用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料,其制备方法,其填充的色谱柱及纯化方法

用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料,其制备方法,其填充的色谱柱及纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，所述阴离子交换色谱填料的基质为交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯的多孔球形颗粒，其粒径范围包含在30-150μm的范围中，平均粒径为50-80μm，孔径范围包含在30-180nm的范围中。其填充而成的色谱柱动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用，能适应高效生产的要求。本发明还提供了制备上述阴离子交换色谱填料的方法、由其填充的阴离子交换色谱柱和使用该阴离子交换色谱柱纯化低分子肝素的方法。
【专利说明】用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，其制备方法， 其填充的色谱柱及纯化方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种阴离子交换色谱填料，其制备方法，其填充而成的阴离子交换色 谱柱及使用该阴离子交换色谱柱进行纯化的方法，尤其适用于纯化低分子肝素。

【背景技术】
[0002] 肝素是一种硫酸氨基葡聚糖，属酸性黏多糖类物质。作为一种抗凝剂，肝素在体内 外都有抗凝血作用。临床上应用的肝素制剂分为普通的未分段肝素和低分子肝素两大类， 其中低分子肝素（LowMolecularWeightHeparin，LMWH)的平均分子量小于5000Da。和普 通肝素相比，低分子肝素同样具有抗血栓作用，而出血的危险较低。低分子肝素还具有半衰 期长、量效关系明确、生物利用度高等优点，正广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗， 其有效性和安全性均优于普通肝素。
[0003] 肝素通常是从猪或牛的肺、肠黏膜中提取而来，低分子肝素是由普通肝素解聚制 备而成的。为了在去除杂质的同时尽可能保留肝素的活性，色谱纯化是低分子肝素生产过 程中最重要的步骤之一。低分子肝素带有负电荷，所以可采用阴离子交换色谱法进行纯化。 但是用目前纯化用的阴离子交换色谱填料填充成色谱柱后，色谱柱的动态吸附容量较低， 且耐压性能不佳，只能在较低流速下使用，不能适应高效生产的要求。因此，目前的低分子 肝素的纯化效率较低。


【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，其填充而成的 色谱柱动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用。
[0005] 本发明的另一个目的是提供制备阴离子交换色谱填料的方法，其制备出的阴离子交 换色谱填料填充而成的色谱柱动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用。
[0006] 本发明的又一个目的是提供用于纯化的低分子肝素的阴离子交换色谱柱，其动态 吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用。
[0007] 本发明的还一个目的是提供纯化低分子肝素的方法，其纯化效率较高。
[0008] 本发明提供了用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，阴离子交换色谱填料 的基质为交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯的多孔球形颗粒；阴离子交 换色谱填料的粒径范围包含在30-150μm的范围中，平均粒径为50-80μm，孔径范围包含 在30-180nm的范围中。
[0009] 在阴离子交换色谱填料的一种示意性实施方式中，阴离子交换色谱填料的表面电 荷密度为350-2350μmol/g，比表面积为33-95平方米/g，孔隙率为25-86%。
[0010] 本发明还提供了制备上述阴离子交换色谱填料的方法，包括：用悬浮聚合法制备 聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球，对微球进行洗涤及筛分，再 使用胺类亲核试剂在筛分后得到的微球表面键合阴离子交换基团；其中悬浮聚合法的步骤 为：a、在反应釜中加入分散稳定剂、静电保护剂和水，密闭反应釜，搅拌反应釜中的物料同 时升高釜内温度至60-85°C，直至分散稳定剂和静电保护剂充分溶解后停止搅拌，得到水 相；b、取甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA)、甲基丙烯酸乙二醇双酯（EDMA)、致孔剂和引发剂并将 其混合，得到混合物料，将混合物料超声的同时搅拌，至引发剂完全溶解，得到有机相；c、 将水相升温至30°C，加入有机相并在30°C下搅拌直至形成均匀油状乳液体系，得到混合乳 液；和d、将混合乳液加热至75-80°C引发聚合反应，聚合反应的时长为6-30小时，得到聚甲 基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球。
