，并且优选地等于或少于14，更优选地等于或或少于12，并且最优选地等于或少于11。溶液或混悬液任选地包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以提高结合反应效率，如果要求的话。溶液或混悬液任选地包括清洁剂，以在使用所生成的干燥产物中消除可能的非特异性或其它不需要的结合相互作用。另一方面，本发明提供通过本发明方法生产的试剂。本发明也提供干燥的试剂，所述干燥的试剂用于含有羧基或磷酸酯基的第一反应物与含有胺基的第二反应物之间的结合反应，反应物包含以下组分的均匀混合物i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物质，这种物质能够作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分，以促使在羧基和胺基之间形成酰胺键，或在磷酸酯基和胺基之间形成氨基磷酸酯键，和ii)第一反应物或第二反应物。所述试剂优选地不包括NHS。其它的优选和任选特征如以上阐述的那样。本发明的试剂便利地以用于结合反应的合适量，优选地存在于容器例如小瓶中，特别是对于生物分子，例如对于用于要标记的100 Ug抗体样品时。一般地，在具有10 ul,40ul、400 ul或I ml溶液或混悬液的玻璃小瓶中制备的冷冻干燥的混合物，分别含有约2_20ug,7. 7-77 ug,77-770 Ug 和 192-1920 Ug 的量的 EDC (基于 EDC. HCl 的摩尔重量 191. 7)。所述试剂任选地通过用本发明的方法在容器中就地进行干燥来制备，但是或者可以原料药(bulk)和分配于容器例如小瓶中进行制备。 本发明也提供结合试剂盒，试剂盒包含供给本发明的试剂和使用说明书。
所述试剂盒任选地包括供给猝灭剂，例如β -巯基乙醇。所述试剂盒任选地包括供给缓冲剂，例如在ρΗ5或ρΗ6下的MES。在使用中，缓冲剂优选地被加入到要结合的反应物例如抗体中，后者然后被加入到本发明的试剂中。本发明也提供实施结合反应，尤其是生物结合的方法，所述方法包括使用如上文定义的依据本发明的试剂，或者使用结合试剂盒。结合反应方法的步骤通常包括以合适的液体(优选地为水性的，例如蒸馏水或缓冲水溶液，或者任选地为无菌溶液)重新构成所干燥的试剂，并且使重新构成的试剂与要结合的分子(例如抗体等)接触。本发明因此可(i)简化许多生物结合程序，(ii)消除了对于每一次试验必须制备碳二亚胺的新鲜溶液的繁琐和浪费的做法，和(iii)提供超过涉及短暂/受空间隔离条件限制的反应物分离的方法的明确的技术进步。本发明基于在各种各样条件下，再检查EDC在溶液中的稳定性的工作，并且导致 形成用于生产含有羧基活化的物质例如EDC的多组分均匀冷冻干燥的混合物的有用起点。EDC受到各种处理，并用包括浓蛋白质溶液的凝胶化的蛋白结合试验，或者更直接地，通过与芳胺(苯胺)反应，形成可测量的胍化合物，测量残留活性。从这些试验中我们能够识别其中EDC出人意外地对水解稳定的多种条件。另一种羧基反应性分子，Woodward氏试剂K (WRK)，其也被报道在水性环境下不稳定，也使用本发明的方法成功地得到配制。在我们的实验室中，经数月时间，其中我们坚持所接受的关于EDC处理的指导方针，在水性介质中，我们使用碳二亚胺进行了大量反应。我们担忧粉状EDC储存品的可能降解，其降解可由于反复开启和关闭常规于_20°C下储存于冰箱中的储存瓶而加剧，促使我们开发BSA凝胶试验(实施例I)以检查EDC溶液的完整性。然而，自瓶中取出的EDC粉末，其已老化或者在反复使用期间似乎已经变得潮湿(即显示凝结成块的迹象，而不是在首次开启时的明显细粉)，不能得到在水中的溶液，在BSA凝胶试验中显示明显劣质。这促使我们在使溶液‘老化’几小时之后测试EDC，其结果不一定与快速水解速率一致，并且使得我们对先前技术中关于EDC稳定性的一些叙述的可靠性表示怀疑。EDC可放置于水中相当长的时间而明显没有活性的显著丧失的研究结果，提出这样的问题，即是否也可使EDC与含有羧基的物质结合，并将混合物储存至少短的时间期间，之后进行与其它适当官能化分子的反应。我们认为，制备冷冻干燥的混合物可使得能够在数天、数周、数月或者甚至数年后进行结合反应。我们意识到，没有关于包含EDC和含有羧基或胺的物质的均匀多组分混合物的冷冻干燥和在与其它分子的结合反应中使用这样的物质的报告。最初，我们研究了当在宽的pH值范围，以及还在官能团(例如羧基，羧基被报道加速EDC的分解)存在下，与生物缓冲剂或其它试剂结合时EDC的稳定性。文献中缺乏关于EDC与其它分子之间在含水碱性缓冲液中反应的信息。在EDC于每一种条件下预先温育5分钟或24小时后，将每一种EDC/缓冲剂混合物加入到BSA在MES缓冲液中于pH 6下的浓溶液中，并测定形成凝胶需要的时间(实施例I)。在该试验中，通过EDC的快速水解(即与水反应)，或通过EDC与混合物中另一种组分之间的快速反应，可引起在短时间的预先温育之后的胶凝时间增加。甚至在预先温育期没有损失EDC，混合物中的组分仍可造成干扰BSA试验的第二(胶凝)期，例如通过特别是在用于胶凝反应的PH下进攻EDC，或者通过一些其它方式干扰形成O-酰基异脲基团，或干扰那些基团与其它BSA分子上的赖氨酸残基的反应，其对分子间交联和胶凝是必要的。不管任何干扰的实际机制，BSA胶凝试验为EDC介导的生物结合反应的一个实例，并且因此使得能够确定可能喜欢从打算冷冻干燥并用于EDC介导的生物分子的结合的混合物中排除的物质。我们发现，在预先温育期的pH与胶凝时间之间没有简单的关系，也许因为多种因素的作用影响生物结合试验的结果。在预先温育24小时之后，EDC/HC1混合物未能弓I起胶凝，符合基于所报道的EDC在酸中不稳定性的预期。奇怪的是，在预先温育5分钟之后，EDC/100 mM HCl混合物始终呈现短的胶凝时间。我们没有进一步研究该观察结果，但是这可通过EDC转化为更具反应性的互变异构体来解释。几种缓冲条件得到确定，其中在预先温育24小时之后EDC活性仅受到适度影响。出人意外地,这组条件包括EDC/乙酸盐在pH 5下的混合物，结果重复几次，尽管先前 报道EDC在O. IM乙酸钠/0. IM EDC, pH 5的混合物中半衰期仅为两分钟(Jacobson andFairman, Anal. Biochem. 106, 114-117 [1980])。不太意外地,不管预温育时间，注意到用多元羧酸(例如枸橼酸钠，EDTA)的严重干扰。多种其它缓冲剂包括磷酸盐、碳酸盐和硼酸盐也引起明显的干扰。几种混合物即使在25°C下预先温育6天之后，仍然含有足够的EDC活性，以引起BSA的胶凝。一些有希望的条件使用更直接的EDC活性试验进行进一步评价，试验包括将苯胺转化为苯基胍，基本上使用Williams等的方法(Anal. Biochem. 