一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食用菌培养液中有机酸的测定领域，特别设及一种利用离子排阻色谱 柱检测食用菌培养液中草酸的方法。
【背景技术】
[0002] 有机酸作为生物生长过程中的代谢产物会不断变化，食用菌生长过程中培养料内 的有机酸逐渐积累导致抑下降，直接影响菌丝细胞的新陈代谢和整个生命活动，所W 了解 菌丝有机酸的种类和变化，有利于了解其代谢机制，更好的调控培养条件使之更适合菌丝 的生长。
[0003] 目前分析有机酸的方法主要有；酸碱滴定法、气相色谱法、薄层色谱法及高效液相 色谱法等。酸碱滴定法只能测定总酸量，且操作繁琐；气相色谱法需衍生步骤，误差较大； 薄层色谱法定量精度差；而高效液相色谱法操作简便，准确度高，重现性好，可同时定量多 种有机酸，已被广泛用于各种食品和天然物中有机酸的测定。但不同的柱子针对不同的物 质分离所需的色谱条件不同，利用串联离子排阻色谱柱（甜1011和KC-811，化odex公司） 对食用菌培养液中有机酸的定性定量检测尚未见报导。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液 中草酸的方法，该方法简单，耗时少，精密度高，重复性好，稳定性好。
[0005] 本发明的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法，包括：
[0006] (1)分别取草酸、巧樣酸、酒石酸、甲酸、了酸标准品置于容量瓶中，加超纯水定容 作储备液；将储备液稀释配制不同浓度的混标，进样分析，根据峰面积和有机酸含量绘制标 准曲线；
[0007] (2)选用甜1011柱和KC-811柱为分析柱，SH-G柱为保护柱，色谱条件为：流动 相4mmol/L高氯酸溶液，柱温为60。流动相流速1. 0血/min,紫外可见检测器检测，波长 210nm ;
[000引 （3)取待测食用菌斜面培养物，活化后打碎，接入到PDB液体培养基中摇床培养， 定期取样，无纺布过滤菌丝，滤液离屯、后取上清液备用；
[0009] (4)分别取步骤做中的上清液ImL，滤膜过滤后上样，上样量10化，采用和标准 品相同的条件重复检测；根据样品对应草酸的峰面积和标准曲线，计算样品中草酸的含量。
[0010] 所述步骤（1)中的不同浓度具体为草酸200 yg/mU巧樣酸200 yg/mU酒石酸 200 y g/mL，甲酸 1 y L/mL，了酸 1 y L/血。
[0011] 所述步骤（1)中草酸在精密度实验中的RSD为0.65%，在重复性实验中的RSD为 0. 92 %，在稳定性实验中的RSD为0. 77 %，标样回收率为102 %。
[001引 所述步骤（2)中的甜1011柱的参数为；8. 0mmX3000mm，6ym;KC-811柱的参数 为；8. OmmX 3000mm，6 y m ;甜-G 柱的参数为；6. OmmX 50mm，10 y m。
[001引 S个色谱柱串联使用，串联先后顺序为甜-G柱串联甜1011柱串联KC-811柱。
[0014] 所述步骤（3)中的食用菌为杏鲍茹XH、金针茹G1或金针茹巧9。
[0015] 所述步骤（4)中的打碎具体为高低档间隔打碎50s，直径0. 6cm且菌龄相同的菌块 个数与无菌水容积比为2. 5:1。
[0016] 所述步骤（4)中的滤膜孔径为0. 22 y m。
[0017] 所述步骤（4)中所取的样品菌丝生长要正常，平行间的差别尽量小。
[0018] 通过利用离子排阻色谱柱（S化011和KC-811串联，化odex公司）对食用菌培养 液中的草酸定性定量的测定方法，该方法精密度高，重复性好，稳定性强，可快速高效的检 测出食用菌培养液中草酸的含量。对特定种类真菌菌丝培养液的草酸的标准曲线一经建立 可重复使用，且样品前处理简单易行，需时少。
[0019] 本发明通过利用离子排阻色谱柱（S化011和KC-811串联，化odex公司）对食用 菌培养液中的草酸定性定量的测定方法，样品前处理简单。检测系统一经确定可对相应培 养模式或生长环境中的真菌菌丝培养液中的草酸进行长期、稳定的监测。
[0020] 有益效果
[0021] (1)本发明的方法简单，用时少，样品前处理简单；待测种类真菌的菌丝培养液离 屯、取上清，0. 22 y m滤膜过滤即可上样；
[0022] (2)本发明的方法精密度高，重复性好，稳定性强，草酸的RSD都小于5% ;
[0023] (3)本发明检测系统一经确定可对相应培养模式或生长环境中的真菌菌丝培养液 中的草酸进行长期、稳定的监测。
【附图说明】
[0024] 图1为5种有机酸标准品混标的液相图谱；其中，1为草酸；2为巧樣酸；3为酒石 酸；4为甲酸；5为了酸。
[0025] 图2为草酸标准品图谱；
