纯化重组人干扰素α2b的方法和试剂盒的制作方法

纯化重组人干扰素α2b的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物化学领域，具体地，属于蛋白纯化领域。更具体地，本发明涉及一种纯化重组人干扰素α2b的方法和试剂盒。具体地，所述方法包括：1）将含重组人干扰素α2b的发酵液上清液进行疏水层析（HIC）；2）将步骤1）中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阴离子交换；3）将步骤2）中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阳离子交换；和4）将步骤3）中得到的产物进行阴离子交换。本发明使得干扰素收率提高了25%左右，可适用于重组人干扰素α2b的大规模工业化生产/纯化，节省了纯化成本，提高了纯化效率。
【专利说明】纯化重组人干扰素Ct 2b的方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学领域，具体地，属于蛋白纯化领域。更具体地，本发明涉及一种纯化重组人干扰素a 2b的方法和试剂盒。
【背景技术】[0002]干扰素是由机体细胞受到病毒或其他诱导剂刺激而分泌的一组蛋白质，具有广谱的抗病毒、抗增殖和免疫调节等多种生理活性。干扰素的抗病毒作用一方面是作用于病毒靶细胞，诱导产生一系列活性物质，通过多种生化途径对病毒复制周期的不同环节进行干扰，抑制病毒的侵入和复制。另一方面干扰素作用于机体免疫系统，增强免疫系统抑制或清除病毒的能力。此外，干扰素还能调节免疫功能，抑制细胞分裂，尤其抑制肿瘤细胞的生长，故临床用于抗病毒感染和某些恶性肿瘤的治疗。
[0003]根据抗原特性和分子结构，干扰素通常可分为三种类型:α或白细胞干扰素、β或成纤维细胞干扰素、Y或免疫干扰素。其广谱抗病毒作用机制是通过诱导宿主细胞产生多种酶来干扰病毒复制过程的各个环节，而且一种干扰素能够抑制多种病毒的增殖，在医学上是一类广谱的抗病毒药物。它还能激活NK细胞、巨噬细胞、CTL细胞来杀伤病毒感染的靶细胞。目前市场上应用最多的是α型干扰素。
[0004]a 2b干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤药物，并且有免疫调节活性。可以用于治疗病毒性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性脑膜炎、病毒性眼感染、肾癌、毛细白血病、恶性皮肤淋巴瘤、成骨肉瘤、多发性硬化症等。
[0005]假单胞菌表达的重组人干扰素a 2b是由165个氨基酸组成的单链多肽，分子量为19.2±10%KDa，等电点在5.7 — 6.7之间，分子中无糖基，分子中有四个α -螺旋KYS1和CYS98XYS29和CYS138组成两条二硫键，其中29 - 138之间的二硫键对于干扰素生物活性十分重要。假单胞菌表达的重组人干扰素a 2b的三维空间结构示意图如附图1所示。
[0006]重组人干扰素a 2b (假单胞菌表达)的氨基酸序列如下面的SEQ IDNO:1所示:
[0007]165aa
[0008]Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr LeuMET Leu LeuAla Gln MET Arg Arg lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu LysAsp Arg His Asp Phe Gly PhePro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln PheGln Lys Ala Glu Thr He Pro Val Leu His GluMET lie Gln Gln IlePhe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp GluThrLeu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp LeuGlu Ala CysVal lie Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu METLys Glu Asp Ser lie Leu AlaVal Arg Lys Tyr Phe Gln Arg lie ThrLeu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro CysAla Trp Glu Val ValArg Ala Glu lie MET Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu GlnGluSer Leu Arg Ser Lys Glu (SEQ ID NO:1)