114，173-176 [1981])(实施例2)。该试验允许要测量的EDC的浓度低于引起BSA胶凝的阈值Γ20 mM)，并且允许在不需要活化羧基的情况下测量EDC的稳定性(对于水解或对于其它反应)。一些缓冲液配方在苯胺试验中得到确定，这些配方在预先温育和/或冷冻干燥之后对EDC具有很小的影响。另外，我们确定了其中EDC可与三-或四价羧酸物质(EDTA，枸橼酸盐)结合而没有任何证据表明EDC的广泛催化破坏的条件。总体上讲，我们关于EDC稳定性的研究结果证实了先前技术的一些陈述，但是与其它的发生矛盾。我们的数据清晰地显示，EDC比通常认可的稳定得多，并且更重要的是能够在溶液中使EDC与低分子量的多元羧酸物质结合，而没有明显损失EDC。因此我们被鼓励去观察其它的多价羧酸物质(例如微粒)是否能够在用于与胺化分子的生物结合反应之前与EDC结合并且冷冻干燥。微粒在生命科学中被广泛开发利用，在诊断化验中用于检测流体例如血液或尿液中的分析物(例如横向流动免疫层析试条试验和凝集试验)。荧光微粒和量子点用于流式细胞术，以检测表达特定抗原的细胞群。磁性颗粒在研究实验室和诊断装置具有多种用途。也存在许多其它类型的微粒，这些微粒自各种材料构成，每一种类型通常具有多个变体，例如不同大小、颜色、表面官能度等。对于用于生物测定，微粒必须涂覆可与其它生物分子或分析物相互作用的物质。这种物质通常为抗原或抗体，尽管广泛范围的分子可通过非共价或共价手段连接于微粒的表面。在包括固定抗体的大多数诊断应用中，使用被动的非共价方法来涂覆。共价连接更常用于小分子或分析物，并且可获得具有各种表面官能团(例如羧基、胺、醛)的微粒。羧基化或胺表面可使用碳二亚胺或其它同等功能的活化物质与抗体或分析物共价偶联。胶乳微粒为疏水性的并且众所周知容易聚集。为了被动涂覆，使用过量的结合实体(例如抗体)以致覆盖整个表面，这减少疏水性表面之间或在颗粒之间起桥梁作用的抗体接触弓I起聚集的风险。在一些情况中，抗体可与另一种蛋白(例如BSA)混合，这提供了控制或调整呈现于颗粒表面的抗体的量的机制，并助于保持胶体稳定性。应需要任何离心清洗步骤，以自微粒的混悬液除去过量的试剂，离心步骤趋向于压紧颗粒并促使聚集。聚集物一旦形成便极其难以破碎，并且可能需要声波破碎。被动涂覆通常在接近覆层物质的isolelectic点的pH下进行。因此对于抗体,尤其是那些单克隆种类，涂覆方法可能必须对每一种抗体试剂进行优化。共价偶联策略具有一些益处将结合实体安全连接于微粒可能使得当进行试验时具有更大的稳定性，更长的保存期限和更少的约束。例如，通常用于在免疫测定中减少非特异性结合的清洁剂可自微粒剥去被动吸附的抗体，并干扰免疫诊断测定。在羧基颗粒的情况中，抗体上的氨基反应形成稳定的酰胺键。在胺化颗粒的情况中，连接酰胺键颠倒，但是在其它方面却是等同的。如果分析物仅具有羧基用于偶联，或者如果感兴趣的抗体在抗原结合域含有关键赖氨酸残基，使用胺涂覆的颗粒可为合乎需要的。然而，还应该指出，抗体可聚合，尤其是如果以高浓度存在，并且关键赖氨酸仍可参与与其它抗体分子的聚合反应。·
尽管共价结合具有许多优势，用于实施这样反应的程序冗长并且仍然保持具有聚集的风险。微粒也被报道在冷冻时聚集(例如Polysciences技术数据表238; rev #010,活性2009年2月18日)，在开发EDC与微粒的冷冻干燥混合物方面提出了另外的挑战。为了用于本发明，主要地因为羧基化微粒在EDC存在下或在离心之后聚集的趋势，我们采用了具有保护性葡聚糖涂覆层的微粒。葡聚糖已被其他人用于涂覆微粒，以得到更具亲水性的表面。葡聚糖被化学修饰引入官能团，以使得能够共价连接于核心微粒，并提供能够参与与其它分子的结合反应的表面官能团。官能团可被设计成为葡聚糖以适合于感兴趣的具体微粒的化学。例如，羧基甲基(CM)可使用本领域熟知的方法，采用溴乙酸或氯乙酸引入到葡聚糖中。这类葡聚糖的衍生物可以碳二亚胺介导的反应共价连接于胺化的微粒中。CM-葡聚糖衍生物可与过量的低分子量二胺例如乙二胺进一步反应，产生胺化的葡聚糖(AM-葡聚糖)分子，后者然后可连接于羧基化的微粒。通过变化用于初始羧基化反应的卤代乙酸的量和/或通过控制随后胺化反应的效率，可控制在葡聚糖分子表面上的羧基或胺基的密度。胺也可在用高碘酸盐处理之后引入到葡聚糖中，高碘酸盐裂解顺式-二醇，产生醛基。该醛基可进一步与二胺反应产生SchifT碱，后者可使用本领域熟知的方法稳定。在本发明中，胺化的葡聚糖使用碳二亚胺共价连接于羧基化的微粒。在一个优选的实施方案中，葡聚糖覆层上的胺然后与琥珀酸酐反应，得到羧基化表面。如果有效涂覆微粒需要的葡聚糖胺的数目大于用于随后与其它分子的结合反应需要或希望的数目，可得到的胺的数目可通过在用琥珀酸酐处理之前，与封闭剂的不完全反应得到减少。例如横基-NHS 乙酸盐(Bioconjugate Techniques. GT Hermanson 1996;ISBN 0-12-342335-x;第127页)可用于封闭胺。另一方面，如果对于涂覆步骤或对于随后的结合反应不能得到足够的胺，CM-葡聚糖可不与二胺而是代之以与低分子量三胺或多元胺反应，得到另外的胺官能度。本发明的方法不限于任何具体的涂覆方法，并可应用于含有或不含葡聚糖涂覆层的微粒。另外微粒可涂覆一层或多层葡聚糖。葡聚糖覆层的主要目的是防止颗粒聚集，并且就这一点而言，具有高平均分子大小的葡聚糖为优选，因为大的分子大小通常似乎更有效地保持胶体稳定性。 在本发明的优选的实施方案中，EDC或其它羧基活性物质与胶乳颗粒结合，胶乳颗粒优选地涂覆有保护性聚合物例如葡聚糖。这种保护层携带有多个胺基或羧基，并且微粒可与EDC或另一种合适的碳二亚胺在具有其它添加剂的合适的缓冲液中结合，并将生成的 均匀混合物分配至小瓶中并冷冻，之后冷冻干燥并随后应用于结合反应。用这种方式产生的小瓶可以便利的一步法结合试剂盒的形式组装，其中简单地通过用生物分子的溶液重新构成冷冻干燥的混合物启动感兴趣的生物分子与微粒之间的反应。在将这种试剂盒应用于生物结合反应中，人们需要仔细考虑碳二亚胺在冷冻干燥的混合物中的量，两者按绝对值计算并且考虑混合物中的其它实体物质，以及考虑可在后来引入的其它实体物质(例如以溶液形式加入的亲核试剂)。人们还必须考虑要引入的液体体积是否大于或小于含有EDC溶液的初始体积(即冷冻干燥之前)，以预测每一种组分在最终反应混合物中的浓度。人们也必须考虑在用于溶解冷冻干燥的混合物的实体物质中存在组分的可能性，存在的组分可改变EDC或其它羧基活性物质介导的反应的效率或速率。例如，许多实验室实施结合反应以将抗体连接于羧基表面，或连接于其它含有羧基的生物分子，并且市售可得到的抗体通常含有据报道干扰碳二亚胺作用的物质(例如tris，磷酸盐缓冲液)。这些潜在的困难可以几种方法中的一种解决。首先，抗体可除去盐分或透析，以提供更有利的缓冲液配方。这样的处理通常采用约O. I ml或以上的体积。