[0011] 在制备阴离子交换色谱填料的方法的一种示意性实施方式中，分散稳定剂是聚乙 烯醇，分散稳定剂与水相的质量体积比为〇. 03-1%，优选为0. 25%-0. 5% ;静电保护剂是氯化 钠，静电保护剂与水相的质量体积比为1-16. 7%，优选为3-5%。
[0012] 在制备阴离子交换色谱填料的方法的一种示意性实施方式中，有机相中致孔剂的体 积分数为20-71% ;致孔剂由良溶剂和/或不良溶剂组成，良溶剂选自甲苯、异丙苯和二甲苯中的 一种或其任意组合;不良溶剂选自异戊醇、正辛醇、异辛醇和正十二醇中的一种或其任意组合。
[0013] 在制备阴离子交换色谱填料的方法的一种示意性实施方式中，引发剂为过氧化苯 甲酰或2, 2'-偶氮二异戊腈，引发剂的用量与甲基丙烯酸环氧丙酯和甲基丙烯酸乙二醇双 酯两者用量和的质量体积比为〇. 4-3%，优选为0. 75-1. 5%。
[0014] 在制备阴离子交换色谱填料的方法的一种示意性实施方式中，胺类亲核试剂为二 乙胺、三乙烯四胺、五乙烯六胺、五乙烯六胺或Ν，Ν'-二乙基乙二胺。
[0015] 在制备阴离子交换色谱填料的方法的一种示意性实施方式中，表面键合的反应温 度为0-50°C，反应时长为1-10小时。
[0016] 本发明又提供了用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱柱，使用上述阴离子交换 色谱填料填充而成。
[0017] 本发明还提供了纯化低分子肝素的方法，将待纯化的低分子肝素样品通过上述阴 离子交换色谱柱进行纯化。
[0018] 本发明提供的一种用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，其填充而成的色 谱柱动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用，能适应高效生产的要求。
[0019] 本发明提供的制备上述阴离子交换色谱填料的方法，首先采用悬浮聚合法制备出 窄粒径分布PGM-EDM基质微球，通过控制剪切速度和优化的分散条件保证窄粒径分布。 通过洗涤去除试剂残留，并筛分得到色谱分离所需要粒径范围的中间体微球，使具有阴离 子交换功能的交换剂与微球表面的环氧基发生反应，键合出对低分子肝素具有良好分离性 能的专用阴离子交换色谱填料。该方法其制备出的阴离子交换色谱填料填充而成的色谱柱 动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用，能适应高效生产的要求。
[0020] 本发明提供的一种用于纯化的低分子肝素的阴离子交换色谱柱，上述阴离子交换 色谱填料填充而成，其动态吸附容量较高；且耐压性能较好，适于较高流速下使用，能适应 高效生产的要求。
[0021] 本发明提供的一种纯化低分子肝素的方法，将待纯化的低分子肝素样品通过上述 阴离子交换色谱柱进行纯化，其纯化效率较高。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例二十二的流速-压力曲线。

【具体实施方式】
[0023] 为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明 本发明的【具体实施方式】。
[0024] 实施例一：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0025] 操作步骤。
[0026] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa)lg，氯化钠360g，然后加入 3000mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至60°C，持续搅拌5小时 后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入20mL甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA)、80mL甲基丙烯酸乙二醇双酯 (EDM)、30mL异丙苯、70mL正十二醇和Ig过氧化苯甲酰并将其混合得到混合物料；将混合 物料超声的同时搅拌至过氧化苯甲酰完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速360rmp，维持 〇. 5小时，形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至80°C引发聚合反应，聚合反应的时长为16小时，即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0027] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGM-EDM微球。
[0028] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGMA-EDMA微球，完成筛分。
[0029] 4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应釜中，加入洗涤筛分 后得到的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在(TC，搅拌使微球充分分散。 加入二乙胺45mL，在转速250rpm搅拌条件下反应1小时。用去离子水洗漆微球至中性，抽滤 滤干后，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色谱填料保存于20%乙醇水溶液中。
