专利名称：一种连续分离唾液酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种连续分离唾液酸的方法，属于生物制品分离纯化技术领域。
技术背景
唾液酸(Sialic Acid，SA)是九碳糖神经氨酸酰化物的总称，它广泛存在于多种生物组织中。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸，所以通常把 N-乙酰神经氨酸称为唾液酸。唾液酸在自然界分布很广，已经发现许多生物体内存在唾液酸，它通常位于细胞膜最外层的糖类部分和分泌的糖复合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的关键位置，是糖复合物结构和功能多样化的重要物质基础。
唾液酸的生物学功能有两大类，即唾液酸本身能被识别的受体作用和掩盖其它分子的掩蔽作用。近年来也发现，唾液酸及其衍生物在各种生命活动调节中起着重要的作用， 与许多疾病密切相关，在抑制唾液酸转移酶和抗癌转移、促进神经细胞增长与抗老年痴呆症、抑制唾液酸酶与抗病毒、抑制白细胞薪附与抗炎等方面，此外唾液酸在控制细胞黏液浓度、抗识别、抗肿瘤等生理功能上也具有很大作用。
关于唾液酸的工业化制备方法主要有天然物抽提法和酶法合成。由于唾液酸在天然原料中含量比较低，天然物抽提法的分离提纯过程比较复杂，收率较低，同时需要一些特殊的设备，造成的污染较大，这必然影响到唾液酸衍生物的开发和利用。酶法生产唾液酸具有转化率高、提取简单、产品纯度高等优点，但对合成所用原料要求高，价格较为昂贵，与此同时唾液酸醛缩酶不易获得，限制了生产规模的扩大。
在唾液酸酶法转化液中，除了反应底物丙酮酸钠、N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)胺以及反应产物唾液酸，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)等主要成分外，还有微生物细胞及其碎片、杂蛋白、无机盐和色素等多种成分。因此选择经济合理的唾液酸的提取工艺对提高唾液酸的市场竞争力十分重要。已有报道的提取方法和分离方法主要有
1韩孝清(专利02110607. χ)发明了一种从蛋黄粉中提取唾液酸的方法。首先将蛋黄粉水解，水解液经加热和絮凝除去蛋白，用强酸、弱碱树脂除离子；再以强碱树脂吸附唾液酸，甲酸做洗脱剂；最后洗脱液经浓缩结晶，烘干得到唾液酸成品。
2韩孝大(专利03115456. 5)选用乳清粉做原料，用超滤的方法除蛋白，后续提取步骤与韩孝清的类似。
3许平(专利200410024222. 3)等发明了一种以廉价乳酸钠为前体，经多步耦联生物转化合成唾液酸以及通过离子交换分离纯化唾液酸的方法。转化液经酸化离心等预处理后，直接采用离子交换柱分离唾液酸，所用树脂为ΗΖ201χ8，330和717等商业化强碱树脂。 树脂需先用1Ν-2Ν的NaOH溶液处理；再水洗；最后用1Ν-3Ν的甲酸溶液处理使树脂转成甲酸型。洗脱时，先用水，再用0. 5-3Ν的甲酸溶液进行梯度洗脱，收集1Ν-3Ν的洗脱流出液。 流出液经真空冷冻结晶得到唾液酸成品。
但从操作工艺和提取的经济性分析，以上方法具有一定的缺陷。首先在现有的唾液酸生产工艺中，采用固定床离子交换技术，所采用的是间歇式操作方式，该技术存在多种弊端，由于该过程不连续，造成产率低，上柱树脂的利用率低，洗脱剂消耗大，树脂用量大， 废水排放量大等缺点。同时，选用甲酸型树脂做分离介质，树脂预处理和再生步骤繁琐，且甲酸具有腐蚀性，易污染唾液酸。因此发展高效率、低成本的唾液酸提取方法对促进唾液酸的产业化显得至关重要。发明内容
本发明主要目的是克服现有技术中使用固定床离子交换技术分离唾液酸过程中存在生产成本大、操作繁琐、分离纯化效果不佳、不易规模化、只能间歇操作、不适宜工业化生产的不足。拟选用一种新型的分离介质，并基于这种介质开发一种连续分离唾液酸的方法。该工艺可以提高树脂的利用率(接近95%)、减少洗脱剂的消耗，同时避免了树脂的活化、再生，节约了酸碱的消耗，减少了废液的排放。从而实现低成本、高收率、连续生产唾液酸的目的。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下
一种连续分离唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠为底物通过微生物发酵制得，将发酵液通过过滤、超滤处理后得唾液酸清液，泵入装有OH-型阴离子交换树脂的连续离子交换系统中进行吸附，去离子水进行洗杂，氯化钠溶液进行洗脱，氢氧化钠溶液进行树脂再生，收集含有唾液酸的洗脱液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析结晶，晶体减压干燥后即得唾液酸纯品。
其中，所述的唾液酸的微生物发酵制备方法，是通过对含有sir (表达异构酶)的重组大肠杆菌和含有NanA(表达醛缩酶)的重组大肠杆菌的分别进行高密度培养，获得两种高表达的大肠杆菌菌体。37°C下，以N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和过量的丙酮酸钠为底物，加入获得的两种重组大肠杆菌混合培养3 催化合成唾液酸，具体参考文献(Yinan Zhang, Fei Tao, Miaofen Du et al (2010) An efficient method for N-acetyl-D-neuraminic acid production using coupled bacterial cells with a safe temperature-induced system Appl Microbiol Biotechnol 86 :481-489)。
