高纯度的曲普瑞林及其纯化方法

专利名称：高纯度的曲普瑞林及其纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种高纯度的曲普瑞林，该高纯度的曲普瑞林具有杂质含量低、产品纯度高等诸多优点。本发明进一步地涉及该高纯度的曲普瑞林的纯化方法。
背景技术：
曲普瑞林，已以其醋酸盐或者巴莫酸盐的形式应用于临床，临床适应症包括前列腺癌、性早熟、辅助生殖技术(ART)例如体外受精术(IVF)、子宮内膜异位症和子宮肌瘤等，已上市产品例如有达菲林■,曲普瑞林英文名为=Triptorelin,别名有垂普托雷林、色氨瑞林、Decap印tyl 等，其 CAS 登记号为 57773-63-4，分子式，C64H82N18013，分子量 1311. 45。曲普瑞林的妝序为Pyr_Hi S-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH20
曲普瑞林系合成的促性腺激素释放激素(GnRH)的类似物。其结构的改良是将天然分子结构中的第六个左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代以使其促效作用更为显著。曲普瑞林作用与GnRH相同，但其血浆半衰期延长且对GnRH受体的亲和カ更强，因此曲普瑞林成为GnRH受体的强カ激动剂。曲普瑞林注射后,最初会刺激垂体分泌促性腺激素(Gn)，即黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。当垂体经过长期的刺激后会进入不应期，促性腺激素的释放会減少，因而使性类固醇(睾丸酮或雌激素)降低至去势水平。上述作用是可逆转的。1974年日本武天化工的Fujino Masahiko等人首先发明促黄体急速释放激素的十肽酰胺类似物的合成エ艺。并在日本，德国，美国等国家申请专利，专利号分别为JP19740027442, DE2446005, US4008209 (液相法)。此后，美国US4010125公开了曲普瑞林及其中间体以及它们的制备方法。该文献所记载的方法包括使用Boc-保护氨基酸为原料,使用ニ苯甲基胺(Benzhydrylamine)树脂进行固相合成。在每ー轮脱帽须用三氟醋酸，并且在最终将十肽从树脂上切除时使用氢氟酸和苯甲醚。以Fmoc-保护氨基酸为原料制备曲普瑞林亦有相关报道。例如孙永强等(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药エ业杂志，2012，43 (7):532)公开了使用Fmoc-保护氨基酸为原料通过液相合成法来制备曲普瑞林，在该方法中使用HBTU为偶联剂，据报道该エ艺中每一次肽链延长步骤的收率仅在77% 86%之间，纯化收率为74%，总收率仅为12. 4%。此外，作为ー种由10个氨基酸依序列连接而成的多肽，其在合成过程中需要将10氨基酸依次连接，从而在合成过程中可能产生较多的杂质，特别是有可能形成一些缺少一个或多个氨基酸的更短的肽。因此，获得一种高纯度曲普瑞林仍然是本领域技术人员极其期待的。

发明内容
本发明的目的在于提供一种制备高纯度曲普瑞林的方法，期待该方法可以得到高收率和/或高纯度的曲普瑞林。本发明人令人惊奇地发现，使用特定的エ艺条件制备曲普瑞林，不但产率高，而且产品品质优良；本发明人还令人惊奇地发现，使用特定的エ艺条件纯化曲普瑞林,不但收率高,而且纯度高产品品质优良。本发明因此而得以完成。为此，根据本发明的第一方面，提供了一种固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤(I)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂；(2)向上ー步骤所得的肽偶合树脂(即步骤(I)所得Fmoc-Gly-树脂)中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽(即脱除Fmoc-保护基)；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Pro-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；
(3)循环重复步骤(2)，并在每ー循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸Fmoc-Pro-OH :Fmoc-L_Arg (pbf) -0H、Fmoc-L-Leu-0H、Fmoc-D-trp (bo c) -OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)_OH、Fmoc_L_Ser(tBu)_OH、Fmoc_L_trp(boc)_OH、Fmoc_L_His(trt)-OH 矛ロH-Pyr-OH,以最终形成十妝树脂H-Pyr_His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂；(4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述树脂选自rink amide MBHA树脂、:rink amide am树脂、knorr树脂、或其组合。这类树脂是可以从商业途径获得的,例如可以从阿拉丁试剂公司(http://www.aladdin_reagent.com)商业公司购得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的取树脂置于反应器中，加入溶剂(例如ニ氯甲烷、甲醇、こ醇、氯仿、三氟こ酸、DMF、或其组合)振荡并充分浸泡(例如浸泡10 200min)，抽除溶剂(必要时，可再用上述溶剂重复清洗，并除去溶剤)。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照如下方式进行的称取一定量树脂于反应器中，然后加入ニ氯甲烷，振荡并浸泡60分钟，用ニ氯甲烷、甲醇、ニ甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剂。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照CN101357936A说明书第8页第2_3行所述方式进行的。在一个实施方案中，所述树脂浸泡处理是照US4010125说明书第10栏第35-43行所述方式进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述树脂在经浸泡处理后、进行偶联反应之前，还包括对该树脂进行脱帽处理的步骤。増加该脱帽处理步骤，使树脂得以进ー步地活化，有助于增加Fmoc-Gly-树脂的收率。