对于大得多的体积，可使用其它技术例如交叉流过滤。有可能使用颗粒净化材料去除一些不需要的物质，例如混合床离子交换器已经用于自蛋白溶液去除不需要的离子组分。第二，可生产一系列冷冻干燥的组合物，以适应可在结合反应中遭遇的抗体(或其它实体物质)的各种制剂。例如，具有优选的缓冲液配方的抗体可需要相对小量的EDC等以实现结合。相比之下，用已知加速EDC等分解的物质(例如磷酸盐)配制的抗体可加入到含有更高含量碳二亚胺的冷冻干燥的多元羧酸物质(例如胶乳珠粒)中。第三，可生产具有相对高含量EDC等的单一冷冻干燥的制剂。这样的混合物，即使与具有不利配方的抗体接触，仍可使反应在合理的时间段内完成。至于什么时间段是合理的看法可在实验室操作员之间变化，但是I小时的反应时间并非不同寻常。如果然后在优选的缓冲液制剂中呈现相同的抗体，反应将可能更快，并可在约几分钟内进行至要求的终点，在此情况下，为了限制因过度暴露于EDC等的潜在的损害，可使用合适的方法猝灭反应。第四，‘pH改性剂’可在与冷冻干燥的混合物接触之前加入到抗体中，以使最终反应pH向上或向下移动，因此改变碳二亚胺介导的反应速率。在研究中的特定抗体或生物分子对PH的敏感性将影响其中pH可有效地变化的范围限制。在这种方法中，理想地，冷冻干燥的混合物的缓冲能力相对低，以便于通过仅加入适量的改性剂调节pH。如果用相对低容量的缓冲系统开始，如后来可要求的那样，例如作为猝灭程序的部分，也易于实现PH的任何进一步的变化。也可开发利用改性剂以优化不同pKa的胺的反应程度。在冷冻干燥的混合物包含碳二亚胺和多元羧酸物质的情况中，与胺的两步和一步反应都是可能的，正如同传统的EDC结合方法使用新鲜制备的溶液。例如，在两步法中，冷冻干燥的混合物的pH起初可通过加入低PH缓冲液来减少，以利于形成ο-酰基异脲。在合适的时间段后，引入胺化分子或与较高PH的缓冲液一起引入，以使反应物pH向上移动，因此增大更高活性的未质子化状态的胺的比例，因此促进酰胺键形成。 对于许多胺，尤其是具有多个胺官能团(主要来自赖氨酸侧链)，具有一定范围的PKa值的生物分子(例如蛋白)，由于其中每一个赖氨酰残基所在的微环境的影响，最简单的方法是一步法反应，其中冷冻干燥的羧酸物质/EDC混合物用含有胺的生物分子的缓冲溶液重新构成。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)也可任选地在冷冻干燥之前或与用于溶解冷冻干燥的混合物的溶液一起加入到反应混合物中。如果效率太低，NHS可为有用的。同样地，人们也可设想一种情况，其中可有意引入引起干扰的物质例如磷酸盐，以使太快的反应减速。通过改变反应物的浓度，也可变化反应速率或效率。例如，冷冻干燥的混合物用两种体积，‘X’和‘5X’提供的固定量的抗体重新构成将导致微粒、EDC等、抗体以及任何其它成分的浓度相差5倍。在反应物体积为‘X’的情况下，反应速率可能比体积为‘5x’的快得多。因此，如果计划以相对小的体积溶解，可能或者希望在冷冻干燥的混合物中使用较少的EDC 等。从以上讨论显而易见的是，甚至对于固定组成的冷冻干燥的混合物，存在非常简单的策略用于改变结合反应的效率。从以上讨论也显而易见的是，本发明的方法使得能够简单地通过以不同比例混合各种组分的溶液，快速和容易地制备几乎无限数量的冷冻干燥的制剂。在本发明的优选实施方案中，所述组分的最终混合物的pH在冷冻干燥之前在pH1-14的范围内。用于稳定EDC 的优选缓冲剂为 MES，pH 6. O ；HEPES, pH 7. 5 ；M0PS, pH 7. 5 ；EPPS, pH 8. 5 ；EPPS, pH 9. 0 ；CHES, pH 9. 2。WRK在所有检验的缓冲液中得到稳定MES缓冲液在pH 5、pH 6和EPPS pH 8. 5。然而对于结合反应，WRK在pH 5下显示最高效率。优选地，缓冲溶液的pH在用于保持pH的任何缓冲物质的pKa的5 pH单位内，更优选地在2. O pH单位内，甚至更优选地在I pH单位内。在冷冻干燥方法中，通常认为缓冲液和盐的浓度应尽可能低，并且值得注意的是EDC在水中最稳定(实施例I)。
在混合物中简单存在任何缓冲剂，以实现在制备和冷冻干燥多组分混合物期间有效控制PH，其中所述组分可具有在溶液中或在冷冻干燥方法本身期间将pH改变至不太希望的趋势，即其中发生不需要的反应。优选地，被采用的任何缓冲物质以相对低浓度存在，优选地为IM或者更少，更优选地为100 mM或者更少,甚至更优选地为10 mM或者更少。显而易见的是可以在本发明中，在稍微不同于以上提及的pH值下使用相同的缓冲剂，或者使用其它基本上具有相同缓冲功能的其它缓冲物质。在本发明便利的是使用10x、50x或IOOx缓冲液浓度向要冷冻干燥的混合物中加入缓冲液。人们应意识到，稀释浓储备液可导致PH的显著变化。因此如果有必要实现特定的最终PH，人们应考虑自稀释效果预计的任何变化因素，以及混合物中其它组分的影响。微粒与羧基活性物质的混合物任选地含有多羟基物质。 这种羟基物质优选地为糖，其许多实例为本领域已知的。许多糖已经用作冷冻干燥方法的稳定剂。在一个特别优选的实施方案中，糖为海藻糖。尽管蛋白例如抗体含有大量的胺和羧基官能团两者，EDC广泛用于将这类分子连接于颗粒或其它表面。在这样的情况下明显存在自身聚合的风险，这可改变和/或损害抗体的生物活性，所述风险随着抗体或EDC的浓度增大而增大。可潜在地用于提高结合效率的一个策略为使用较低浓度的抗体，并在加入碳二亚胺之前使抗体移至与目标分子(例如颗粒、表面)接近。在本发明的优选实施方案中，用于葡聚糖涂覆的颗粒和实体物质之间结合反应的缓冲剂的离子强度相对低，以促进要结合的分子的初始非共价静电相互作用。抗体上的质子化的胺与微粒上的羧基接近允许以相对低浓度的EDC进行有效反应。使用低浓度的EDC也减少终止反应需要的猝灭剂的量。当不能容易采用低离子强度的溶液时，通过使用更多的羧基活性物质例如EDC或在7-4范围内的较低的pH (潜在增大EDC的反应活性)，并增大抗体上的正电荷，这可便于与荷负电的表面非共价相互作用，可提高反应效率。在结合反应之后使用本领域熟知的方法，改变由于打算的应用需要的缓冲液配方，并除去过量的反应物或副产物，可进一步处理微粒。取决于微粒的性质和粒度，并取决于要除去的分子大小，可采用方法例如脱盐、渗析或离心/洗涤。如果仅有小分子打算除去，脱盐是符合要求的。渗析可应用于更大范围的分子大小，选择具有适当分子量截留的渗析膜。结合反应本身和/或用于自颗粒洗掉过量的反应物的缓冲液可含有清洁剂，以消除非特异性或其它不需要的相互结合作用，例如去除与微粒非共价缔合的抗体，或者减少所结合的微粒与用于横向流动装置的材料的相互作用。清洁剂便利地可在干燥例如冷冻干燥颗粒之前与羧基活性物质一起引入，或者与用于溶解冷冻干燥的混合物的抗体一起引入，或者在结合反应已经结束或者已经通过加入猝灭剂终止之后引入。