其中，所述的乳清酸水解液中，唾液酸的浓度为1 20g/L。
其中，所述的超滤处理，截留分子量为1万 8万道尔顿。
其中，所述的阴离子交换树脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架，以季胺基 (-N+R3)为功能基团。
其中，所述的阴离子交换树脂粒度为0. 315-1. 25mm，湿视密度为0. 66-0. 75g/ml， 含水量为42-48%。
其中，所述的连续离子交换系统是由6-60根离子交换柱串联的连续操作的离子交换系统，通过组合式阀门将离子交换过程中的吸附、洗杂、洗脱和再生四个工段之间按顺序切换，将吸附段离子交换柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附段送入洗杂段进行洗杂，洗杂结束后立刻移出洗杂段进入洗脱段进行洗脱，洗脱完成后立刻移出洗脱段送入再生段进行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个工段的第1根离子交换柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根离子交换柱处于吸附阶段。
上述连续离子交换系统优选5-40根离子交换柱串联，更优选8-M根离子交换柱串联。
所述的连续离子交换系统中，吸附段、洗杂段、洗脱段和再生段的阴离子交换柱各自为1-20根，优选1-10根，更优选2-6根。
所述的连续离子交换色谱技术是采用转盘带动树脂柱连续旋转，并通过不同的分离区。树脂柱连续变址通过每个槽口，通过槽口的物料及流量由各槽口分别控制。分配阀随之同步转动，将液体分配至树脂柱中，并收集最终的产品。当吸附饱和的树脂柱离开吸附区时，经再生和洗涤的新鲜树脂床即随即进入吸附区。在试验中可以采用串联方式来调整树脂柱的数量，以确保出料质量和浓度的连续稳定。
其中，所述的氯化钠溶液浓度为0. 001-2M，优选地0. 1-0. 8M ；所述的氢氧化钠溶液浓度为0. 001-2M，优选地0. 1-2M。
其中，所述的乙醇水溶液浓度为5_40g/L，乙醇水溶液的加入量为洗脱液体积的 1-2 倍。
其中，乙酸乙酯加入量为乙醇水溶液与洗脱液混合体积的0. 1-1倍。
有益效果本发明所述的利用连续离子交换分离纯化唾液酸的方法具有如下优占.^ \\\ ·
1)与传统的离子交换系统相比，其设备紧凑，系统简化，管道缩减，减少了 40%的占地面积，具有更好的灵活性，减少移动部件。
2)树脂用量节约了 65%。其中树脂总处于执行一项功能状态。20%的树脂总是处在吸附再生状态，20%再生，30%洗杂/洗脱。
3)采用了碱类再生剂，提高了利用率而用量减少了 40%以上，产品收率达到99% 以上。
4)减少了 30-40%的再生液，40-50%的洗脱液，减少了 60%的废液量。洗脱产率提高2-3倍，洗脱液的浓度提高了 5-10倍。
因此本发明的分离纯化方法简便易行，效果好，不仅其设备投资、运行成本低廉， 而且可以根据分离量的多少，实现从公斤级到吨级的分离，通过本发明所得产品在收率和产品质量方面都获得了极好的结果，保证了产品品质。同时最大限度的减少再生液，洗杂液和洗脱液的用量。同时提高了分离产物的浓度，可以直接进行结晶纯化。
图1是本发明的连续离子交换系统处于状态1的示意图。
图2是本发明的连续离子交换系统处于状态2的示意图。
图3是pH值对唾液酸吸附量的影响示意图。
图4唾液酸的洗脱图。
图5唾液酸的生物合成图。其中，两种高表达的大肠杆菌菌体分别为E. coli K12/ pBVS, E. coli K12/pVN，差向异构酶为GlcNAc 2-异构酶，酸缩酶为Neu5Ac酸缩酶。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
唾液酸的纯度是通过高效液相色谱检测得到。唾液酸的高效液相色谱分离的最佳条件为色谱柱a Bio-Rad Aminex HPX-87H column (300 X 7. 8mm)，流动相IOmM H2SO4,流速0. 4ml/min,检测波长210nm，柱温55°C，进样体积为20 μ L。采用外标法定量。
以下实施例所用的阴离子交换树脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架，以季胺基为功能基团，粒度为0. 315-1. 25mm，湿视密度为0. 66-0. 75g/ml，含水量为42-48%，由南京同凯兆业生物技术有限公司合成。
以下实施例所用的连续离子交换系统是由6-60根离子交换柱串联的连续操作的离子交换系统，通过组合式阀门将离子交换过程中的吸附、洗杂、洗脱和再生四个工段之间按顺序切换，将吸附段离子交换柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附段送入洗杂段进行洗杂，洗杂结束后立刻移出洗杂段进入洗脱段进行洗脱，洗脱完成后立刻移出洗脱段送入再生段进行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个工段的第1根离子交换柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根离子交换柱处于吸附阶段。例如，采用吸附区为4根、洗杂区为4根、洗脱区为6根，再生区为4根的工艺形式。图1、2表示了这种工艺形式的连续离子交换系统的运行过程，其中分别标注了吸附区，洗杂区，洗脱区，再生区，在图1中，吸附区的离子交换柱中的第四根离子交换柱能保护整个离子交换柱的吸附区不会被上柱液穿透而造成损失，当吸附区的第一根离子交换柱即柱4吸附饱和后就会被移出吸附区，进入洗杂区进行洗杂，成为洗杂区的最后一根柱 (即图2的状态)，而洗杂区的第一根离子交换柱8此时在洗杂流速的控制下刚好洗杂完成，进入洗脱区，成为洗脱区的最后一根柱(即图2的状态)并且通过控制洗脱流速使得洗脱区的第一根柱14也洗脱结束，移入再生区的最后一根进行树脂再生(即图2的状态)，再生段的第一根即柱18也再生完毕，移入吸附区的最后一根进行吸附(即图2的状态)。这样通过控制各区的流速和阀门的切换，可以实现四个区保持同样的节奏进行工作。各区的流速受各工段条件的影响，原则上是保证各工段同步运行，本领域普通技术人员可根据树脂的状态调整流动相的流速。通过控制各区流速及各区离子交换柱的根数来确定进出口切换时间，最终使整个系统各个区达到同步切换。
