一种离子交换色谱分离乳源α_s-酪蛋白的方法

专利名称：一种离子交换色谱分离乳源α_s-酪蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及组分分离技术，具体涉及一种离子交换色谱分离乳源a s-酪蛋白的方法。
背景技术：
乳制品因其乳蛋白含量丰富，营养价值高，容易被人体消化吸收而被公认为是对人身体和智力发育有良好的作用的健康食品，乳中最有价值的成分也就是乳蛋白，主要包含酪蛋白和乳清蛋白，还有少量脂肪球蛋白，其中酪蛋白含量约占乳蛋白的80% 82%。是由多种蛋白质组成的混合物，酪蛋白(casein，CN)又称为干酪素，由四种组分组成，包括a s-酪蛋白、酪蛋白和K-酪蛋白，a s-酪蛋白又分为a sl-酪蛋白和as2_酪蛋白，约占酪蛋白总量的48%，是乳源酪蛋白生物活性肽的主要来源。 a s-酪蛋白可作为食品添加剂，应用于食品的生产，改善食品的风味；a s-酪蛋白是含磷蛋白复合体，经水解可产生酪蛋白磷酸肽(CPP)，促进人体钙吸收，因此a s-酪蛋白可作为酪蛋白磷酸肽制备的最优原料；此外a s-酪蛋白水解可产生抗菌肽、免疫肽、阿片肽、抗高血压肽以及促进矿物组织吸收，促进免疫，激素调节，抗病毒，降血脂等生物活性肽，且一些生物活性肽已经运用于工业化生产。现今的a s-酪蛋白分离技术大致可分为三种化学分级沉淀法，色谱法和钙低温系统分离法。虽然化学分级沉淀法和钙低温系统分离法较为常用，但其分离的条件要求严格(如钙低温系统分离法对温度的依赖高)，且分离出的a s_酪蛋白常常混有酪蛋白的其他组分，在酪蛋白生物活性肽的研究应用中受到较多的限制，如陆晓民的发明专利(专利申请号200510096244. 5)名称为一种酪蛋白组分分离方法及应用和张列兵等人的发明专利(专利申请号201010144728. 3)名称为一种a s-酪蛋白的分离方法，分离出的a s-酪蛋白纯度最高为97.8%。而色谱法有分辨率高，操作简易，重复性好，成本低等优点在蛋白质纯化过程中广泛应用。离子交换色谱(Ion exchange chromatography, IEC),也叫离子交换层析,是利用离子交换介质对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术，其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间的吸引力的作用。离子交换色谱的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的，可分为三部分高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应，根据其交换的离子基团种类不同又分为阳离子交换剂(与带正电的基团交换)和阴离子交换剂(与带负电的基团交换)。流动相是具有一定PH值和一定离子强度的电解质溶液。蛋白质在不同pH值缓冲液中，可带有游离的氨基或羧基可与离子交换剂的基团进行交换吸附。用缓冲液进行洗脱，当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质基团相竞争时，亲和力小的蛋白质分子先被解吸而被洗脱下来，而亲和力大的后被解吸下来。

发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种Cis-酪蛋白离子交换色谱分离法。本方法以酪蛋白素为原料，用离子交换色谱法，经不连续梯度洗脱，寻找能洗脱出蛋白的离子强度所含有的盐的浓度，将a s-酪蛋白与酪蛋白其他组分分离，得到高纯度的a s-酪蛋白。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
酪蛋白为酸性蛋白质，在pH>pI时带负电荷，可选择阴离子交换剂进行分离，而酪蛋白不同组分所带电荷不同，与离子交换剂结合程度不同，因此改变洗脱液的离子强度可使不同组分分离开来。本发明所用的离子交换介质DEAE-Sepharose CL-6B,经其分离得到的a s-酪蛋白纯度可为100%。本方法以购买得到的酪蛋白全素为原料。离子交换色谱分离a s-酪蛋白组分的分离方法包括以下步骤
