抗体和含有抗体的组合物的制作方法
【专利摘要】对于许多由细菌等介导的疾病，细菌的增殖是引起疾病的原因之一，而有时候，细菌释放的物质也可成为疾病的起因。在后一种情况中，当疾病待被抗体治疗时，需要利用作为抗原的为疾病起因的物质制备抗体。然而难以从细菌释放的物质中获取至关重要的为疾病起因的物质。然后，用由裂解作为抗原的细菌的细胞制得的裂解液免疫鸟类物种，以产生能够结合抗原以及由抗原分泌并能够加速病症恶化的物质的（多克隆的）抗体。利用作为抗原的病毒的表面蛋白制得的抗体预期能抑制病毒的感染。
【专利说明】抗体和含有抗体的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种针对作为抗原的微生物细胞的抗体，以及含有抗体的由抗体和基质(base)组成的组合物。本发明还涉及一种针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体，以及含有抗体的由抗体和基质组成的组合物。
【背景技术】
[0002]由于抗体选择性地结合抗原，因此抗体被应用于各个领域。例如，已知的有靶向抗原的分析和使抗原失活的疫苗的应用。此外，也已知用于过滤器中，其中，过滤器捕获通常悬浮于大气中的过敏原物质，例如微生物、真菌或花粉。
[0003]专利文件I公开了一种载有抗体的过滤器的发明，所述抗体用于捕获有害物质和有机化合物的银盐。专利文件I不仅仅公开了捕获微生物等或使微生物等失活，还公开了真菌和微生物在载体上不能重新增殖。
[0004]专利文件1:日本公开特许公报N0.2009-233557
【发明内容】
[0005]发明解决的问题
[0006]已知有多种获得抗体的方法。例如，如下方法是公知的:利用抗原免疫小鼠，将从小鼠获得的产生抗体的细胞与无限增殖化的细胞融合以形成杂交瘤细胞，然后培养杂交瘤细胞而获得抗体(单克隆的)。
[0007]此外，免疫卵生动物(包括鸟类)而从它们的蛋中获得抗体的方法是公知的。然而，过去只能获得仅仅针对靶抗原的抗体。
[0008]同时，对于由微生物等引起的许多疾病，虽然微生物本身的增殖是引发病症的原因，微生物释放的物质也能够成为引发病症的原因。在这些情况下，当试图利用抗体治疗疾病时，需要获得针对抗原(即引发疾病的物质)的抗体。但是，很难从微生物释放的物质中获取引发疾病的决定性物质。
[0009]另外，虽然近年来已经开发了各种各样的抗生素和灭菌剂用于皮肤疾病，许多固有的细菌被这些抗生素或灭菌剂杀灭或清除。因此，已知这会引起皮肤微生物环境的恶化，从而使皮肤疾病加剧。基于这个原因，必须仅抑制固有微生物中的病原菌。然而，具有这种选择性的材料还有待在实际应用中加以开发。
[0010]抗体是具有特异性结合抗原的特征的蛋白质。因此，设想抗体仅仅能够选择性结合身体表面或身体中存在的众多微生物中特定的病原菌，从而抑制特定病原菌的增殖或杀灭特定的病原菌。也就是说，只有不利的微生物而不是保护皮肤的固有细菌(有益细菌)受到抗体攻击，因此，预期能够缓解损伤或病症。`
[0011]基于相似的理由，对于不利于人体通过皮肤或粘膜感染的病毒，预期可以通过在进入身体之前于身体表面使抗体结合这种病毒而减轻感染。
[0012]解决问题的方式[0013]基于上述问题设计了本发明。通过发现抗体(多克隆的)不仅仅与抗原结合，还与由微生物细胞分泌用作抗原并加速病症恶化的物质结合，通过采用裂解作为抗原的微生物细胞获得的裂解液免疫鸟类而获得所述抗体，从而完成了本发明。更具体地，本发明的抗体是针对作为抗原的微生物细胞的裂解液的抗体。
[0014]此外，通过发现与病毒的表面结合的抗体可以通过采用作为抗原的病毒的表面上的蛋白质免疫鸟类而获得，从而完成了本发明。更具体地，本发明的抗体是针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体。
[0015]另外，含有所述抗体和基质的含有抗体的组合物能够通过直接在皮肤上施用而获得抗体的作用。
[0016]发明的有益效果
[0017]关于本发明的抗体，可能获得了与微生物细胞和物质结合的抗体，所述物质从微生物细胞引发病症的发展，尽管只采用微生物细胞进行免疫。因此，无需采用不同的物质作为抗原来获得抗体。[0018]此外，本发明的抗体为针对作为抗原的病毒的表面蛋白的抗体。因此，所述抗体能够与病毒的表面结合并减轻对人体的感染。
[0019]另外，还发现了通过直接施用于皮肤，使用本发明的抗体和基质的含有抗体的组合物具有缓解遗传性过敏症(atopy)或痤疮的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为显示本发明的抗体在抑制细菌增殖中的作用的实验结果图；
[0021]图2为显示本发明的抗体在抑制细菌增殖中的作用的照片。
【具体实施方式】
[0022]以下示出了本发明的具体实施例。
[0023]实施例1
[0024]细菌
[0025]应用到实施例中以证明本发明效果的两种类型的细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, NBRC102135)(在下文中，称为 S.aureus)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes, NBRC107605)(在下文中，称为 P.acnes)。
[0026]将以上描述的每种细菌的培养基悬浮液离心并沉淀。去除培养基溶液，加入磷酸盐缓冲液重悬所述细菌，并通过均质器将细菌细胞裂解。使用裂解液(匀浆)作为抗原免疫鸟它鸟(ostrich)。