与抗体一起或在结合之后引入清洁剂提供最大的灵活性，因为这使得反应混合物或最终结合物的组成能够变化以适合于每一种实验目的。当未涂覆的颗粒与羧基活性物质结合时，所采用的条件优选地不允许与物质反应，因为这可促使颗粒在冷冻干燥之前聚集。所采用的条件可在冷冻干燥之后，通过加入在适当缓冲的溶液中的亲核试剂进行调整，以提供用于活化物质介导的反应的合适条件。本发明的方法也可用于金颗粒，金颗粒在光学显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、免疫印迹和横向流动方面具有应用。一定范围大小的金颗粒为市售可得到的，最常见的球形颗粒用于生物应用。对每一种应用最佳的直径可以变化。与胶乳微粒一样，金颗粒易于聚集，并且用于附着抗体的方法费力，通常需要对一定范围的蛋白浓度和pH值进行广泛试验，以实现稳定的结合。结合的机理不完全理解，但是如果PH被调整到稍微高于要涂覆的蛋白的pi的数值，成功的结果更有可能。金也可与蛋白中的硫原子(发现于半胱氨酸和蛋氨酸残基中)通过配位键相互作用。在本发明中，金颗粒优选地涂覆具有氨基和硫醇官能团两者的葡聚糖，其提供涂覆层物质的多点附着。所涂敷的颗粒然后用琥珀酸酐处理，得到羧基化的表面用于随后的结合反应。硫醇化的葡聚糖可使用本领域熟知的几种方法之一进行制备。在一个优选的实施 方案中，CM葡聚糖在EDC的存在下，与两种二胺即乙二胺和胱胺的混合物反应。改性的葡聚糖然后用DTT还原并脱盐，以除去过量的还原剂。在葡聚糖表面胺硫醇的比例可通过改变两种二胺的比例进行调整。优选地，乙二胺胱胺的摩尔比为80:20。这并不一定导致胺硫醇官能团的比例相同，通常这些官能团的比例为约90:10。通过采用本领域熟知的方法转化胺官能团的比例，硫醇基团也可被引入到胺化的分子中，例如氨基-葡聚糖。将硫醇化的葡聚糖与金颗粒一起温育，以使涂覆层能够通过与硫醇基团形成配价键附着。也可存在其它相互作用的模式，但是这些相互作用的详细知识不一定适用本发明的方法。发现对于相对大分子量的葡聚糖胶体稳定性最大。对于40 kDa大小或以下的胺化葡聚糖聚集明显。在优选的实施方案中，约150 kDa-500 kDa的硫醇化葡聚糖对于40 nm金颗粒的涂覆层为优选的。在涂覆之后，金颗粒优选地用过量的琥珀酸酐处理，以得到具有高胶体稳定性的涂覆颗粒，这些颗粒可与EDC接触并使用本发明的方法冷冻干燥。在优选的实施方案中，在MOPS缓冲液pH 7. 2中的涂覆的金颗粒在冷冻干燥之前与海藻糖和EDC混合。量子点(Q点)也可使用本发明的方法与其它分子结合。Q点为明亮的荧光无机半导体纳米微粒，其对于细胞和组织成像具有多种超过有机染料和荧光蛋白的优点。Q点的核心一般由硒化镉(CdSe)制成，用硒化锌涂覆，以减少光化学漂白和增加量子产率。通常Q点的发射特性取决于颗粒大小，因此Q点可通过在制造过程期间仔细控制大小调整到光谱的特定部分，但是对于其它类型的Q点可通过改变组成同时保持固定大小来变化荧光性能。Q点通常非常疏水，但是它们可通过例如用两亲聚合物包封而被制备为适合于生物应用。与其它类型的颗粒一样，具有多种官能团的Q点可得自商业来源。我们发现Q点甚至对于两亲聚合物表面有聚集的趋势，并且在本发明中，羧基化的Q点优选地用胺化葡聚糖涂覆以提高胶体稳定性。主要地对于相对大的尺寸，优选地大于40 kDa，优选地为150 kDa或者更大的葡聚糖可见这种稳定作用。在特别优选的实施方案中，EDC-介导的涂覆反应用在MOPS缓冲液，pH 7. 2中的150 kDa AM-Dextran 实施。
在琥珀酰化之后，在合适缓冲液中的具有覆层的Q点与海藻糖和EDC混合并冷冻干燥。除了其在使分子偶联于微粒中的用途以外，碳二亚胺也用于制备免疫原。例如，EDC可用于介导含有胺-或羧基-的分析物与‘载体蛋白’例如KLH (匙孔血蓝蛋白)或BSA (牛血清白蛋白)的交联。载体蛋白通常具有羧基和胺官能团两者，它们可在羧基活性物质的存在下导致均聚合，尽管聚合不一定有害，并且如果结合用于在宿主动物中引起形成抗体的目的甚至可为有益的。然而，必须存在足够的分析物与载体蛋白的结合，以使载体用其表面上的分析物分子修饰。阳离子化的载体蛋白通常支持产生免疫原，因为这样引起更强的免疫反应。在这种情况下，在冷冻干燥期间均聚合的可能性减小，但是分析物必须含有羧基官能团。胺与羧基活性物质例如EDC直接反应产生胍在这种情况下可为不需要的副反应。BSA用乙二胺阳离子化并在碱性缓冲液中的EDC存在或不存在下冷冻干燥。这种冷冻干燥的物料与羧基荧光素反应，以观察羧基官能团是否能与胺化的BSA在冷冻干燥周期之前和期间，在阳离子化的BSA暴露于EDC之后反应。观察到在存在但是不缺乏EDC下显著反应。在本发明的优选实施方案中，载体蛋白被阳离子化并在略微碱性缓冲液中的EDC存在下冷冻干燥。本发明的方法也可用于低分子量分子，这种分子可与羧基活性物质接触并干燥。随后用含有适当官能化的分子的混合物溶解可用于引发结合反应。例如，羧基荧光素可与糖和EDC在碱性pH下接触并冷冻干燥。所述物料可用胺化分子在合适的pH下重新构成。类似的方法可使用带有胺或酰肼基团的小分子，这种小分子在冷冻干燥之后可结合于羧酸物质。为了确定使含有胺和羧基官能团两者的物质(例如蛋白)的自聚合最小化的条件，人们可使用SDS-PAGE分析以检测二聚物、三聚物和高级聚合物的存在。用这种初始筛选鉴别的缓冲液亚集，然后可在冷冻干燥条件下进行检查。在本发明中，使用在各种缓冲液中的EDC和未修饰的BSA，我们发现对以下缓冲液存在最小反应EPPS pH 8.5; CHES pH 9.3。在具有较低pH值的HEPES和MOPS下可检测到聚合，并且在pH 5或pH 6的MES缓冲液中发生广泛交联。因此在本发明的一个优选实施方案中，含有羧基和胺基两者的蛋白分子可接触并与在〉pH 7和优选地〉pH 8的缓冲液中的EDC —起冷冻干燥。随后可在酸性缓冲液中与含有胺-或羧基-的小分子进行反应。优选地小分子为过量发，以防止或使蛋白的自聚合达到最小。不管所研究的特异性EDC介导的反应，在任何生物结合实验中，必须建立终止反应的方法。可用于终止本发明反应的方法与用于其它EDC结合程序的那些方法相同。按照本发明方法进行的反应可通过稀释反应混合物，或者加入能够使EDC失活或以其它方式干扰结合反应的物质，或者通过这些方法的组合进行猝灭。过量的EDC和副产物的物理分离可通过脱盐快速和容易地实现，尤其是如果结合反应的产物为直径大于脱盐色谱基质的孔隙的大分子时。干扰碳二亚胺反应的物质也为已知的。例如，硫醇使碳二亚胺失活，并可以与反应混合物中的生物分子适配的浓度使用。在抗体分子或其它具有二硫桥(disulfidebridges)的分子的情况下，需要其完整性以保持正确的结构和生物学功能，则非常高浓度的硫醇可为禁忌的。已知羧基加速碳二亚胺通过O-酰基异脲中间体水解分解，并且如果过量存在，对于有限量的碳二亚胺，可在结合反应中与任何生物分子上的羧基竞争。