(I)取标准酪蛋白全素用样品缓冲液A液配制浓度为4mg/ml的标准液，冰箱4°C放置12h, 0. 45um滤膜过滤后备用。(2)取色谱柱用20%乙酸浸泡处理24h后清洗备用，取DEAE-S印harose CL-6B用样品缓冲液A液浸泡，装柱，高约30cm，用样品缓冲液A液平衡。(3)上样，样品溶液约10ml，继续用样品缓冲液A液洗脱出未结合的蛋白，待未结合的蛋白完全洗脱出后改用样品缓冲液B液进行不连续梯度洗脱，流速2mL/min，检测波长为280nm紫外可见光，收集每个梯度洗脱出来的峰进行检测。(4)收集的每个峰的洗脱液，SDS-PAGE电泳检测，分离胶为12%，浓缩胶为5%。(5)将收集的每一个峰的蛋白溶液透析后经0. 45 ii m过滤后进行反向高效液相色谱(RP-HPLC)检测。色谱柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 y m, 250_X4. 6mm i. d ;流动相A :0. 1% TFA水溶液；流动相B :100%乙腈溶液；梯度条件:0 40min，32% 49%流动相B ；操作条件流速为I. Oml/min ;检测波长为214nm ;进样体积为70 y I。(6)上述技术方案中样品缓冲液A液为含3M尿素，0. 1%0_巯基乙醇，pH值为8.0的50mM的tris-HCl缓冲液。样品缓冲液B液为含不同浓度NaCl的样品缓冲液A液。(7)步骤(3)中动态吸附量约为9. 2mg/ml，上样量约为40mg。本发明方法可用于不同乳源酪蛋白的分离，若原料为乳蛋白，需通过等电点沉淀法(Pl约为4. 6)除去乳清蛋白，得到酪蛋白。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本方法有操作简单，分辨率高，重复性好，得到的蛋白纯度高、回收率高，离子交换剂可重复利用等优点。在2h内可获得纯度为100%的a s-酪蛋白。分离得到的a s-酪蛋白课进行乳源活性肽的制备和深加工，使获得的目的活性肽比例大大提高，经扩大还可用于工业需要。本发明制得的酪蛋白可作为酪蛋白源生物活性肽研究的原料，为功能酪蛋白源活性肽的研究奠定基础。


图I为本发明处理流程示意 图2为实施例I步骤(I)中的离子交换色谱图，其中I为步骤(3)层析峰，II为步骤(4)层析峰，III为步骤(5)层析峰；
图3为实施例I的电泳检测结果，其中，I a s-酪蛋白标准品，2 : P -酪蛋白标准品，3 K -酪蛋白标准品，4 :步骤(3)收集的蛋白，5 :步骤(4)收集的蛋白，6 :步骤(5)收集的蛋白；
图4为实施例I a s-酪蛋白标准品的高效液相色谱 图5为实施例I P-酪蛋白标准品的高效液相色谱 图6为实施例I K-酪蛋白标准品的高效液相色谱图； 图7为实施例I空白溶液的高效液相色谱 图8为实施例I步骤(3)收集的蛋白的高效液相色谱 图9为实施例I步骤(4)收集的蛋白的高效液相色谱 图10为实施例I步骤(5)收集的蛋白的高效液相色谱图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I
(I)取标准酪蛋白全素用样品缓冲液A液(含3M尿素，0. 1%^-巯基乙醇，pH值为8. 0的50mM的tris-HCl缓冲液)配制浓度为4mg/ml的标准液，冰箱4°C放置12h，0. 45 u m滤膜过滤后备用。(2)取色谱柱用20%乙酸浸泡处理24h后清洗备用，取DEAE-S印harose CL-6B用样品缓冲液A液浸泡，装柱，高约30cm，用样品缓冲液A液平衡后上样标准蛋白样品溶液IOml(上样量为40mg)，继续用样品缓冲液A液洗脱出未结合的蛋白。(3)待未结合的蛋白完全洗脱出后改用含0. lmol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，检测波长为280nm紫外可见光，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测。(4)待此梯度下蛋白完全洗脱出后，按照步骤(3)改用含0.2mol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测。(5)按照步骤(4)改用含0. 3mol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测(具体流程图见图1，层析的色谱图见图2)。(6)将收集的蛋白进行电泳检测，分离胶为12%，浓缩胶为5% (见图3)。(7)将收集的每一个峰的蛋白溶液透析后经0. 45 ii m进行反向高效液相色谱检测。色谱柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 u m, 250_X4. 6mm i. d ;流动相 A :0. 1% TFA水溶液；流动相B :100%乙腈溶液；梯度条件(T40min，32%^49%流动相B ;操作条件流速为I. Oml/min ;检测波长为214nm紫外可见光；进样体积为70 yl。其分离得到的a s-酪蛋白纯度为100% (见图4)。实施例2