[0027]鸵鸟的免疫
[0028]将100 μ g (以蛋白质丰度计)的每种以上描述的匀浆与弗氏完全佐剂(Freund’ scomplete adjuvant)混合,并将混合物接种在雌能鸟腰椎区域的肌肉中，作为初级免疫。以后，使用上述描述的两种类型的匀浆进行每隔一周3次的给药作为初级免疫后的增强免疫。将100 μ g的细菌匀衆溶液与弗氏不完全佐剂(Freund’ s incomplete adjuvant)混合，将该混合物接种在已经免疫的雌鸵鸟腰椎区域的肌肉中。
[0029]抗体的纯化[0030]从增强免疫后两周或更长时间的鸵鸟产的鸵鸟蛋中纯化抗体。以下示出了纯化抗体的方法。如下从蛋黄中进行抗体(IgY)的纯化。
[0031]首先，向蛋黄中加入5 倍蛋黄量的 TBS(20mM Tris-HCl,0.15M NaClJP 0.5%NaN3)和等量的10%的葡聚糖硫酸酯/TBS，并将混合物搅拌20分钟。另外，加入与蛋黄等量的IMCaCl2ABS,将混合物搅拌并孵育12小时。此后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集上清。接下来，加入硫酸铵至终浓度为40%，并将混合物在4°C孵育12小时。之后，将混合物在15000rpm下离心20分钟，收集沉淀。最后，将沉淀重悬在与蛋黄等量的TBS中，并用TBS透析。通过这种工艺能够收集纯度为90%或以上的IgY。一个蛋黄中能够纯化2-4g的 IgYo
[0032]通过ELISA测定
[0033]通过以下ELISA测定获得的抗体的抗体反应性
[0034]将100 μ L2 μ g/mL 的每种细菌细胞(S.aureus 或 P.acnes)、S.aureus 的肠毒素、
S.aureus的TSST-1、凝固酶和蛋白酶加入用于ELISA的96孔微孔板的每个孔中，并在室温下孵育2小时。使用PBS洗漆3次后，在每个孔中加入100 μ L商购的封闭液(BlockAce:Dainippon Sumitomo Pharma C0., Ltd.),并将混合物孵育 2 小时。使用 PBS 洗漆 3 次后，在每个孔中加入50 μ L免疫前和免疫后的鸵鸟IgY抗体的系列稀释的溶液(含有2mg/mL的储液，2倍系列稀释，例如，100倍、200倍等)，并在室温下孵育I小时。
[0035]使用PBS洗涤3次后，在每个孔中加入100 μ L过氧化物酶标记的抗鸵鸟IgY兔多克隆抗体(自产的)，并孵育45分钟。使用PBS洗涤3次后,用商购的用于过氧化物酶的荧光试剂盒(luminescence kit) (Sumitomo Bakelite C0.，Ltd),突光(luminescence)发身寸30分钟后，使用用于ELISA的酶标仪测定吸光度(450nm)。获得的结果以最大稀释比例表示，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前IgY的吸光度的2倍或以上。
[0036]表1示出了通过使用S.aureus细胞的匀浆溶液免疫获得的鸵鸟蛋黄抗体的活性(ELISA)的结果。每个数值均在最大稀释比例处，在所述最大稀释比例处，吸光度为免疫前的从鸵鸟的蛋黄中获得的IgY的吸光度的2倍或以上。因此，数值的单位为“倍数”。例如，对于肠毒素，意味着，即使当稀释12，800倍时，与未使用匀浆溶液免疫的鸵鸟蛋黄抗体相t匕，吸光度值仍为2倍以上。这表明，获得了具有该程度的高滴定度的抗体。
[0037]表1
[0038]
【权利要求】
1.一种针对抗原的抗体，所述抗原为微生物细胞的裂解液。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为从由作为抗原的微生物细胞的裂解液进行免疫的鸟类的蛋中获得的IgY。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，所述鸟类为鸵鸟。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体，其中，所述微生物细胞为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的抗体，其中，所述微生物细胞为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。
6.一种针对抗原的抗体，所述抗原为病毒的表面蛋白。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中，所述抗体为从由作为抗原的蛋白质进行免疫的鸟类的蛋中获得的IgY。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，所述鸟类为鸵鸟。
9.根据权利要求6-8 中任意一项所述的抗体，其中，所述蛋白质包括HIVgpl20。
10.根据权利要求6-8中任意一项所述的抗体，其中，所述蛋白质包括6、11、16或18型HPV中的任意一种。
11.一种含有抗体的组合物，该含有抗体的组合物含有权利要求ι-?ο中任意一项所述的抗体和基质。
12.根据权利要求11所述的含有抗体的组合物，其中，所述基质为矿脂。
【文档编号】C07K16/08GK103890173SQ201280040447
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2011年8月19日
【发明者】塚本康浩 申请人:鸵鸟制药株式会社, 永生精神有限公司