[0030]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为30-80μm，平均粒径为55μm，粒径标准偏差为25μm。观察其表面和内部的孔结构，以 压汞法测得孔径范围为40-100nm，其中40-70nm占总孔体积的60%，70-100nm占总孔体积 的40% ;比表面积为74平方米/g;孔隙率为53%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为430ymol/g。
[0031] 实施例二：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0032] 操作步骤。
[0033] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa)3g，氯化钠450g，然后加入 2700mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至65°C，持续搅拌4小时 后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMA50mL、EDMA50mL、甲苯50mL、异辛醇58mL和2, 2' -偶氮二异戊 腈2g并将其混合得到混合物料；将混合物料超声的同时搅拌至2, 2' -偶氮二异戊腈完全 溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 1小时，形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、将混合乳液加热至80°C引发聚合反应，聚合反应的时长为22小时；即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0034] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGMA-EDMA微球。
[0035] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGMA-EDMA微球，完成筛分。
[0036] 4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入洗涤筛分 后得到的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在KTC，搅拌使微球充分分 散。加入二乙胺90mL和0. 5gNa0H。在转速250rpm下反应2小时。去离子水洗涤-抽滤 数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色谱填料保存于20% 乙醇水溶液中。
[0037]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为30-90μm，平均粒径为60μm，粒径标准偏差为30μm。观察其表面和内部的孔结构， 以压汞法测得孔径范围为30-80nm，其中30-60nm占总孔体积的60%，60-80nm占总孔体积 的40%;比表面积为80平方米/g;孔隙率为60%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为480ymol/g。
[0038] 实施例三：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0039] 操作步骤。
[0040] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa)5g，氯化钠300g，然后加入 2000mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至70°C，持续搅拌3小时 后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMA225mL、EDMA75mL、甲苯IOOmL和过氧化苯甲酰9g并将其混合得到 混合物料；将混合物料超声的同时搅拌至过氧化苯甲酰完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 1. 5小时，形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至78°C引发聚合反应，聚合反应的时长为15小时，即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0041] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGM-EDM微球。
[0042] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGM-EDM微球，完成筛分。
[0043] 4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入洗涤筛分 后得到的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在20°C，搅拌使微球充分分 散。加入二乙胺135mL，和0. 2gNa0H。在转速250rpm下反应3小时。去离子水洗涤-抽滤 数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色谱填料保存于20% 乙醇水溶液中。