该脱帽处理的步骤可以參照步骤(2)中的方式进行。此外，在该脱帽处理期间或者脱帽处理后，可以使用茚三酮检测法检测脱帽完全程度，如果脱帽不完全，可重得进行脱帽处理。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述肽偶联剂例如但不限干DCC(N, N' - ニ环己基碳ニ亚胺，N，N' -Dicyclohexylcarbodiimide)、DIC(N, N，- ニ异丙基碳ニ亚胺，N，N' -Diisopropylcarbodiimide)、HATU (英文全称 2- (lH-7-Azabenzotriazol-l_yl)-1，1，3，3-tetramethyi uronium hexafluorophosphate Methanaminium)、HBTU (英又全称 O-Be nzotriazole-N, N，N’ , N’ -tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate)、HCTU (英文全称 IH-Benzotriazoliuml-[bis (dimethylamino)methylene] -5chloro-, hexaf luorophosphate (1-), 3-oxide)、TATU (英文全称0_ (7-Azabenzotriazole-l-yl) _N, N, N'
,N' -tetramethyluronium tetrafluoroborate)、TBTU (英又全称 O- (Benzotriazol-l-yl)-N, N, N'，N' -tetramethylur onium tetrafluoroborate)、或其组合。妝偶联剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述酰胺键形成促进剂例如但不限于HOAT、HOBT、6_C1 -HOBt、或其组合。这些试剂可以容易地从商业途径获得的，例如可以从吉尔生化公司、阿拉丁试剂公司、上海庭园生化科技有限公司等商业途径购得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述有机碱例如但不限于NMM、 DIEA、三甲基吡啶、或其组合。这些试剂可以容易地从一般的商业途径获得特别是一般的化学试剂公司购得，例如可以从北京化学试剂公司购得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，用于进行偶联反应的所述溶剂例如但不限干ニ氯甲烷、ニ甲基甲酰胺等。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剂；或者，例如在步骤(I)中进行偶联反应时,通常可以是每摩尔树脂使用5-25L溶剂，例如可以是每摩尔树脂使用10-20L溶剤。在其它偶联反应步骤中亦可使用此比率范围。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述树脂与所述Fmoc-Gly-OH的投料比为1:2. 5 5(摩尔比)，优选1:3 5。进ー步地，在后续的各个肽偶联反应中，添加的该步骤的氨基酸(Fmoc保护的或未保护的)的量为步骤(I)中树脂量的2 7倍(摩尔倍)，优选3 6倍。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，所述Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱四者的投料比为1:1_3 :1-3 :2-6(摩尔比)，例如四者的投料比为1:1-2 :1-2 :2-4。需要说明的是，当某类物料(例如酰胺键形成促进剂)以两种或两种以上组合使用时，其在上述投料比中的用量是以投入的全部该类物料计的，例如使用两种酰胺键形成促进剂时，它们的总摩尔数是Fmoc-Gly-OH摩尔数的1_3倍，优选1_2倍；其它物料种表示它们的量时，亦有同样含义，除非另有说明。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，还包括在偶联反应期间或者反应后采用茚三酮检测法检测偶联反应进行程度。如果发现偶联反应不够完全，可以重复进行偶联反应。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中，还包括在完成偶联反应后对获得的Fmoc-Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理I 3次、甲醇、こ醇、氯仿、三氟こ酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、ニ氯甲烷，三者交替清洗2次。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽试剂选自哌啶(亦称为六氢吡唆，PIP)、ニこ胺、三こ胺、三氟こ酸。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在选自下列的溶剂中进行的ニ氯甲烷、ニ甲基甲酰胺等，优选ニ甲基甲酰胺。溶剂的用量以根据现有技术公开的方法或者经验容易地确定，例如用足以溶解各种物料的尽量少的溶剤。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在15 25%的哌啶/ ニ甲基甲酰胺溶液中进行的，优选是在20%的哌啶/ ニ甲基甲酰胺溶液中进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述脱帽反应是在10 30°C温度下进行的，反应时间为10 200min，例如30 90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述脱帽反应是在室温下进行的反应时间为10 200min,例如 30 90min,例如约 60min。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在完成脱帽反应后对获得的Gly-树脂进行清洗的操作，所述清洗是使用选自下列的溶剂清洗处理I 3次、甲醇、こ醇、氯仿、三氟こ酸、DMF、或其组合，特别是使用DMF、甲醇、ニ氯甲烷，三者交替清洗2次。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，还包括在脱帽反应期间或者脱帽反应后采用茚三酮检测法检测脱帽反应进行程度。