[0009]早期的人干扰素蛋白主要从血液中纯化获得，这一方法存在大量的缺点，如:难以获得大量血液，经济性低，易受各种血液中携带病毒地污染。重组DNA技术生产重组人干扰素蛋白应用于人干扰素蛋白的生产后，上述问题得到了解决，但从发酵液中提取纯化人干扰素的收率并不理想。
[0010]目前现有技术中已经有关于重组人干扰素a 2b纯化的方法，例如下面的方法:
[0011]离子交换柱层析:采用DEAE Sepharose (FF)柱，柱型XK30/50。用F液平衡后，将上述透析后的复性液样品上样，流速为20ml/min，上样结束后，以含不同浓度NaCl的F液洗脱，收集干扰素活性峰。选用S印hacry100/50XK层析柱，S2100填料，柱体积1700ml，用G液平衡后，将离子交换柱层析收集的干扰素活性峰样品经凝胶过滤，上样量为柱床体积的5%，再收集干扰素活性峰，合并样品进行以下检定(刘芄实，姜崴，隋宝真，张春丽，重组人干扰素a 2b的提取和纯化，微生物学免疫学进展，2004年第32卷第I期，pl3_16)。
[0012]然而，本发明人在研究中发现，现有的纯化方法对干扰素的收率并不十分理想，因此，本领域尚需一种提高干扰素收率的纯化方法。

【发明内容】

[0013]本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，经过对所用的试剂、上样量、流速、pH等多个条件或参数的全面的应用和优化，得到了一种纯化重组人干扰素a2b的方法或试剂盒。并且本发明人惊奇地发现，本发明的方法或试剂盒能够有效地纯化干扰素特别是人干扰素a2b (例如重组人干扰素a 2b)，并且蛋白和干扰素的收率均较高，得到的干扰素活性好。由此提供了下述发明:
[0014]本发明的一个方面涉及一种纯化干扰素的方法，包括下述步骤:
[0015]I)将含干扰素的发酵液上清液进行疏水层析(HIC)；
[0016]2)将步骤I)中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阴离子层析；
[0017]3)将步骤2)中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阳离子层析；和
[0018]4)将步骤3)中得到的产物进行阴离子层析。
[0019]根据本发明上述的方法，其中，步骤2)和步骤4)中所述的阴离子层析均为弱阴离子层析。
[0020]对本发明而言，干扰素的发酵液上清液的获取并不特别限定，例如可以通过本领域人员知悉的方法获得。
[0021]可耐受高流速多次使用的阴离子交换介质是通过电荷作用和氢键和/或者疏水作用与可耐受高流速多次使用的阴离子交换介质相互作用。
[0022]不拘于理论的限制，疏水性层析利用表面偶联的弱疏水基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也强。而且在不同的介质中，疏水基团暴露的多少还有所差异。在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，蛋白质的结构也发生翻转，裸露出疏水部位增多，蛋白质的疏水性增强；离子强度较低的溶液中，蛋白质的疏水性减小。在高电导率的条件下上样，疏水性基团较多的目标蛋白与配基作用吸附，缺乏疏水基团的蛋白被冲洗下去，再降低洗脱液的电导率使蛋白疏水性降低，从树脂上被洗脱下来。
[0023]不拘于理论的限制，离子交换层析是离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷结合。标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。DEAE等阴离子树脂侧链电荷为正，可以与带负电荷的蛋白结合。离子交换层析时，先用离子强度较低的缓冲液上样和洗涤。蛋白质溶液进入离子交换柱后，与离子交换树脂无结合能力的蛋白被冲洗掉，余下的蛋白质均可结合在树脂上。然后在缓冲液中加入强电解质(如氯化钠)，盐离子与离子交换剂的结合能力强于蛋白与离子交换剂的结合能力，蛋白就会被竞争性地洗脱下来。由于不同种类的蛋白与树脂的亲和力各不相同，可用逐渐增加洗脱液中氯化钠浓度的方法将其逐一洗脱出来。氯化钠溶液洗脱法有两种方式:步进式洗脱(洗脱液中氯化钠浓度阶段性提高)和线形梯度洗脱(洗脱液中氯化钠浓度呈线形提高)。一般说来，杂蛋白与目的蛋白结合能力相差较大时，适宜用步进式洗脱；线性梯度洗脱适于分开结合能力相近的蛋白质。