[0044]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为40-120μm，平均粒径为80μm，粒径标准偏差为40μm。观察其表面和内部的孔结构， 以压汞法测得孔径范围为60-150nm，其中60-100nm占总孔体积的40%，100-150nm占总孔体 积的60%;比表面积为46平方米/g;孔隙率为38%。通过氮元素含量测定计算填料的表面 电荷密度为350μmol/g。
[0045] 实施例四：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0046] 操作步骤。
[0047] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa)8g，氯化钠200g，然后加入 2400mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至75°C，持续搅拌2. 5小 时后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMA128mL、EDMA192mL、正十二醇80mL和过氧化苯甲酰I. 5g并将其混 合得到混合物料；将混合物料超声的同时搅拌至过氧化苯甲酰完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 2小时，形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至78°C引发聚合反应，聚合反应的时长为18小时，即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0048] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGMA-EDMA微球。
[0049] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGM-EDM微球，完成筛分。
[0050] 4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入洗涤筛分 后得到PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在25°C，机械搅拌20分钟，使 微球充分分散。加入三乙烯四胺22. 5mL和IgNaOH。在转速250rpm下反应4小时。去离子 水洗涤-抽滤数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色谱 填料保存于20%乙醇水溶液中。
[0051]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为30-70μm，平均粒径为50μm，粒径标准偏差为20μm。观察其表面和内部的孔结构， 以压汞法测得孔径范围为30-80nm，其中30-50nm占总孔体积的50%，50-80nm占总孔体积 的50%;比表面积为33平方米/g;孔隙率为25%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为820mol/g。
[0052] 实施例五：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0053] 操作步骤。
[0054] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa) 10g，氯化钠100g，然后加入 2000mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至80°C，持续搅拌2小时 后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMAlOOmL、EDMlOOmU二甲苯IOOmL和过氧化苯甲酰I. 5g并将其混 合得到混合物料；将混合物料超声的同时搅拌至过氧化苯甲酰完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 2. 5小时，至形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至78°C引发聚合反应，聚合的时长为20小时，即得到聚甲基丙烯酸 环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0055] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGMA-EDMA微球。
[0056] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGMA-EDMA微球，完成筛分。
[0057]4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入上述洗涤 筛分后的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在30°C，机械搅拌20分钟， 使微球充分分散。加入五乙烯六胺15mL，和3gNaOH。在转速250rpm下反应6小时。去离 子水洗涤-抽滤数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色 谱填料保存于20%乙醇水溶液中。