[0026] 图3为样品中金针茹G1发酵液样品中草酸的图谱；其中，1为草酸。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，该些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[00測 实施例1
[0029] 确定金针茹G1，金针茹巧9,杏鲍茹XH菌丝摇瓶培养培养液中草酸的含量；
[0030] (1)绘制标准曲线
[0031] 分别准确称取lOmg草酸，巧樣酸，酒石酸标准品，吸取甲酸，了酸标准品50 y L置 于lOmL容量瓶中，加超纯水定容作储备液。将储备液稀释配制不同浓度的混标，进样分析， 根据峰面积和有机酸含量绘制标准曲线。结果如表1。
[0032] 表1标准曲线、相关系数和线性范围
[0033]
[0034] 分析；从表1可W看出，线性范围内
【主权项】
1. 一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法，包括： (1) 分别取草酸、柠檬酸、酒石酸、甲酸、丁酸标准品置于容量瓶中，加超纯水定容作储 备液；将储备液稀释配制不同浓度的混标，进样分析，根据峰面积和有机酸含量绘制标准曲 线； (2) 选用SHlOll柱和KC-811柱为分析柱，SH-G柱为保护柱，色谱条件为：流动相 4mmol/L高氯酸溶液，柱温为60°C，流动相流速I. OmL/min，紫外可见检测器检测，波长 2IOnm ； (3) 取待测食用菌斜面培养物，活化后打碎，接入到PDB液体培养基中摇床培养，定期 取样，无纺布过滤菌丝，滤液离心后取上清液备用； (4) 分别取步骤（3)中的上清液lmL，滤膜过滤后上样，上样量10 μ L，采用和标准品相 同的条件重复检测；根据样品对应草酸的峰面积和标准曲线，计算样品中草酸的含量。
2. 根据权利要求1所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤（1)中的不同浓度具体为草酸200 yg/mL，柠檬酸200 yg/mL，酒石酸 200 μ g/mL，甲酸 1 μ L/mL，丁酸 1 μ L/mL。
3. 根据权利要求I所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤（1)中草酸在精密度实验中的RSD为0.65%，在重复性实验中的RSD 为0. 92 %，在稳定性实验中的RSD为0. 77 %，标样回收率为102 %。
4. 根据权利要求1所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤⑵中的SHlOll柱的参数为：8. 0mmX3000mm，6 μπι ;KC-811柱的参 数为：8. OmmX 3000mm，6 μ m ;SH-G 柱的参数为：6. OmmX 50mm，10 μ m。
5. 根据权利要求4所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：三个色谱柱串联使用，串联先后顺序为SH-G柱串联SHlO11柱串联KC-811柱。
6. 根据权利要求1所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤（3)中的食用菌为杏鲍菇XH、金针菇Gl或金针菇F29。
7. 根据权利要求1所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤（4)中的打碎具体为高低档间隔打碎50s，直径0.6cm且菌龄相同的 菌块个数与无菌水容积比为2. 5:1。
8. 根据权利要求1所述的一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法， 其特征在于：所述步骤（4)中的滤膜孔径为0. 22 μπι。
【专利摘要】本发明涉及一种利用离子排阻色谱柱检测食用菌培养液中草酸的方法，包括：(1)配制标准品母液，梯度稀释，绘制标准曲线；(2)调整色谱条件；(3)PDB摇瓶培养食用菌，过滤离心后取上清液待用；(4)根据标准品的方法检测培养基质和样品中草酸的含量。本发明的方法简单，有很好的精密度和稳定性，能快速准确的检测出食用菌发酵液中草酸的含量，一经检测系统确定可对相应培养模式或生长环境中的食用菌培养液中的草酸进行长期、稳定的监测。
【IPC分类】G01N30-02, G01N30-46
【公开号】CN104569183
【申请号】CN201410784281
【发明人】唐庆九, 王言, 曹晖, 余昌霞, 汪虹, 陈明杰
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月16日