[0024]阳离子配基包括但不限于:磺酸根(一 S03V—S03 -H)、硫酸根(一 OSO3 V—OSO3-H)、竣酸根(一COO /一C00H)、憐酸根(一OPO32 /一OPO3-H/—OPO3H2)和亚憐酸根(一PO32 /一PO3 - H/一PO3H2)ο常用的弱阳尚子交换介质基团为羧酸根(一COO /一COOH)>憐酸根(一OPO32 /一OPO3 _ H/一OPO3H2)和亚憐酸根(一PO32 /一PO3-H/—PO3H2X
[0025]次要结合基团至少有一个氢键作用原子，且该原子与阳离子交换基团之间应有I至7个原子的距离。氢键原子时能够参与形成氢键的原子。氢键原子可以从含杂原子的基团中选择，如氧原子，氮原子，硫原子；及SP和sp2_杂化碳原子；卤族基团，如F、Cl、Br、I,特别是F。典型次要结合基团含有不带电荷的原子或随pH变化可以带电荷的原子。
[0026]不拘于理论的限制，步骤I)主要目的是消除肽类，辅基，免疫球蛋白等物质，因此使用疏水层析树脂(HIC)。由于在步骤I)之前对重组人干扰素a 2b发酵液上清液进行硫酸铵沉淀处理，上样液为高盐液，该步骤采用HIC，可以避免脱盐处理直接上样，减少工艺复杂程度。HIC将发酵上清液纯化并以小体积洗脱，达到浓缩效果同时大幅降低了发酵上清液内的盐浓度，为下游纯化提供理想的纯化条件。疏水层析所用的基质是将琼脂糖凝胶通过BrCN活化后，与不同的α _氨基烷烃作用，产生碳链长度逐次变化的同系列烷基琼脂糖Seph-Cn,其中η=1 — 6,表示碳链中的碳原子数。
[0027]不拘于理论的限制，步骤2)主要目的是分离大分子多肽蛋白、核酸、氨基酸等带电生物分子，因此使用离子层析`树脂(IEC)。琼脂糖分子上结合有二乙氨乙基(Dicthylamin0ethyl，DEAE)，含有带正电荷的阳离子琼脂糖一O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子(如Cl—等)，可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。交换剂对胶体离子(如蛋白质)和无机盐离子(如NaCl)都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl—的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl—浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，采用增加洗脱液的离子强度的方法达到分离蛋白质的目的。
[0028]不拘于理论的限制，步骤3)中主要目的是分离大分子多肽蛋白、核酸、氨基酸等带电生物分子，因此使用离子层析树脂(IEC)。琼脂糖分子上结合有羧甲基(Carboxymethy，CM)。其反离子为阳离子(如Na+等)，可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
[0029]不拘于理论的限制，步骤4)中主要目的是分离内毒素生物带电分子，因此使用离子层析树脂(IEC)。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分带负电荷，因此选用阴离子层析树脂分离。[0030]一种纯化干扰素的方法，包括下述步骤:
[0031]I)将干扰素发酵液上清液在电导率为180± lOOmS/cm下利用Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离；
[0032]2)将步骤I)中得到的产物调节pH至7.5 — 9.0，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离；
[0033]3)将步骤2)中得到的产物调节pH至4.0 — 5.5，利用CM配基的琼脂糖类层析树脂进行分离洗脱；和
[0034]4)将步骤3)中得到的产物调节pH至7 — 9，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离。
[0035]根据本发明任一项所述的方法，其包括如下步骤:
[0036]I)将重组人干扰素a 2b发酵液上清液在电导率值180± 100mS/cm下利用Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，流速10 - 30L/hr，上样量5 — 9个柱体积；洗脱液用微滤膜进行过滤；