对于这种方法，人们应该考虑自猝灭剂产生的O-酰基异脲衍生物也可与连接于结合混合物中的生物分子的胺反应的可能性。用这种方式将胺封端(Capping)在所有情况下可为不合适的。 同样，足够高浓度的胺可用于进攻EDC，但是必须考虑将猝灭剂分子再次连接于在结合中产生的O-酰基异脲部分的可能性。羟胺也已被报道干扰EDC介导的反应，并且也可用作猝灭剂。虽然在磷酸盐缓冲液中的反应经常推荐使用EDC，有压倒性的证据显示，磷酸盐减少反应效率。在结合反应结束时加入磷酸盐缓冲液可为希望的，尤其是如果其它类型的猝灭剂为禁忌时。无论使用什么类型的猝灭剂，最希望的浓度应通过考虑EDC的初始浓度、允许用于猝灭步骤的时间、结合打算的应用和结合反应中涉及的分子类型进行确定。对于其中过量的EDC不与结合物物理分离的一步法，直接使EDC失活为选择的方法。在特别优选的实施方案中，巯基乙醇为猝灭剂，并且以PH >7，优选地为约pH 8的缓冲液引入。缓冲液可为例如TBS或PBS。最后，本发明的方法已经用于不同类型的带有覆层的微粒，包括胶乳微粒、金微粒和Q点。生物分子和小的有机分子也已与EDC—起被冷冻干燥并用于结合反应。这些方法也可应用于另一种羧基活化剂，WRK。涂覆每一种类型的颗粒需要的葡聚糖的最小尺寸可以变化，但是从本文描述的方法显而易见的是，葡聚糖的大小范围应对于任何新型颗粒作为第一步进行评价。也显而易见的是，可对冷冻干燥的混合物的组成进行多种变化，而不背离本发明的精神和范围，这将在以下进行更充分的举例说明。本发明将通过以下实施例中的说明，并参照附图
进行更充分的描述，其中
图I显示在多种缓冲液条件下将EDC预先温育5分钟(A)或24小时(B)后，如在生物结合测定(BSA凝胶化)中测定的EDC的稳定性(实施例I)；
图2显示在用各种缓冲液温育之后，如通过与苯胺反应测量的EDC的稳定性。Fd意指样品在于试验中测试之前被冷冻干燥。(_)意指样品没有冷冻干燥。(b)空白试验(平均5个样品)(实施例2);
图3显示在各种羧基化分子存在下，在MES缓冲液pH 6或EPPS缓冲液(pH 8. 5)中温育之后，如通过与苯胺反应测量的EDC的稳定性。Ac，乙酸钠；Cit，枸橼酸三钠；Ed，EDTA。b，空白试验(实施例2)；
图4显示一种典型的横向流动试验，其中在EDC下的存在(A)或不存在(B)下，将琥珀酰化葡聚糖涂覆的微粒冷冻干燥，并在带有兔IgG斑点的试纸条上进行测试之前与山羊抗兔IgG反应(实施例8)；
图5显示使有兔IgG斑点的横向流动试纸条与山羊抗兔IgG Q点结合物一起运行的荧光读数。结合物通过向冷冻干燥的琥珀酰化葡聚糖涂覆的Q点/EDC混合物中加入山羊抗兔IgG的溶液来制备(实施例10)；
图6显示横向流动测试，其中在带有兔IgG斑点的试纸条上进行测试之前，琥珀酰化葡聚糖涂覆的微粒与不同浓度的伍德沃德氏(Woodward)试剂K和山羊抗兔IgG反应。A, 100mM WRK; B, 10 mM WRK; C，I mM WRK (实施例 11);和
图7显示横向流动测试，其中在带有兔IgG斑点的试纸条上进行测试之前，琥珀酰化葡聚糖涂覆的微粒与10 mM伍德沃德氏(Woodward)试剂K和山羊抗兔IgG反应。A MES缓冲液，pH 6; B, MOPS缓冲液，pH 7.0; MES缓冲液，pH 5 (实施例12).
实施例I. BSA结合测定
在 0.5MMES (pH 6.0)中以 100 mg/ml 浓度制备BSAt^fEDC (Fluka,产品编码 03449)在水中的样品(IM)与各种受试缓冲液或溶液(各100 mM)以1:1比例混合。将EDC/缓冲液混合物在25°C下预先温育，在不同时间点抽取100 ul等分试样并加入到O. 4 ml BSA溶液中，得到最终的EDC浓度(假定在温育期间不分解)为100 mM。约每10秒钟将试管倒置，并在每一种情况下测定形成凝胶花费的时间(即倒置时流体不移动的时间点)。在预先温育时间为5分钟和24小时后的结果分别显示在图IA和图IB中。注释倒数值已被绘制，以致最短的胶凝时间相当于具有最大高度的棒条。在与EDTA pH 8、乙酸钠pH 4或枸橼酸三钠一起预先温育5分钟后未见凝胶化。在用磷酸盐缓冲液(碱性pH)、硼酸盐和碳酸钠预先温育后可见显著的凝胶化延迟。用HCl预先温育5分钟导致最快速的凝胶化反应，但是样品在预先温育24小时后未能引起凝胶化。甚至在预先温育6天后(数据未显示)，6个样品(水，MOPS, EPPS, Tris, Hepes, NaOH)仍能引起BSA的凝胶化。检查在胶凝时间与新鲜制备的EDC的浓度之间的关系(浓度，用于凝胶化的时间[分钟·秒]):100 mM, 6. 59; 90 mM, 8. 12; 80 mM, 9. 18; 70 mM, 11. 20; 60 mM,13. 21; 50 mM, 16. 12; 40 mM, 22. 47; 30 mM, 50. 14; 20 mM和 10 mM;未凝胶化。因此甚至在预先温育6天后，一些EDC混合物显示分解少于80%。在最好的情况下(水/EDC)观察到凝胶化时间〈20分钟，相当于分解水平少于60%。实施例2.苯胺测定
苯胺测定基本上如由Williams等(Anal. Biochem. 114，173-176 [1981])描述的那样，伴随微小的改进来进行。将含有EDC (100 ul)的样品加入到100 ul的苯胺盐酸盐(IM)中，并在25°C下温育I分钟。将混合物的50 ul等分试样加入到I. 20 ml的2M HCl中，并在230 nm下相对于对照组(不含EDC)读取吸光度。用选择的缓冲液(10 mM最终，自以下储备液制备1M MOPS, pH 7.2; IM Hepes,pH 7. 5; 0. 5M EPPS pH 8. 5; 0. 5M MES, pH 6; 0. 5M CHES pH 9. 3)检查 EDC (10 mM 最终)的稳定性。在温育3小时时间之后(数据未显示)，观察到很少或者没有活性丧失。然后检查用于与EDC冷冻干燥的这些缓冲液的适用性。如在实施例6中描述的那样冷冻干燥的物质用水重新构成，并在苯胺测定中进行测试。对于CHES/EDC混合物可见活性显著丧失，但是其它混合物仅呈现活性的适度丧失(图2)。在100 mM MES缓冲液(pH 6)和100 mM EPPS (pH 8. 5)中研究一些据报道催化EDC分解的物质(乙酸盐，枸橼酸盐，EDTA)的作用。制备缓冲液/催化剂混合物并在加入EDC之前将pH值调节到所指定的数值。在用乙酸盐(单羧基)、枸橼酸盐(三羧基)或EDTA (四羧基)温育3小时之后，在MES缓冲液可见一些活性丧失。使用多元羧酸催化剂，活性丧失的幅度要大得多。在EPPS缓冲液中，活性丧失很不明显(图3)。实施例3. AM-葡聚糖(AM-Dextran)的制备