[0058]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为30-115μm，平均粒径为75μm，粒径标准偏差为45μm。观察其表面和内部的孔结构， 以压汞法测得孔径范围为60-150nm，其中60-90nm占总孔体积的40%，90-150nm占总孔体积 的60% ;比表面积为40平方米/g;孔隙率为38%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为2260μmol/g。
[0059] 实施例六：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0060] 操作步骤。
[0061] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、 在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa) 15g，氯化钠80g，然后加入 2700mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至80°C，持续搅拌1. 5小 时后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMA54mL、EDMA36mL、异戊醇180mL和2, 2' -偶氮二异戊腈0. 36g并将其混 合得到混合物料;将混合物料超声同时搅拌至2, 2' -偶氮二异戊腈完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 3小时，形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至75°C引发聚合反应，聚合反应的时长为24小时，即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDMA微球)。
[0062] 2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGMA-EDMA微球。
[0063] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGMA-EDMA微球，完成筛分。
[0064] 4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入上述洗涤 筛分后的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在40°C，机械搅拌20分钟， 使微球充分分散。加入五乙烯六胺20mL，和4gNaOH。在转速250rpm下反应8小时。去离 子水洗涤-抽滤数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色 谱填料保存于20%乙醇水溶液中。
[0065]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为40-100μm，平均粒径为70μm，粒径标准偏差为30μm。观察其表面和内部的孔结构， 以压汞法测得孔径范围为60-180nm，其中60-90nm占总孔体积的70%，90-180nm占总孔体积 的30% ;比表面积为90平方米/g;孔隙率为78%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为2350μmol/g。
[0066] 实施例七：制备阴离子交换色谱填料的方法。
[0067] 操作步骤。
[0068] 1、交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基材微球的制备： a、在4L反应釜中加入聚乙烯醇(平均分子量：88-130KDa)28g，氯化钠28g，然后加入 2800mL水，密闭反应釜。搅拌反应釜中的物料同时升高釜内温度至85°C，持续搅拌1小时 后聚乙烯醇和氯化钠充分溶解，停止加热及搅拌，将釜内温度冷却至室温，得到水相； b、 在烧杯中加入GMA70mL、EDMA30mL、甲苯IOOmU异戊醇IOOmU正辛醇50mL和 2, 2' -偶氮二异戊腈I. 5g并将其混合得到混合物料；将混合物料超声的同时搅拌至 2, 2' -偶氮二异戊腈完全溶解，得到有机相； c、 将反应釜中的水相升温至30°C，加入有机相，在30°C下开启搅拌，转速350rpm，维持 4小时，至形成均匀油状乳液体系，得到混合乳液； d、 将混合乳液加热至75°C引发聚合反应，聚合反应的时长为30小时，即得到聚甲基丙 烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球（以下简称PGM-EDM微球)。
[0069]2、用异丙醇、乙醇和丙酮依次洗涤步骤1制得的PGMA-EDMA微球。
[0070] 3、使用425目振动筛除去粒径30μm以下的PGM-EDM微球，完成筛分。
[0071]4、PGMA-EDMA基质弱阴离子交换树脂的表面键合：在500mL反应荃，加入上述洗涤 筛分后的PGM-EDM微球45g和270mL去离子水，釜内温度保持在50°C，搅拌使微球充分分 散。加入N，N'_二乙基乙二胺67. 5mL，和2gNa0H。在转速250rpm下反应10小时。去离子 水洗涤-抽滤数次将微球洗至中性并滤干，得到阴离子交换色谱填料，将阴离子交换色谱 填料保存于20%乙醇水溶液中。