如果发现脱帽反应不够完全，可以重复进行脱帽反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述偶联反应是參照步骤(I)中的偶联反应进行的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第一循环操作使用Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 作为保护氨基酸,得到 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第二循环操作使用Fmoc-L-Leu-OH作为保护氨基酸，得到H-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第三循环操作使用Fmoc-D-trp (boc) -OH 作为保护氨基酸，得到 H-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第四循环操作使用Fmoc-L-Tyr (tBu) -OH 作为保护氨基酸，得到 H-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第五循环操作使用Fmoc-L-Ser (tBu) -OH 作为保护氨基酸，得到 H-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第六循环操作使用Fmoc-L-trp (boc) -OH 作为保护氨基酸，得到 H-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，第七循环操作使用Fmoc-L-His (trt) -OH 作为保护氨基酸，得到 H-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，第八循环操作使用H-Pyr-OH作为保护氨基酸，得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)中进行偶联反应吋，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用。在一个实施方案中，HOAT和HOBT 二者的用量比为1:1-4 (摩尔比)，优选1:2-3(摩尔比)。发明人已经出人意料地发现，组合使用酰胺键形成促进剂对于提高第一歩骤偶联率进而提高产品品质是非常有益的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是HOAT。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑶中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg(pbf)-OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg(pbf)-OH 一起加入适量乳酸进行反应。在一个实施方案中，所述Fmoc-L-Arg(pbf) -OH与乳酸的摩尔比为1:0. 1-0. 5，优选1:0. 2-0. 3。所述的乳酸例如是符合2010年版二部480页收载的“乳酸”的标准的产品。发明人已经出人意料地发现，在该步骤中加入适量乳酸时，所得曲普瑞林氨基酸光学纯检测时D-Arg的含量低于约0. 10%，这对于提高产品品质是非常有益的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(I)、步骤(2)、和步骤(3)中的所述偶联反应是在10 30°C温度下进行的，反应时间为10 200min，例如30 90min，例如约60min。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的。在一个实施方案中，所述偶联反应是在室温下进行的反应时间为10 200min，例如30 90min，例如约60min。根据本发明第一方面的方法，其中在各步骤中进行脱帽反应和/或偶联反应吋， 是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的，虽然本发明描述了ー些优选的反应时间，然而反应时间可根据茚三酮检测结果而随时作适当调整，例如如果经检测发现反应尚不完全的情况下可适当延长反应，这些操作是本领域技术人员容易控制的。根据本发明第一方面的方法，其中步骤⑷所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H20=50_98:1-10:1-10:0. 1-5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H20=90-98:1-5:1-5:0. 5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H20=95:2:2:1。在一个实施方案中，所述切割液是预先冷却到-20で至10°C，优选预先冷却至0°C至10°C，优选预先冷却至约5°C。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是在室温进行的，优选是在20±5°C下进行的。反应时间为1-10小时，优选1-5小时，优选2-3小时。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述切肽反应是将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来从而获得十肽曲普瑞林。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，在完成切肽反应后，除去切割液(例如通过减压的方式)，然后加入こ醚进行沉淀，收集沉淀物，用こ醚洗涤数次，真空干燥，获得曲普瑞林。根据本发明第一方面的方法，在经步骤(4)切肽反应获得曲普瑞林干燥品后，还进ー步包括对该曲普瑞林干燥品进行纯化的步骤。该纯化步骤在本发明中亦可称为步骤