以下实施例唾液酸发酵液的制备方法如下
培养大肠杆菌的发酵培养基为普通的LB培养基(基于培养基的重量百分比计，胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，PH值为7. 5，同时有必要的话可以添加0. lg/L 的青霉素)。培养方法E. coli K12来自于美国菌种保藏中心(简称ATCC-2M04，将其作为初始菌种构建重组的质粒，这些大肠杆菌菌种在37°C下培养)然后对通过对含有sir (表达异构酶)的重组大肠杆菌和含有NanA (表达醛缩酶)的重组大肠杆菌的分别进行高密度培养，获得两种高表达的大肠杆菌菌体，37°C下，以44. 24g/L N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)和过量的2. 2M的丙酮酸钠作为底物和碳源，加入获得的两种重组大肠杆菌混合培养3 催化合成唾液酸。上述反应中唾液酸的产量为21. 2g/L。
实施例1
将发酵液经过过滤后再经截留分子量为1万道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质， 将清液稀释至唾液酸浓度为5g/L左右，泵入装入阴离子交换树脂的连续离子交换系统中。 采用由12根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为3根，洗杂区为3根，洗脱区为4根，再生区为2根。其中每个区都可以采用串联方式，以此来提高目标产物流出液的浓度。每根离子交换柱装填IOOg树脂。吸附流速为3ml/min，吸附容量为0. 341g/g湿树脂； 洗杂液为去离子水，流速为;3ml/min，洗杂到流出液无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0. lmol/L的氯化钠溶液，洗脱流速为-l/min， 洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；同时将向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗至中性。唾液酸的洗脱液用10g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的体积为洗脱液的1倍， 浸取后用0. 2倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为96%的唾液酸，收率为97. 2%。其中树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠216ml，相对于单柱节约了 40%的再生液，同时洗脱用去0. IN氯化钠210ml，相对于单柱节约了 30%的洗脱液。洗脱产率为0. 055g (唾液酸)/ g (树脂的量)*min，相对于单柱洗脱产率提高了 1. 375倍，洗脱出来的唾液酸的浓度为原溶液的4倍。
实施例2
将发酵液经过过滤后再经截留分子量为3万道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质， 将清液稀释至唾液酸浓度为10g/L左右，泵入装入阴离子交换树脂的连续离子交换系统中。采用由14根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为4根，洗杂区为3根，洗脱区为4根，再生区为3根。其中每个区都可以采用串联的方式，以此来提高目标产物流出液的浓度。每根离子交换柱装填400g树脂。吸附流速为15ml/min，吸附容量为0. M4g/g湿树脂；洗杂液为去离子水，洗杂流速为25ml/min，洗杂到流出液无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0. 5mol/L的氯化钠溶液，洗脱流速为15ml/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；同时将向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗至中性。唾液酸的洗脱液用15g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的体积为洗脱液的1. 2倍，浸取后用0. 5倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为97. 5%的唾液酸， 收率为98. 1%。其中树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠208ml，相对于单柱节约了 42%的再生液，同时洗脱用去0. IN氯化钠200ml，相对于单柱节约了 34%的洗脱液。洗脱产率为 0. 075g (唾液酸)/g (树脂的量)*min，相对于单柱洗脱产率提高了 1. 875倍，洗脱出来的唾液酸的浓度为原溶液的5倍。