[0072]以扫描电子显微镜图像分析测得阴离子交换色谱填料为多孔球形颗粒，其粒径范 围为30-90μm，平均粒径为60μm，粒径标准差为30μm。观察其表面和内部的孔结构，以 压汞法测得孔径范围为30-100nm，其中30-60nm占总孔体积的40%，60-100nm占总孔体积 的60% ;比表面积为95平方米/g;孔隙率为86%。通过氮元素含量测定计算填料的表面电 荷密度为850ymol/g。
[0073]虽然实施例一至七中仅公开了分散稳定剂为聚乙烯醇，但分散稳定剂还可以包括 胶体稳定剂和/或粘度改性剂，胶体稳定剂包括蛋白质和/或天然多糖，其中蛋白质选自明 胶、大豆蛋白、水解大豆蛋白、小麦蛋白等中的一种或其任意组合；天然多糖选自羟乙基纤 维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂、淀粉和阿拉伯胶等中的 一种或其任意组合；粘度改性剂选自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚乙烯基己 内酰胺和苯乙烯-马来酸酐共聚物水解产物中的一种或其任意组合。优选的分散稳定剂选 自聚乙烯醇、A型明胶或聚丙烯酸中的一种或其任意组合。
[0074]虽然实施例一至七中仅公开了静电保护剂为氯化钠，但静电保护剂还可以选自氯 化钠、氯化钾、氯化钙、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素钠等中的一种或其任意组 合。更优选的静电保护剂选自氯化钠、氯化钙中的一种或其组合。
[0075]虽然实施例一至七中仅公开了致孔剂为异丙苯+正十二醇、甲苯+异辛醇、甲苯、 正十二醇、二甲苯、异戊醇或甲苯+异戊醇+正辛醇，但致孔剂还可以是良溶剂和不良溶剂 中的一种或其组合，良溶剂为氯代烃和/或芳香烃类化合物；不良溶剂为碳原子数为4-18 的醇；良溶剂优选自氯仿、1，1-二氯乙烷、1，2_二氯乙烷、三氯乙烷，甲苯、乙苯、异丙苯和 二甲苯中的一种或其任意组合；不良溶剂优选自正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇、 正庚醇、正辛醇、异辛醇、正壬醇、正癸醇、正十二醇、正十四醇、正十六醇和正十八醇中的一 种或其任意组合。
[0076]虽然实施例一至七中仅公开了引发剂为过氧化苯甲酰或2, 2' -偶氮二异戊腈，但 引发剂还可以为其他过氧化物或偶氮类引发剂；过氧化物优选为过氧化苯甲酰、过氧化月 桂酰、过氧化氢异丙苯、过氧化二乙酰、过氧化（双）3, 5, 5-三甲基己酰、过氧化苯甲酸叔丁 酯、过氧化邻苯二甲酸叔丁酯、过氧化甲乙酮、过氧化环己酮或过氧化二碳酸二异丙酯。
[0077] 实施例八：阴离子交换色谱柱。
[0078] 填料：使用实施例一制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0079] 层析柱的规格：内径I. 0cm，柱长25cm玻璃层析柱。
[0080] 装填前准备工作： 1、 准备设备包括HPLC泵(或蠕动泵)、压力表、层析柱和量筒(或储槽）； 2、 将填料在0. 4M的NaCl水溶液中制成匀浆液。对于装填一个给定的空柱，使用大约 I. 1倍柱体积的填料，〇. 4MNaCl水溶液的量约为填料的4倍。将填料和NaCl水溶液混合 搅拌均匀后倒入量筒(或储槽）中，静置过夜，去除部分上层清液使剩余部分中填料的体积 分数达到约30%，即得到含填料的匀浆液。
[0081] 装填步骤：将柱底板上的筛板用0. 4M的NaCl水溶液润湿，关闭柱出口并在柱底部 留出1?2cm深度的0. 4MNaCl水溶液。将填料匀浆液搅拌均匀，确保均一。将搅拌均匀 的匀浆液倒入层析柱中。用0.4MNaCl水溶液清洗层析柱的内壁。立即将柱头活塞放置在 匀浆液表面。打开层析柱出口，开启泵，将压力缓慢升至5bar。当柱床最终形成后，关闭泵， 关闭层析柱出口。将液体分配器加入到柱子中，离柱床约2?3cm。然后打开泵，打开层析 柱出口，进一步压缩柱床。当压缩完成，压力稳定时，停泵，关闭层析柱出口。松开柱头活塞 密封，将活塞降到柱床表面。层析柱装填完毕，即得到阴离子交换色谱柱。
[0082] 柱效评价方法：使用配备电导检测器的层析系统进行柱效评价。取柱装填完成 后得到的阴离子交换色谱柱，先用5?10个柱体积的0. 4MNaCl溶液平衡柱床，再进一个 0. 25?1%柱体积的2.OMNaCl溶液样品，采用电导检测器检测色谱峰，确定柱塔板数及不 对称因子。最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速l〇〇cm/h下，每米最小塔板数 为3510,不对称因子为1. 35。
[0083] 实施例九：阴离子交换色谱柱。
[0084] 填料：使用实施例二制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0085] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0086] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速lOOcm/h 下，每米最小塔板数为3270,不对称因子为1. 41。
[0087] 实施例十：阴离子交换色谱柱。
[0088] 填料：使用实施例三制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0089] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0090] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速l〇〇Cm/h 下，每米最小塔板数为3017,不对称因子为1. 38。