通过与IM溴乙酸在2M NaOH中反应，将葡聚糖(最终浓度100 mg/ml)转化为CM (羧甲基)葡聚糖。在25°C下48小时之后，通过小心加入小等分试样的浓HCl将溶液中和至pH 7. 5。通过将 I. 5 ml 部分在用 50 mM MES pH 6. O 平衡的 S 印 hadex G25 (PD IO 柱，GEBiosciences)上脱盐，将CM-葡聚糖与过量的反应物和副产物分离。CM-葡聚糖用2 ml体积洗脱，向其中加入乙二胺在O. 5M MES pH 6. O中的400 ul的2M储备液。从IM储备液加入EDC，至最终浓度为100 mM，并将混合物于25°C下温育过夜。另外加入EDC至100 mM浓度，并如以上那样重复温育。AM-葡聚糖混合物用I ml部分在Sephadex G25上脱盐至50 mM MES pH 6. O中，得到最终浓度为 25 mg/ml。这种方法用于平均大小为500 kDa,150 kDa, 40 kDa 的葡聚糖聚合物(Pharmacosmos 产品编码 5510 0500 4006, 5510 0150 4006， 5510 0040 4006)。实施例4.胶乳颗粒用AM-葡聚糖涂覆
蓝色胶乳微球(270 nm直径；parking area 61, Seradyn, 产品编码83100670020350) (I ml)通过稀释至4 ml的150 kDa AM-葡聚糖(实施例3)中进行涂覆。在25°C下温育30分钟之后，加入EDC至最终浓度为100禮，并在25°C下轻轻搅动微粒24小时。实施例5.琥珀酰化微粒的生产
将如在实施例4中所述生产的葡聚糖涂覆的颗粒用得自2M储备液，pH 7. 5的400 mMIfepes缓冲液补充，并加入琥珀酸酐(1M在DMSO中)至最终浓度为100 mM。轻轻搅拌反应混合物，并通过定期加入小等分试样的5M NaOH保持在pH 6-pH 7之间。一旦pH已经稳定(通常在约10分钟后)，将混悬液转移至纤维素酯渗析袋中(I百万Dalton截止值；Spectrum,产品编码131486)，并对25 mM MES (pH 6.0)进行广泛渗析。每一批的稀释用横向流动分析校准，并将原料材料用25 mM MES缓冲液稀释至合适的工作浓度。实施例6.葡聚糖涂覆的胶乳微粒的冷冻干燥
相同的基本程序被用于如在实施例4和5中所述制备的各种葡聚糖涂覆的胶乳微粒。微粒首先通过脱盐或渗析到1-10 mM浓度的缓冲液中进行缓冲交换。或者，将缓冲浓缩液(至少O. 5M)加入到悬浮于水中的微粒中，得到需要的最终缓冲液浓度。所使用的缓冲液类型包括EPPS, pH 9，EPPS pH 8. 5，MOPS pH 7. 2，MOPS pH 7，Hepes, pH 7. 0，MES pH6和MES pH 5。将0.8 ml份的缓冲的带覆层的微粒溶液补充100 ul海藻糖储备液(I g溶于2 ml水中)和100 ul的EDC储备液(范围0-100 mM,取决于要求的最终浓度)。在大多数情况下，最终浓度为1，5或10mM。将体积如要求的那样按比例放大或缩小以得到需要量的物料用于冷冻干燥。将微粒混合并按50 ul或100 ul每份分配，用液氮冷冻，并按照以下程序在Virtis Advantage冷冻干燥器中冷冻干燥步骤I,温度_40°C,持续时间1320分钟；步骤2，温度-10°C，持续时间60分钟；步骤3，温度+20°C，持续时间60分钟。这些管提供足够的物料以进行I或2次横向流动测试。按比例放大通过冷冻干燥更大体积或通过使用更浓的微粒来实现(实施例20)。实施例7.横向流动试纸条的生产和使用
沿着试纸条约三分之一距离用在150 mM NaCl加上5%甲醇中的O. 5 ul纯化的兔IgG(2 mg/ml)对硝化纤维素膜(约4 cm X O. 4 cm)点样(spotted)。使所述试纸条在室温下干燥至少60分钟，但是通常为2-24小时，然后用在TBS，pH 8或50 mM磷酸钠，pH 7. 2中的O. 1% BSA封闭。试纸条用在水中的O. 5%海藻糖洗涤，并空气干燥。为了测试用山羊抗兔IgG涂覆的微球，将最接近兔IgG斑点位置的试纸条末端浸溃到50 ul微粒混悬液中，将吸水纸垫应用至另一个末端。使试纸条渗开直到整个样品进入硝化纤维素膜。在一些情况中，通过将试纸条转移至50 ul缓冲液中另外4-5分钟清除背景。可改变缓冲液并且特定的缓冲条件在别处给出。实施例8.冷冻干燥的微粒与抗体的反应冷冻干燥的微粒用在MES缓冲液(50-200 mM) (pH 6)中含有山羊抗兔IgG (1-50 ug)的溶液重新构成，最终体积为50 ul。在温育合适的时间期间(2. 5分钟至最多I小时)之后，通过用Iml TBS pH 8. O稀释来猝灭样品。样品以18000xg离心15分钟。小心弃去上清液，并将丸粒重新悬浮于含有O. 1% Tween 20的50 ul的TBS中。图4显示在10 mM EDC存在或不存在下，用10 mM EPPS缓冲液(pH 8.5)冷冻干燥的蓝色胶乳270 nm葡聚糖涂覆的琥珀酰化微粒得到的一个典型实例。实施例9. Q点结合反应
Q点(Crystalplex 20 nm,产品编码NCC-665,羧基化的纳米团簇(nanoclusters),发射最大665 nm; 28 mg/ml)用50 mM MOPS (pH 7. O)稀释1/10，并将100 ul的混悬液与400 ul的150 kDa AM-葡聚糖(实施例3)在50 mM MOPS (pH 7. O)中合并，且在25°C下，于Spiramix上温育30分钟。自2M储备液加入EDC (26 ul)，得到100 mM的最终浓度。在温育5-16小时之后，向混悬液中加入80 ul在DMSO中的IM琥珀酸酐，连同160 ul的2MHEPES/10 mM EDTA, pH 7. 5 和 40 ul 的 50 mM MOPS pH 7. O0 在 Spiramix 上温育 30 分钟后，使样品在用水平衡的F1DlO柱上脱盐。琥拍酰化的纳米团簇以12000 rpm,在microfuge旋转15分钟，并将丸粒重新悬浮于400 ul水中。实施例10.在EDC存在下冷冻干燥的Q点的反应
将如在实施例9中所述制备的Q点混悬液部分(50 ul)与5 ul的海藻糖储备液(I g+ 2 ml 水)、2· 5 ul 的 200 mM EPPS, pH 8. 5 和 3 ul 的或者 100 mM EDC (最终浓度为 5mM)或者水混合。将样品冷冻，并使用在实施例6中概述的方案冷冻干燥，然后在_20°C下储存2天。制备含有山羊抗兔IgG (13 ul的2. 3 mg/ml)、60 ul的O. 5 M MOPS, pH 7. O和77 ul水的混合物，并向冷冻干燥的Q点的每一试管中加入50 ul份(10 Ug抗体)。如在实施例8中描述的那样进行结合和洗涤。如在实施例7中描述的那样进行横向流动试验。通过使50 ul缓冲液沿着试纸条渗开清除背景，并切除相当于固定化的兔IgG区域的面积，且读取50 ul TBS中的黑色96孔板(激发350 nm/发射665 nm)。对于用或不用EDC制备的结合物，荧光读数分别为43552和5034，如在图5中显示的那样。实施例11.伍德沃德氏试剂K的浓度的优化