[0037]2)将步骤I)中得到的产物用超滤膜进行3 — 5倍浓缩，浓缩后pH调节至pH7.5 一8.5，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离；流速10 — 30L/hr,上样量3 — 7个柱体积；
[0038]3)将步骤2)中得到的产物调节至pH4.0-5.5,利用CM配基的琼脂糖类层析树脂进行分离洗脱，流速10 - 30L/hr ;上样量8 一 11个柱体积；和
[0039]4)将步骤3)中得`到的产物调节至pH7 — 9，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，流速10 - 30L/hr，上样量8 — 11个柱体积；将洗脱液用超滤膜进行浓缩，浓缩至I 一 3mg/ml。
[0040]浓缩的浓度可以通过本领域人员知悉的方法测得，例如通过监测保留液于280nm处的紫外吸收值得到。
[0041]根据本发明任一项所述的方法，其特征在于如下的(I) - (17)项中的任一项或者多项:
[0042](I)步骤 I)中的流速为 20 — 40L/hr ;优选为 25 — 35L/hr，例如 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35L/hr ；
[0043](2)步骤 2)中的流速为 10 — 30L/hr ;优选为 10 — 20L/hr，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20L/hr ；
[0044](3)步骤 3)中的流速为 10 — 30L/hr ;优选为 10 — 20L/hr，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20L/hr ；
[0045](4)步骤 4)中的流速为 10 — 30L/hr ;优选为 10 — 20L/hr，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20L/hr ；
[0046](5)步骤I)中的上样量为3 — 9个柱体积；优选为5 — 9个柱体积(例如5、6、7、8或9个柱体积)；
[0047](6)步骤2)中的上样量为I — 7个柱体积；优选为3 — 7个柱体积(例如3、4、5、6或7个柱体积)；
[0048](7)步骤3)中的上样量为6—11个柱体积；优选为8 — 11个柱体积(例如8、9、10或11个柱体积)；[0049](8)步骤4)中的上样量为6—11个柱体积；优选为8 — 11个柱体积(例如8、9、10或11个柱体积)；
[0050](9)步骤 2)中，调节 pH 至 8.0-9.0，例如 8.0,8.1,8.2,8.3,8.4,8.5,8.6,8.7、8.8,8.9 或 9.0 ;优选为 8.2 — 8.8 ;
[0051](10)步骤 3)中，调节 pH 至 4.2 — 5.2 ;优选为 4.5 — 5.0，例如 4.5,4.6,4.TA.8、
4.9 或 5.0 ;
[0052](11)步骤 4)中，调节 pH 至 7.5 — 8.5，例如 7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、
8.4 或 8.5 ;更优选为 7.7 — 8.2，例如 7.7、7.8、7.9、8.0、8.I 或 8.2 ;
[0053](12)步骤I)中，还包括将洗脱液进行过滤(例如用超滤膜进行过滤)，得到滤液的步骤；
[0054](13)步骤2)中，还包括在调节pH之前，将步骤I)中的产物进行浓缩的步骤(例如用超滤膜进行3 — 5倍浓缩)；
[0055](14)步骤4)中，还包括将步骤4)中的洗脱液进行浓缩的步骤(例如将洗脱液用超滤膜浓缩至I 一 3mg/ml ;优选浓缩为2 — 3mg/ml ;更优选浓缩为2.5 — 3mg/ml,例如2.5、
2.6、2.7、2.8、2.9 或 3mg/ml。)。
[0056](15)步骤I)中的电导率为80 - 280mS/cm ;优选地，为100 — 190mS/cm ;更优选地，为 120 — 140mS/cm ；
[0057](16)在进行步骤I)之前，将将含重组人干扰素a 2b的发酵液上清液进行裂解处理；
[0058](17)步骤2)中使用的DEAE配基的琼脂糖类层析树脂的量为步骤I)中所使用的Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂的使用量的一半(按照体积计算)。