[0091] 实施例i^一：阴离子交换色谱柱。
[0092] 填料：使用实施例四制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0093] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0094] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速lOOcm/h 下，每米最小塔板数为3620,不对称因子为1. 29。
[0095] 实施例十二：阴离子交换色谱柱。
[0096] 填料：使用实施例五制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0097] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0098] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速lOOcm/h 下，每米最小塔板数为2886,不对称因子为1. 39。
[0099] 实施例十三：阴离子交换色谱柱。
[0100] 填料：使用实施例六制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0101] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0102] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速lOOcm/h 下，每米最小塔板数为2978,不对称因子为1. 35。
[0103] 实施例十四：阴离子交换色谱柱。
[0104] 填料：使用实施例七制备得到的阴离子交换色谱填料。
[0105] 层析柱的规格、装填前准备工作、装填步骤和柱效评价方法与实施例八所述相同。
[0106] 根据柱效评价方法，最终测得本实施例阴离子交换色谱柱在线性流速l〇〇Cm/h 下，每米最小塔板数为3489,不对称因子为1. 31。
[0107] 实施例十五：纯化低分子肝素的方法。
[0108] 纯化所使用的色谱柱选用实施例八的阴离子交换色谱柱。
[0109] 纯化前准备： 1、 缓冲液：配制20mM中性磷酸盐缓冲液作为起始缓冲液（K2HP04-KH2P04pH7. 0)，在起始 缓冲液中添加不同浓度（〇. 2M、0. 5M、0. 8M)的NaCl作为三个阶段的洗脱缓冲液； 2、 样品溶液准备：待纯化的低分肝素样品用纯水溶解，用NaCl及NaOH或HCl调节电导 率和pH值与起始缓冲液一致，得到样品溶液； 3、 色谱柱预处理：色谱柱先用0. 5M的NaOH和2M的NaCl混合液清洗2-3个柱体积，再 用起始缓冲液平衡稳定后备用； 4、 层析系统包含：泵、色谱柱、紫外检测器、电导检测器、pH检测器、色谱工作站。
[0110] 纯化步骤： 1、 平衡层析柱：用起始缓冲液冲洗柱至少5个柱体积，至柱后流出液pH、电导率与起始 缓冲液一致，紫外检测器波长于254nm下调零； 2、 上样：将样品溶液栗入柱中； 3、 冲洗：用起始缓冲液冲洗柱至少3个柱体积，至紫外响应值归零； 4、 洗脱：分别用不同NaCl浓度（0. 2M、0. 5M、0. 8M)的洗脱缓冲液依浓度从低到高次序 冲洗色谱柱2-3个柱体积，收集紫外吸收值增高的洗脱液； 5、 收集的洗脱液与3倍体积的95%乙醇混合，搅拌10分钟后静置过夜，虹吸去除上清液 后用一定量无水乙醇洗涤沉淀，真空干燥后得到纯化后的低分子肝素，测定其分子量分布。
[0111] 色谱柱再生方法：用NaOH和NaCl混合液(浓度均为1M)冲洗层析柱2-3个柱体 积，再用起始缓冲液平衡色谱柱至柱后流出液pH、电导率与起始缓冲液一致。
[0112] 实施例十六：纯化低分子肝素的方法。
[0113] 纯化所使用的色谱柱选用实施例九的阴离子交换色谱柱。
[0114] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0115] 实施例十七：纯化低分子肝素的方法。
[0116] 纯化所使用的色谱柱选用实施例十的阴离子交换色谱柱。
[0117] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0118] 实施例十八：纯化低分子肝素的方法。
[0119] 纯化所使用的色谱柱选用实施例十一的阴离子交换色谱柱。
[0120] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0121] 实施例十九：纯化低分子肝素的方法。
[0122] 纯化所使用的色谱柱选用实施例十二的阴离子交换色谱柱。
[0123] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0124] 实施例二十：纯化低分子肝素的方法。
[0125] 纯化所使用的色谱柱选用实施例十三的阴离子交换色谱柱。
[0126] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0127] 实施例二i^一 ：纯化低分子肝素的方法。
[0128] 纯化所使用的色谱柱选用实施例十四的阴离子交换色谱柱。
[0129] 纯化前准备、纯化步骤及色谱柱再生方法与实施例十五所述相同。