将葡聚糖涂覆的微粒(200 ul)(如在实施例4中所述制备)使用NAP-5柱脱盐至350ul水中。制备在水中的1M、100 mM和10 mM的伍德沃德氏试剂K (WRK)的储备液。将40ul的微粒与3 ul的I mg/ml山羊抗兔IgG (3 ug) UO ul水和6 ul的WRK储备液混合，得到100 mM、10 mM和I mM的最终浓度。在25°C下30分钟后，加入950 ul的TBS，并将样品用微型离心机旋转15分钟。将丸粒再次悬浮于60 ul TBS/0. 1% Tween 20中，并用横向流动试验测试样品(实施例7)。通过视觉评价，含有100 mM WRK的样品在离心之前显然含有聚集体，并且这一点通过横向流动试纸条底部的物料积聚得到证实，如在图6中所示。实施例12.用于与伍德沃德氏试剂K反应的缓冲液的优化
将在水中的40 ul琥珀酰化的270 nm蓝色胶乳微粒(如在实施例5中描述的那样制备)与3 ul的I mg/ml山羊抗兔IgG (3 ug)、6 ul的100 mM WRK (10 mM最终浓度)和10 ul的选自以下清单的缓冲液混合1M MES pH 6. O; IM MOPS pH 7. 0; IM MES pH 5.0。在结合30分钟后，用TBS洗涤并离心，将每一种丸粒重新悬浮于60 ul的TBS/0. 1% Tween20中。用横向流动试验测试样品(实施例7)。结果显不在图7中。在pH 5. O下反应后可见最大斑点强度。实施例13.用伍德沃德氏试剂K冷冻干燥胶乳微粒
将如在实施例4中描述的那样制备的200 ul琥珀酰化的蓝色270 nm葡聚糖涂覆的微粒脱盐至400 ul的25 mM MES (pH 5)中。将40 ul份的脱盐微粒与5 ul海藻糖储备液(I g在2 ml水中)和5 ul的100 mM WRK混合，并用液氮冷冻。按照实施例6的程序进行冷冻干燥。实施例14. EDC用小有机染料冷冻干燥
将羧基荧光素(Sigma C7153)溶于25 mM Epps pH 9. O中，得到具有pH 4. O的10 mM储备液。将O. 5 ml样品用O. 5 ml的100 mM EPPS (pH 9. O)稀释，并加入100 ul的海藻糖储备液(I g加上2 ml水)。pH测量为7. 71。加入EDC (11 ul的IM储备液)至最终浓度为10 mM，并将100 ul等分试样如在实施例6中所述进行冷冻干燥。冷冻干燥的样品(2个试管；两者为阳性对照)与100 ul的500 kDa AM-葡聚糖在50 mM MES pH 6. O中反应(如在实施例3中所述制备)I小时，之后加入100 ul 14. 3 mM巯基乙醇，并使反应继续进行另外I小时。与以上反应相平行，2个试管(两者为阴性对照)的干燥的羧基荧光素/EDC混合物各自用100 ul猝灭剂(14.3 mM巯基乙醇)重新构成。I小时后，加入在50 mMMES (pH 5. O)中的100 ul的500 kDa AM-葡聚糖，并继续温育另外I小时。将阳性和阴性对照管的内容物合并，并通过在分开的NAP-5柱上脱盐交换至500 ul TBS0对于1/100稀释的阳性和阴性对照的荧光值(激发490 nm/发射535)分别为44129和229 (平均值，n=3)。实施例15. EDC用蛋白分子冷冻干燥
BSA (I ml的10%溶液)通过与9 ml的O. 5 M MES/2M乙二胺(pH 6)加上I ml的EDC(IM)在25°C下反应4小时进行阳离子化。将I ml的反应混合物在HHO柱上脱盐至I. 25ml的10 mM EPPS (pH 8. 5)中，向其中加入125 ul的海藻糖储备液(I g在2 ml水中)。将两个600 ul等分试样分配至单独的管中，一个管(类型A)补充6 ul的IM EDC和另一个管(类型B)补充6 ul水。来自每一种类型的100 ul等分试样按照实施例6的程序冷冻干燥。使羧基荧光素溶于100 mM MES (pH 6)中，并向每一种类型的管中的一只加入100ul等分试样。30分钟后，加入等体积的IOX TBS并将管放置过夜。将样品在NAP-5柱上脱盐至TBS中。如在实施例14中那样对1/100稀释的类型A和类型B样品测量荧光值，分别为33200和103荧光单位。实施例16.用BSA涂覆金颗粒
将金颗粒(200 ul的15 OD材料,或者20 nm或者40 nm裸金；Bioassay Works)加入到在水中的I ml的10 mg/ml BSA中。在20°C下温育过夜后,样品用管形材料(Spectrum,产品编码131486)对2种变化的IL水进行渗析(每一个渗析3小时)。渗析的金通过加入100 mM储备液(pH 9)达到10 mM EPPS。自10 mM储备液加入EDC至I mM。最后加入海藻糖至3. 33% w/v。样品用液氮冷冻，并按照实施例6的程序冷冻干燥。实施例17.硫醇/氨基葡聚糖的生产
将CM-葡聚糖(500 kDa) I ml与200 ul的混合二胺溶液和来自IM储备液的EDC混合(至最终浓度为100 mM)，混合的二胺溶液通过以20:80体积比合并胱胺在O. 5 M MES (pH 6.0)中的2M溶液和在O. 5 M MES (pH 6)中的2M乙二胺来制备。在25°C下温育过夜后，将样品脱盐至O. I M磷酸盐缓冲液(pH 8. O)中，并自200 mM储备液加入DTT至最终浓度为20 mM。在25°C下温育I小时后，将样品脱盐至100 mM MES缓冲液(pH 6)中，并立即如在实施例18中描述的那样用于涂覆金颗粒。实施例18.用硫醇化的葡聚糖涂覆金颗粒
金颗粒(15 0D)用如在实施例17中描述的那样制备的硫醇/氨基葡聚糖稀释至1/10，并在25°C下温育过夜。对于每ml颗粒，加入100 ul的2 M H印es，随后加入琥珀酸酐(自DMSO中的IM储备液)至最终浓度为100禮。30分钟后，材料经2个周期的离心洗涤，并用20 mM MOPS缓冲液(pH 7. 2)洗涤。向每ml颗粒中加入100 ul的海藻糖储备液(I g在
2ml水中)，随后加入EDC (来自在水中的IM储备液)至浓度为10 mM。样品按照实施例6中描述的的程序进行冷冻干燥。实施例19.自缓冲液浓缩物制备的溶液的pH控制