[0059]根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤I)中的电导率为80 - 280mS/cm ;优选地，为 100 - 190mS/cm ;更优选地，为 120 — 140mS/cm 或 125 — 135mS/cm，例如 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134 或 135mS/cm。
[0060]根据本发明任一项所述的方法，其中，在进行步骤I)之前，将将含重组人干扰素a 2b的发酵液上清液进行裂解处理。
[0061]裂解可以按照本领域人员知悉的方法进行，例如使用高渗透压的方法将发酵菌体进行裂解处理。
[0062]根据本发明任一项所述的方法，其中步骤2)中的阴离子层析所使用阴离子交换介质的量为步骤1)中的疏水层析所使用的疏水介质的使用量的一半(按照体积计算)。
[0063]弱阴离子与强阴离子的区别在于使交换介质全离子化的pH范围，较宽者为强，较窄者为弱，与结合强度无关。弱阴离子交换树脂:这类树脂含有弱碱性基团，如伯胺基(亦称一级胺基)-NH2、仲胺基(二级胺基)-NHR、或叔胺基(三级胺基)-NR2,它们在水中能离解出OH —而呈弱碱性。这种树脂的正电基团能与溶液中的阴离子吸附结合，从而产生阴离子交换作用。它只能在中性或碱性环境下工作。而强阴离子型适用的范围要更广，在酸性环境下也可以。
[0064]根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤2)中的洗脱流速为50 - 120cm/h ;优选为 70 — 110cm/h ;更优选为 110cm/h。
[0065]根据本发明任一项所述的方法，其中，步骤4)中的洗脱流速为50 - 80cm/h ;优选为 60 — 70cm/h ;更优选为 70cm/h。
[0066]根据本发明任一项所述的方法，其中，所述干扰素为人干扰素；具体地，为人干扰素a 2b;更具体地，为重组人干扰素a 2b;特别具体地，为假单胞菌表达的重组人干扰素a 2b。
[0067]本发明的另一方面一种试剂盒,包括:Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂、DEAE配基的琼脂糖类层析树脂以及CM配基的琼脂糖类层析树脂(本发明中，三种树脂的示意图分别如图2A、图2B、图2C所示)。具体地，所述试剂盒包含Phenyl疏水树脂、DEAE阴离子树脂以及CMFF阳离子树脂。本发明的所述试剂盒能够用于纯化干扰素。
[0068]本发明的再一方面涉及本发明的试剂盒在制备或者纯化干扰素中的用途；具体地，所述干扰素为人干扰素；更具体地，为人干扰素a 2b ;特别具体地，为重组人干扰素a 2b ;进一步具体地，为假单胞菌表达的重组人干扰素a 2b。
[0069]本发明中，术语“干扰素”，具体地是指人干扰素；更具体地，为人干扰素a 2b ;特别具体地，为重组人干扰素a 2b;进一步具体地，为假单胞菌表达的重组人干扰素a2b，例如SEQ ID NO:1所示的重组人干扰素a 2b。
[0070]发明的有益效果
[0071]本发明的纯化方法的干扰素的收率在35%以上甚至40%以上甚至42%以上。本发明节省了纯化成本，提高了纯化效率，可适用于重组人干扰素a 2b的大规模工业化生产/纯化。另外，本发明的试剂盒能够经受更高的压力和更大的洗脱流速，可重复多次使用。
【专利附图】

【附图说明】
[0072]图1:假单胞菌重组人干扰素a 2b的空间结构示意图。
[0073]图2:图2A,疏水层析树脂Ph`enyl不意图，其中左侧的圆球表不琼脂糖基质；图2B，阴离子层析树脂DEAE示意图，其中左侧的圆球表示交联琼脂糖基质；图2(:，阳离子层析树脂CM示意图，其中左侧的圆球表示交联琼脂糖基质。
[0074]图3:实施例1中步骤I)的疏水层析洗脱图谱。
[0075]图4:实施例1中步骤2)的阴离子层析洗脱图谱。
[0076]图5:实施例1中步骤3)的阳离子层析洗脱图谱。
[0077]图6:实施例1中步骤4)的二次阴离子层析洗脱图谱。
[0078]图7:实施例1中步骤2)的阴离子层析产物电泳分析。泳道I 一 13的样品分别依次是:分子量标准品、干扰素标准品、阴离子上样液、阴离子层析部分收集I 一 9以及阴离子层析产物。所述“部分收集”是指层析过程进入到梯度洗脱时按照固定体积分瓶逐一收集，直至洗脱完成。