(I)取新鲜市售水牛奶，4000r/min离心30min,收集下层脱脂乳，lmol/L HCl调pH至4. 6,4000r/min离心15min。沉淀用蒸懼水洗漆2次,丙酮洗漆2-3次,每次4000r/min离心IOmin,最后将沉淀自然风干，_ 20 C冰箱中保存备用。
(2)取水牛奶酪蛋白用样品缓冲液A液(含3M尿素，0. 1%3 -巯基乙醇，pH值为8. 0的50mM的tris-HCl缓冲液)配制浓度为4mg/ml的标准液，冰箱4°C放置12h，0. 45 u m滤膜过滤后备用。(3)取色谱柱用20%乙酸浸泡处理24h后清洗备用，取DEAE-S印harose CL-6B用样品缓冲液A液浸泡，装柱，高约30cm，用样品缓冲液A液平衡后上样标准蛋白样品溶液IOml(上样量为40mg)，继续用样品缓冲液A液洗脱出未结合的蛋白，
(4)待未结合的蛋白完全洗脱出后改用含0. lmol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，检测波长为280nm紫外可见光，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测。(5)待此梯度下蛋白完全洗脱出后，按照步骤(4)改用含0.2mol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测。 (6)按照步骤(5)改用含0. 3mol/L浓度NaCl的样品缓冲液A液进行梯度洗脱，收集此梯度洗脱出来的峰进行检测。(7)将收集的蛋白进行电泳检测，分离胶为12%，浓缩胶为5%。 (8)将收集的每一个峰的蛋白溶液透析后经0. 45 ii m进行反向高效液相色谱检测。色谱柱Jupiter 300 C18 反相蛋白柱,5 u m, 250_X 4. 6mm i. d ;流动相 A :0. 1% TFA水溶液；流动相B :100%乙腈溶液；梯度条件(T40min，32%^49%流动相B ;操作条件流速为
I.Oml/min ;检测波长为214nm ;进样体积为70 yl。其分离得到的a s-酪蛋白纯度为100%。
权利要求
1.一种离子交换色谱分离乳源a s-酪蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)以标准酪蛋白全素为原料，用样品缓冲液A配制浓度为4mg/ml的标准液，冰箱4°C放置12h, 0. 45 u m滤膜过滤后备用； (2)取色谱柱，用20%乙酸浸泡24h后清洗备用；再取DEAE-S印haroseCL-6B，用样品缓冲液A浸泡，装柱，高度为30cm，再用样品缓冲液A平衡； (3)上样，样品溶液为10ml，继续用样品缓冲液A洗脱出未结合的蛋白，待未结合的蛋白完全洗脱出后改用样品缓冲液B进行不连续梯度洗脱，硫酸为2ml/min，收集每个梯度洗脱出来的峰进行检测，检测波长为280nm紫外可见光； (4)收集每个峰的洗脱液，SDS-PAGE电泳检测，分离胶为12%，浓缩胶为5%； (5)将收集的每个峰的蛋白溶液透析后，经0.45 过滤，然后进行反向高效液相色谱，其中，动相为0. 1%TFA水溶液，流动相为100%乙腈溶液；梯度条件为32 49%流动相，OlOmin ;操作条件是流速为I. Oml/min,检测波长为214nm,进样体积为70ii I ; 其中，样品缓冲液A为含3M尿素、0. 1% P -巯基乙醇、pH值为8. 0的50mM的tris_HCl缓冲液；样品缓冲液B为含不同浓度NaCl的样品缓冲液A。
2.根据权利要求I所述离子交换色谱分离乳源Cis-酪蛋白的方法，其特征在于步骤(3)中的动态吸附量为9. 2mg/ml，上样量为40mg。
3.根据权利要求I所述离子交换色谱分离乳源Cis-酪蛋白的方法，其特征在于当原料为乳蛋白时，需通过等电点沉淀法(Pl为4. 6)除去乳蛋白中的乳清蛋白，然后得到酪蛋白，然后再进行后续处理步骤。
全文摘要
本发明公开了一种离子交换色谱分离乳源αs-酪蛋白的方法。本发明所述方法具有产品纯度高、操作简易、重复性好、分辨率高、成本低等优点，是酪蛋白纯化分离的重要手段和方法。经离子交换色谱分离的αs-酪蛋白可用于酪蛋白源生物活性肽的生产。
文档编号C07K1/18GK102746394SQ20121000180
公开日2012年10月24日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者向明霞, 徐明芳, 成希飞, 李子超, 王丽娜 申请人:暨南大学