制备以下缓冲液浓缩物:0.5 M EPPS, 8. 5; IM MOPS pH 7. 2; IM Hepes, pH 7. 5;I M MES pH 6和O. 5 M CHES, pH 9. 3。在水中制备I M EDC。各种缓冲液/EDC混合物通过适当稀释储备液物质进行制备，得到在10 mM缓冲液中的O mM、l mM或10 mM EDC0各种溶液的 pH 值为(缓冲液，O mM EDC 的 pH，I mM EDC 的 pH，10 mM EDC 的 pH) : EPPS, 7. 59，
7.67, 7. 73; MOPS, 6. 18, 6. 25, 6. 34; Hepes, 6. 58, 6. 64, 6. 73; MES, 5. 22, 5. 29,
5.35; CHES, 8. 64, 8. 74, 8.82。从这些数据可见，除了 EPPS，具有pKa值在pH 7-8之间的缓冲液(例如MOPS，Hepes)也可制备为在pH 8-8. 5范围的浓缩物，以实现最终pH值在pH 7-pH 8 之间。实施例20.浓胶乳微粒的制备
将I ml的150 kDa AM-葡聚糖(实施例3)与O. 11 ml的海藻糖(I g在2 ml水中)混合，用液氮冷冻，并使用实施例6中给出的程序冷冻干燥。所述干燥粉末用I ml的储备液蓝色270 nm羧基化胶乳颗粒(Seradyn，产品编码83100670020350)重新构成，并在室温下温育24小时，之后加入100 ul的I M EDC0在温育18小时后，加入200 ul的2M Hepes/10mM EDTA，随后加入在DMSO中的100 ul的琥珀酸酐(I M)。在25°C下30分钟后，使物料对3种变化的IL的25 mM MES缓冲液(pH 6. O)进行渗析。然后将I ml渗析的样品使用PDlO柱缓冲交换至I. 5 ml 10 mM EPPS缓冲液。对于每ml在EPPS缓冲液中的微粒加入100 ul海藻糖，随后自I M储备液加入EDC，得到最终浓度为10 mM。使用合适大小的玻璃小瓶，将样品以不同大小的等分试样冷冻干燥。例如，将10 ul样品分配至X-小瓶(Cronus，VZM-0309CF-100);将40 ul 样品分配至香槟玻璃瓶(Cronus, VZM-1509CC-100) ；0. 4 ml 体积在2 ml血清小瓶(Voigt 7010. 90. 0540)中冷冻干燥，和I ml体积分配至10 ml血清小瓶(Wheaton, 223686)中。实施例21.与冷冻干燥的ADP/EDC混合物结合
将 500 ul 的 20 mM ADP 一钾盐(Fluka 产品编码 01899)与 200 ul 的 O. 5 M EPPS pH
8.5,100 ul的海藻糖(I g在2 ml水中)、200 ul水和5 ul的或者2 M EDC (最终浓度为
10mM)或者水混合。将100 ul的等分试样使用实施例6中给出的干燥程序冷冻干燥。两种类型的干燥粉末(即含有和不含EDC)用100 ul的如在实施例15中描述的那样制备的(但是脱盐至水中而不是EPPS缓冲液中)阳离子化BSA和100 ul的O. 5 M MES (pH 6. 2)重新 构成。在25°C下反应18小时后，通过在用O. 15 M NaCl平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上脱盐去除游离的ADP。合并含有蛋白的部分(0.3 ml)，并通过与75 ul用于无机磷酸盐的 PiColorlock Gold 比色检测试剂(Innova Biosciences 产品编码 303-0030),在 100°C下加热进行酸水解5分钟。200 ul用或不用EDC制备的水解的BSA-ADP结合物样品的减去吸光度的空白值(A65tl)分别为I. 22和0. 08。
权利要求
1.一种生产试剂的方法，所述试剂用于含有羧基或磷酸酯基的第一反应物与含有胺基的第二反应物之间的结合反应，所述方法包括 a)形成以下组分的溶液或混悬液 i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物质，其能够作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分，以促使在羧基和胺基之间形成酰胺键，或在磷酸酯基和胺基之间形成氨基磷酸酯键，和 )第一反应物或第二反应物；和 b)干燥所述溶液或混悬液。
2.依据权利要求I的方法，其中羧基活化或磷酸酯活化的 物质和第一或第二反应物以溶液，优选地以水性溶液的形式混合。
3.依据权利要求I的方法，其中羧基活化或磷酸酯活化的物质包含碳二亚胺或伍德沃德氏试剂K (WRK)。
4.依据权利要求3的方法，其中羧基活化或磷酸酯活化的物质包含EDC或CMC。
5.依据任何一项前述权利要求的方法，其中步骤b)包含冷冻干燥。
6.依据任何一项前述权利要求的方法，其中所述溶液或混悬液包含含有羧基或磷酸酯基的第一反应物。
7.依据任何一项前述权利要求的方法，其中溶液或混悬液中的第一或第二反应物包含有色的、发荧光的、酶、磁性或颗粒标记。
8.依据任何一项前述权利要求的方法，其中溶液或混悬液中的第一或第二反应物包含颗粒。
9.依据权利要求8的方法，其中颗粒具有聚合物涂覆层。
10.依据任何一项前述权利要求的方法，其中溶液或混悬液包括多羟基材料。
11.依据任何一项前述权利要求的方法，其中溶液或混悬液包括缓冲剂。
12.依据任何一项前述权利要求的方法，其中溶液或混悬液的pH大于4，优选地大于6，大于7或大于8。
13.—种通过任何一项前述权利要求的方法生产的试剂。
14.一种干燥的试剂，所述干燥的试剂用于含有羧基或磷酸酯基的第一反应物与含有胺基的第二反应物之间的结合反应，所述试剂包含以下组分的均匀混合物i)羧基活化或磷酸酯活化的非酶物质，这种物质能够作用于含有羧基-或磷酸酯基-的部分，以促使在羧基和胺基之间形成酰胺键，或在磷酸酯基和胺基之间形成氨基磷酸酯键，和ii)第一反应物或第二反应物。
15.依据权利要求13或14的试剂，所述试剂在容器中。
16.一种结合试剂盒，所述试剂盒包含提供的依据权利要求13、14或15的试剂和使用说明书。
17.一种实施结合反应的方法，所述方法包括使用依据权利要求13、14或15中任何一项的试剂，或者使用依据权利要求16的结合试剂盒。
18.—种生产基本上如上所述的试剂的方法。
19.一种用于基本上如上所述的结合反应的试剂。
20.一种实施基本上如上所述的结合反应的试剂盒。
全文摘要
本发明描述了一些方法，所述方法使碳二亚胺或其它羧基活性物质能够与羧酸或磷酸酯或胺或其组合混合，以致形成均匀混合物，该混合物然后经干燥，优选地用冷冻干燥方法。这种混合物然后与实体物质接触，优选地包括用所述实体物质的缓冲溶液溶解混合物，以致在实体物质与混合物中的组分之间发生结合反应。
文档编号C07C267/00GK102933547SQ201180022576
公开日2013年2月13日 申请日期2011年3月15日 优先权日2010年3月5日
发明者N.吉, A.德拉吉 申请人:创新生物科学有限公司