[0079]图8:实施例1中步骤3)的阳离子层析产物电泳分析。泳道I 一 13的样品分别依次是:分子量标准品、干扰素标准品、阳离子上样液、阳离子层析部分收集I 一 9以及阳离子层析产物。所述“部分收集”是指层析过程进入到梯度洗脱时按照固定体积分瓶逐一收集，直至洗脱完成。
[0080]图9:实施例1中步骤3)的阴离子层析产物电泳分析。泳道I 一 13的样品分别依次是:分子量标准品、干扰素标准品、阴离子上样液、阴离子层析部分收集I 一 9以及阴离子层析产物。所述“部分收集”是指层析过程进入到梯度洗脱时按照固定体积分瓶逐一收集，直至洗脱完成。
【具体实施方式】
[0081]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0082]实施例1:重组人干扰素a 2b的纯化
[0083]一、实验材料和实验仪器:
[0084]Phenyl 疏水树脂，GE Healthcare 公司，17-0973-04 ；DEAE 阴离子树脂，GEHealthcare 公司，17-0709-05 ；CM FF 阳离子树脂，GEHealthcare 公司，17-0719-05。
[0085]缓冲液:磷酸盐+氯化钠缓冲体系。
[0086]全自动液相色谱系统，GE Healthcare公司，AKTA ExplorerlOO ;生物分析仪,安捷伦公司，Agilent 2100 bioanalyzer ;电泳系统，GE Healthcare 公司，SE600 RUBY。
[0087]二、实验方法:
[0088]I)将重组人干扰素a 2b发酵液上清液在电导率值130mS/cm下利用Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，洗脱液用超滤膜进行过滤；流速30L/hr，上样量6个柱体积；
[0089]2)将步骤I)中得到的产物用超滤膜进行5倍浓缩，浓缩后pH调节pH至8.5，利用DEAE配基的琼脂糖类层 析树脂进行洗脱分离；流速15L/hr，上样量3个柱体积；
[0090]3)将步骤2)中得到的产物调节pH至4.5，利用CM配基的琼脂糖类层析树脂进行分离洗脱，流速12L/hr ;上样量10个柱体积；和
[0091]4)将步骤3)中得到的产物调节pH至7.8，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，流速15L/hr，上样量9个柱体积；将洗脱液用超滤膜进行浓缩，浓缩至2.Smg/ml ο
[0092]三、实验结果
[0093]步骤I)的疏水层析洗脱图谱如图3所示；步骤2)的阴离子层析洗脱图谱如图4所示；步骤3)的阳离子层析洗脱图谱如图5所示；步骤4)的二次阴离子层析洗脱图谱如图6所示。
[0094]从图3 — 6可见，a 2b蛋白的出峰位点与等电点性质相符，设定的洗脱条件可以精准地达到预定的分辨率，可有效地纯化重组人干扰素a 2b蛋白。
[0095]对比例:重组人干扰素a 2b的纯化
[0096]按照如下文献进行操作:
[0097]刘冗实，姜崴，隋宝真，张春丽，重组人干扰素a 2b的提取和纯化，微生物学免疫学进展，2004年第32卷第I期，pl3-16。
[0098]实验例1:凝胶电泳分析
[0099]一、实验样品
[0100]实施例1中的步骤2)至步骤4)中的产物。
[0101]二、方法如下:[0102]1.凝胶的配制
[0103]各组分如下面的表1和表2所示。
[0104]表1:15%下层分离胶的各组分
[0105]
【权利要求】
1.一种纯化干扰素的方法，包括下述步骤: 1)将含干扰素的发酵液上清液进行疏水层析； 2)将步骤I)中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阴离子层析； 3)将步骤2)中得到的产物进行可耐受高流速多次使用的阳离子层析；和 4)将步骤3)中得到的产物进行阴离子层析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)和步骤4)中所述的阴离子层析均为弱阴离子层析。
3.一种纯化干扰素的方法，包括下述步骤: 1)将干扰素发酵液上清液在电导率为180±lOOmS/cm下利用Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离； 2)将步骤I)中得到的产物调节pH至7.5 — 9.0，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离； 3)将步骤2)中得到的产物调节pH至4.0 — 5.5，利用CM配基的琼脂糖类层析树脂进行分离洗脱；和 4)将步骤3)中得到的产物调节pH至7.0 — 9.0，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离。