实施例3
将发酵液经过过滤后再经截留分子量为4万道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质， 将清液稀释至唾液酸浓度为15g/L左右，泵入装入阴离子交换树脂的连续离子交换系统中。采用由14根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为4根，洗杂区为3根，洗脱区为4根，再生区为3根。其中每个区都可以采用串联的方式，以此来提高目标产物流出液的浓度。每根离子交换柱装填1. 2Kg树脂。吸附流速为60ml/min，吸附容量为0. 244g/ g湿树脂；洗杂液去离子水，洗杂流速为50ml/min，洗杂到流出液无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0. 8mol/L的氯化钠溶液，洗脱流速为60ml/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；同时将向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗至中性。唾液酸的洗脱液用20g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的体积为洗脱液的1. 5倍，浸取后用0. 8倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为98%的唾液酸，收率为98. 1%。其中树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠200ml，相对于单柱节约了 44%的再生液，同时洗脱用去0. IN氯化钠19^11，相对于单柱节约了 36%的洗脱液。洗脱产率为 0. 085g (唾液酸)/g (树脂的量)*min，相对于单柱洗脱产率提高了 2. 125倍，洗脱出来的唾液酸的浓度为原溶液的6倍。
实施例4
将发酵液经过过滤后再经截留分子量为6万道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质， 将清液稀释至唾液酸浓度为20g/L左右，泵入装入阴离子交换树脂的连续离子交换系统中。采用由16根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为4根，洗杂区为4根，洗脱区为4根，再生区为4根。其中每个区都可以采用串联的方式，以此来提高目标产物流出液的浓度。每根离子交换柱装填4Kg树脂。吸附流速为200ml/min，吸附容量为0.308g/ g湿树脂；洗杂液为去离子水，洗杂流速为160ml/min，洗杂到无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0. 5mol/L的氯化钠溶液，洗脱流速为200ml/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；同时将向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗至中性。唾液酸的洗脱液用30g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的体积为洗脱液的1.8倍，浸取后用1倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为99.4%的唾液酸，收率为98. 8%。其中树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠IMml，相对于单柱节约了 46%的再生液，同时洗脱用去0. IN氯化钠185ml，相对于单柱节约了 38. 5%的洗脱液。洗脱产率为 0. 105g (唾液酸)/g (树脂的量)*min，相对于单柱洗脱产率提高了 2. 265倍，洗脱出来的唾液酸的浓度为原溶液的8倍。
实施例5
将发酵液经过过滤后再经截留分子量为8万道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质， 将清液稀释至唾液酸浓度为10g/L左右，泵入装入阴离子交换树脂的连续离子交换系统中。采用由18根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为4根，洗杂区为4根，洗脱区为6根，再生区为4根。其中每个区都可以采用串联的方式，以此来提高目标产物流出液的浓度。每根离子交换柱装填8Kg树脂。吸附流速为400ml/min，吸附容量为0. 328g/g湿树脂，洗杂液为去离子水，洗杂流速为320ml/min ；洗杂到流出液无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0. 8mol/L氯化钠的溶液，洗脱流速为400ml/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；同时将向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为1.5mol/L的氢氧化钠溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗至中性。唾液酸的洗脱液用40g/L乙醇水溶液，其中乙醇水溶液的体积为洗脱液的2倍，浸取后用0. 8倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为99. 5%的唾液酸， 收率为99. 1%。其中树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠180ml，相对于单柱节约了 50%的再生液，同时洗脱用去0. IN氯化钠180ml，相对于单柱节约了 40%的洗脱液。洗脱产率为 0. 125g (唾液酸)/g (树脂的量)*min，相对于单柱洗脱产率提高了 3. 125倍，洗脱出来的唾液酸的浓度为原溶液的10倍。