(5)，纯化前的曲普瑞林干燥品可以称为曲普瑞林粗品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的纯化步骤是照如下子步骤进行的(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交換柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，所述待纯化的曲普瑞林可以是如本发明合成的曲普瑞林，亦可以是其它固相合成法合成得到的曲普瑞林(例如可以是CN101357936A说明书第8页至第10页第I行所得曲普瑞林或者进ー步地是说明书第10页第6行所得曲普瑞林；例如可以是US4010125实施例1和2所得曲普瑞林)，还可以是液相法合成得到的曲普瑞林(例如可以是孙永强文献(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药エ业杂志，2012，43 (7) 532)中步骤2. 2或者步骤2. 3所得曲普瑞林)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，所述溶剂为醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为2-20%(v/v)的醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为5%的醋酸水溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(a)中，溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为0. l-10%(w/v)，例如浓度为l-5%(w/v)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，所述的离子交換柱为阳离子交换柱(例如但不限于Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、ShodexIECSP-420N、 Shodex Asahipak ES-502C7C、 SP Sepharose HP、 SP Sepharose FF、 SSepharose FF和DEAE Sepharose FF、DOOl (或D301)大孔强酸性苯こ烯系阳离子交换树月旨、D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、001X7(732)凝胶强酸性苯こ烯系阳离子交换树脂、7320阳离子交换树脂、OOlX7MB阳离子交换树脂)或阴离子交換柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国Lewatit MP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK - GEL DEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交換柱。优选的离子交換柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交換柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途 径获得，例如得自北京谱朋科技有限公司。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上，然后再依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液(其中含有初步纯化的曲普瑞林)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，所述的离子交换柱预先用酸性溶液(其可称为流动相A)洗脱并使柱子平衡(由此可以活化柱子)；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是醋酸溶液；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为0. 1%-1%的醋酸溶液；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为约0. 5%的醋酸溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量可以是根据经验确定的，特别是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10 200 1 (mg:ml);特别是50 100 1 (mg:ml);在下文实例中如未特别注明，是50mg Iml0根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，将曲普瑞林加载到离子交換柱上后，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱(至直使流出液的pH恒定)。在ー个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在ー个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为5-50mmol/L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在ー个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为约20mmol/L的氢氧化钠溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(b)中，用酸性溶液(流动相
A)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用盐溶液(其可称为流动相C)洗脱，收集主峰流出液(其中含有转化成盐型的曲普瑞林)。在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是氯化钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸铵、或磷酸ニ氢钾的水溶液；在ー个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)的浓度是50-1000mmol/L ;在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是0. 7mol/L氯化钠溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(C)中，将子步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用こ腈稀释(例如可以稀释至こ腈浓度达1%_10%， 例如约5%);将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X(其为こ腈溶液，例如浓度为1%_10%的こ腈水溶液，例如浓度约5%的こ腈水溶液)洗脱(例如5-180min，例如约30min);接着用用流动相Y(其为こ腈溶液，例如浓度为10%-50%的こ腈水溶液，例如浓度约20%的こ腈水溶液)洗脱，收集主峰流出液(其中含有纯化的曲普瑞林)；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%(下文各实施例中终产物均控制水分含量在3-5%之间)。