4.根据权利要求3`所述的方法，其包括如下步骤: 1)将重组人干扰素a2b发酵液上清液在电导率值180± lOOmS/cm下利用Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，流速20 - 40L/hr，上样量5 — 9个柱体积；洗脱液用微滤膜进行过滤； 2)将步骤I)中得到的产物用超滤膜进行3- 5倍浓缩，浓缩后pH调节至pH7.5 一9.0，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离；流速10 - 30L/hr，上样量3 — 7个柱体积； 3)将步骤2)中得到的产物调节至pH4.0 - 5.5，利用CM配基的琼脂糖类层析树脂进行分尚洗脱，流速10 — 30L/hr ;上样量8 — 11个柱体积；和 4)将步骤3)中得到的产物调节至pH7.0 - 9.0，利用DEAE配基的琼脂糖类层析树脂进行洗脱分离，流速10 - 30L/hr，上样量8 — 11个柱体积；将洗脱液用超滤膜进行浓缩，浓缩至I 一 3mg/ml。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于如下的(I)-(17)项中的任一项或者多项: Cl)步骤I)中的流速为20 - 40L/hr ； (2)步骤2)中的流速为10- 30L/hr ； (3)步骤3)中的流速为10- 30L/hr ； (4)步骤4)中的流速为10- 30L/hr ； (5)步骤I)中的上样量为3— 9个柱体积；优选为5 — 9个柱体积； (6)步骤2)中的上样量为I一 7个柱体积；优选为3-7个柱体积； (7)步骤3)中的上样量为6— 11个柱体积；优选为8 — 11个柱体积； (8)步骤4)中的上样量为6— 11个柱体积；优选为8 — 11个柱体积； (9)步骤2)中，调节pH至8.0 - 9.0 ；(10)步骤3)中，调节pH至4.2 - 5.2 ； (11)步骤4)中，调节pH至7.5 - 8.5 ； (12)步骤I)中，还包括将洗脱液进行过滤(例如用超滤膜进行过滤)，得到滤液的步骤； (13)步骤2)中，还包括在调节pH之前，将步骤I)中的产物进行浓缩的步骤(例如用超滤膜进行3 — 5倍浓缩)； (14)步骤4)中，还包括将步骤4)中的洗脱液进行浓缩的步骤(例如将洗脱液用超滤膜浓缩至I 一 3mg/ml) (15)步骤I)中的电导率为80- 280mS/cm ;优选地，为100 — 190mS/cm ;更优选地，为`120 — 140mS/cm ； (16)在进行步骤I)之前，将将含重组人干扰素a2b的发酵液上清液进行裂解处理； (17)步骤2)中使用的DEAE配基的琼脂糖类层析树脂的量为步骤I)中所使用的Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂的使用量的一半。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤2)中的洗脱流速为5- 50cm/h ;优选为 10 — 30cm/h ;更优选为 15cm/h。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤4)中的洗脱流速为5- 50cm/h ;优选为 10 — 30cm/h ;更优选为 15cm/h。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述干扰素为人干扰素；具体地，为人干扰素a 2b ;更具体地，为重组人干扰素a 2b ;特别具体地，为假单胞菌表达的重组人干扰素ct 2b。
9.一种试剂盒，包括=Phenyl配基的琼脂糖类层析树脂、DEAE配基的琼脂糖类层析树脂以及CM配基的琼脂糖类层析树脂；具体地，所述试剂盒包含Phenyl疏水树脂、DEAE阴离子树脂以及CM FF阳离子树脂。
10.权利要求9所述的试剂盒在制备或者纯化干扰素中的用途；具体地，所述干扰素为人干扰素；更具体地，为人干扰素a 2b ;特别具体地,为重组人干扰素a 2b ;进一步具体地，为假单胞菌表达的重组人干扰素a2b。
【文档编号】C07K14/56GK103864915SQ201210526437
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2012年12月7日
【发明者】梁士民, 钱晓露, 范凯, 闫凤英, 张忆疆 申请人:天津华立达生物工程有限公司