对比例1
与实施例5对比，进行单柱固定床吸附，洗杂和洗脱实验，树脂的填充量100g。唾液酸的发酵液上柱浓度5g/L，吸附流速为3mL/min，吸附容量为0. ^9g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为去离子水，流速为3ml/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂无杂质流出)；洗脱液为0. lmol/L氯化钠溶液，洗脱流速为％il/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱无唾液酸流出)；最后泵入浓度为1. Omol/L的氢氧化钠溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。唾液酸的洗脱液用10g/L无水乙醇浸取后用0. 2倍体积乙酸乙酯溶析结晶，得到纯度为98. 6%的唾液酸，收率为97. 9%。而且实施例5树脂再生用去1. Omol/L的氢氧化钠200ml，对比例用去360ml，同时实施例5中洗脱用去0. IN氯化钠 180ml，对比例中用去300ml。此时单柱的洗脱产率为0. 04g(唾液酸)/g (树脂的量)*min。
权利要求
1.一种连续分离唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠为底物通过微生物发酵制得，其特征在于，将发酵液通过过滤、超滤处理后得唾液酸清液，泵入装有OH—型阴离子交换树脂的连续离子交换系统中进行吸附，去离子水进行洗杂，氯化钠溶液进行洗脱，氢氧化钠溶液进行树脂再生，收集含有唾液酸的洗脱液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析结晶，晶体减压干燥后即得唾液酸纯品。
2.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的唾液酸清液中， 唾液酸的浓度为1 20g/L。
3.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的超滤处理去除大部分蛋白质，采用截留分子量为1万 8万道尔顿。
4.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架，以季胺基为功能基团。
5.根据权利要求1或4所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂粒度为0. 315-1. 25mm，湿视密度为0. 66-0. 75g/ml，含水量为42-48 %。
6.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的连续离子交换系统是由6-60根离子交换柱串联的连续操作的离子交换系统，通过组合式阀门将离子交换过程中的吸附、洗杂、洗脱和再生四个工段之间按顺序切换，将吸附段离子交换柱在树脂吸附饱和后立刻移出吸附段送入洗杂段进行洗杂，洗杂结束后立刻移出洗杂段进入洗脱段进行洗脱，洗脱完成后立刻移出洗脱段送入再生段进行再生，再生清洗完成后立刻移出再生段送入吸附段再进行吸附，如此循环的操作过程，且每个工段的第1根离子交换柱的状态切换同步进行，并保证至少有一根离子交换柱处于吸附阶段。
7.根据权利要求6所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的连续离子交换系统中，吸附段、洗杂段、洗脱段和再生段的阴离子交换柱各自为1-20根。
8.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的氯化钠溶液浓度为0. 001-2M ；所述的氢氧化钠溶液浓度为0. 001-2M。
9.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液浓度为5-40g/L，乙醇水溶液的加入量为洗脱液体积的1-2倍。
10.根据权利要求1所述的连续分离唾液酸的方法，其特征在于，乙酸乙酯加入量为乙醇水溶液与洗脱液混合体积的0.1-1倍。
全文摘要
本发明公开了一种连续分离唾液酸的方法，所述的唾液酸是以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠为底物通过微生物发酵制得，将发酵液通过过滤、超滤处理后得唾液酸清液，泵入装有OH-型阴离子交换树脂的连续离子交换系统中进行吸附，去离子水进行洗杂，氯化钠溶液进行洗脱，氢氧化钠溶液进行树脂再生，收集含有唾液酸的洗脱液用乙醇水溶液浸取后再加入乙酸乙酯溶析结晶，晶体减压干燥后即得唾液酸纯品。本发明的分离纯化方法简便易行，效果好，不仅运行成本低廉，而且可以根据分离量的多少，实现从公斤级到吨级的分离，通过本发明所得产品在收率和产品质量方面都获得了极好的结果，保证了产品品质。
文档编号C07H7/033GK102532208SQ20121000265
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者吴菁岚, 应汉杰, 柏建新, 王裴, 胡亚南, 谢婧婧, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学