[0130] 实施例二十二：阴离子交换色谱柱的性能验证-柱压-流速试验。
[0131] 分别将市场上购得的日本智索的ChissoCellufineA800阴离子交换色谱填料 和实施例一至七的阴离子交换色谱填料，按照实施例八所述的填装前准备工作和填装步骤 装填于内径I. 〇cm，柱长25cm的玻璃层析柱中，得到阴离子交换色谱柱。以纯水作为流动 相，测定阴离子交换色谱柱的流速-压力曲线，检测结果见图1。如图1所示，在线性流速 500cm/h以下，使用实施例一至七制备的填料装填的阴离子交换色谱柱，流速-压力曲线均 呈线性。而使用CellufineA800填装的阴离子交换色谱柱当流速大于100cm/h后已为非 线性，说明此时柱床因压力导致压缩形变，从而引起了柱压迅速升高。在实际生产中，为了 避免柱床压缩现象，不得不采用较低的流速，导致效率难以提高。
[0132]因此，使用实施例一至七制备的填料装填的阴离子交换色谱柱，相较于Cellufine A800阴离子交换色谱柱具有更优异的耐压性能，能够在高流速下正常操作，从而提高纯化 效率。
[0133] 实施例二十三：阴离子交换色谱柱的性能验证-低分子肝素的动态吸附容量试 验。
[0134] 分别将实施例一至七的阴离子交换色谱填料，按照实施例八所述的填装前准备工 作和填装步骤装填于内径4. 6mm柱长5cm的不锈钢色谱柱中，得到阴离子交换色谱柱。以起 始缓冲液（20mM中性磷酸盐缓冲液）平衡后进样低分子肝素样品，其中线性流速lOOcm/h， 样品浓度10mg/mL，监测柱后流出液紫外相应值，根据50%穿透点计算所述阴离子交换色谱 填料的动态吸附容量（Dynamicbindingcapacity，DBC)。并分别用市售日本智索的Chisso CellufineA800和美国GE公司的S印haroseDEAEFF填料做了平行对比实验。试验结果如 下表所示。
[0135]

【权利要求】
1. 用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱填料，其特征在于，所述阴离子交换色谱填 料的基质为交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯的多孔球形颗粒；所述阴 离子交换色谱填料的粒径范围包含在30-150 μ m的范围中，平均粒径为50-80 μ m，孔径范 围包含在30-180nm的范围中。
2. 如权利要求1所述的阴离子交换色谱填料，其中所述阴离子交换色谱填料的表面电 荷密度为350-2350 μ mol/g，比表面积为33-95平方米/g，孔隙率为25-86%。
3. 制备如权利要求1所述的阴离子交换色谱填料的方法，包括：用悬浮聚合法制备聚 甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球，对所述微球进行洗涤及筛分， 再使用胺类亲核试剂在所述筛分后得到的微球表面键合阴离子交换基团； 其特征在于，所述悬浮聚合法的步骤为： a、 在反应釜中加入分散稳定剂、静电保护剂和水，密闭所述反应釜，搅拌所述反应釜中 的物料同时升高釜内温度至60-85°C，直至所述分散稳定剂和所述静电保护剂充分溶解后 停止搅拌，得到水相； b、 取甲基丙烯酸环氧丙酯、甲基丙烯酸乙二醇双酯、致孔剂和引发剂并将其混合得到 混合物料，将所述混合物料超声的同时搅拌，至所述引发剂完全溶解，得到有机相； c、 将所述水相升温至30°C，加入所述有机相并在30°C下搅拌直至形成均匀油状乳液 体系，得到混合乳液；和 d、 将所述混合乳液加热至75-80°C引发聚合反应，所述聚合反应的时长为6-30小时， 得到所述聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双酯基质的微球。
4. 如权利要求3所述的制备阴离子交换色谱填料的方法，其中所述分散稳定剂是聚乙 烯醇，所述分散稳定剂与所述水相的质量体积比为〇. 03-1% ;所述静电保护剂是氯化钠，所 述静电保护剂与所述水相的质量体积比为1-16. 7%。
5. 如权利要求3所述的制备阴离子交换色谱填料的方法，其中所述有机相中，所述致 孔剂的体积分数为20-71% ;所述致孔剂是良溶剂和不良溶剂中的一种或其组合，所述良溶 剂选自甲苯、异丙苯和二甲苯中的一种或其任意组合；所述不良溶剂选自异戊醇、正辛醇、 异辛醇和正十二醇中的一种或其任意组合。
6. 如权利要求3所述的阴离子交换色谱填料的制备方法，其中所述引发剂为过氧化苯 甲酰或2, 2' -偶氮二异戊腈，所述引发剂的用量与所述甲基丙烯酸环氧丙酯和所述甲基丙 烯酸乙二醇双酯两者用量和的质量体积比为0. 4-3%。
7. 如权利要求3所述的制备阴离子交换色谱填料的方法，其中所述胺类亲核试剂为二 乙胺、三乙烯四胺、五乙烯六胺、五乙烯六胺或Ν，Ν' -二乙基乙二胺。
8. 如权利要求3所述的制备阴离子交换色谱填料的方法，其中所述表面键合的反应温 度为0-50°C，反应时长为1-10小时。
9. 用于纯化低分子肝素的阴离子交换色谱柱，其特征在于，使用权利要求1所述的阴 离子交换色谱填料填充而成。
10. 纯化低分子肝素的方法，其特征在于，将待纯化的低分子肝素样品通过权利要求9 所述的阴离子交换色谱柱进行纯化。
【文档编号】G01N30/06GK104275166SQ201310280819
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月5日 优先权日:2013年7月5日
【发明者】穆宁, 刘辉, 孙国威 申请人:无锡加莱克色谱科技有限公司