任选地，可以用流动相Z(其为こ腈溶液，例如浓度为60%-95%的こ腈水溶液，例如浓度约80%的こ腈水溶液)对柱子平衡(例如5-50min)以使柱子活化，以用于下一批次纯化工艺。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)的子步骤(C)中，所述硅胶是十八烷基娃烧键合娃胶。在一个实施方案中，所述娃胶柱是制备型的娃胶柱；在ー个实施方案中，所述硅胶柱规格可以为 10*250mm、20*250mm、30*250mm、50*250mm、100*250mm、150*250mm、300*250mm、或450*250mm。在一个实施方案中，所述硅胶粒径为5 15微米，例如10微米。硅胶柱的规格是本领域技术人员根据具体操作需求而可以容易地选择地，在下文中，如未特别说明，所用的娃胶柱为50*250mm,粒径10微米的Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，进行最終的色谱洗脱纯化吋，由于最终纯化步骤中使用到こ腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的こ腈，控制こ腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去こ腈的，或者可以容易地除去こ腈以使こ腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法測定)。本发明后文各实施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，こ腈含量均低于0. 03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了ー种曲普瑞林，其中こ腈含量低于0. 03%。进ー步地，本发明第二方面提供了ー种曲普瑞林的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交換柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；(C)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。
根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，所述待纯化的曲普瑞林可以是如本发明合成的曲普瑞林，亦可以是其它固相合成法合成得到的曲普瑞林(例如可以是CN101357936A说明书第8页至第10页第I行所得曲普瑞林或者进ー步地是说明书第10页第6行所得曲普瑞林；例如可以是US4010125实施例1和2所得曲普瑞林)，还可以是液相法合成得到的曲普瑞林(例如可以是孙永强文献(孙永强、钱明霞、严益民、冯晓晖、蒋伟，曲普瑞林的液相合成，中国医药エ业杂志，2012，43 (7) 532)中步骤2. 2或者步骤2. 3所得曲普瑞林)，此外该曲普瑞林可以是十肽本身，亦可以是其盐例如醋酸盐。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，所述溶剂为醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为2-20%(v/v)的醋酸水溶液。在一个实施方案中，所述醋酸水溶液为5%的醋酸水溶液。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(a)中，溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为0. l-10%(w/v)，例如浓度为1-5%(w/v)。·根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，所述的离子交換柱为阳离子交换柱(例如但不限于 Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IEC SP-420N、Shodex Asahipak ES-502C7C、 SP Sepharose HP、 SP Sepharose FF、 S Sepha rose FF 和DEAE Sepharose FF、DOOl (或D301)大孔强酸性苯こ烯系阳离子交换树脂、D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、001X7(732)凝胶强酸性苯こ烯系阳离子交换树脂、7320阳离子交换树脂、OOlX7MB阳离子交换树脂)或阴离子交換柱(例如国产D201、D231、DK251、731、或290型阴离子交换树脂，美国Amberlite IRA-900型阴离子交换树脂，德国LewatitMP-500型阴离子交换树脂，日本Diaion PA308型阴离子交换树脂，TOSOH TSK - GELDEAE-5PW、Chrompack IonoSpher A)或其组合使用；优选的离子交换柱为阴离子交换柱。优选的离子交換柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交換柱，例如Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Sh odex IEC SP-420N，它们可以容易地从商业途径获得，例如得自北京谱朋科技有限公司。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上，然后再依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液(其中含有初步纯化的曲普瑞林)。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，所述的离子交换柱预先用酸性溶液(其可称为流动相A)洗脱并使柱子平衡(由此可以活化柱子)；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是醋酸溶液；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为0. 1%-1%的醋酸溶液；在ー个实施方案中，所述酸性溶液(流动相A)是浓度为约0. 5%的醋酸溶液。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量可以是根据经验确定的，特别是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10 200 1 (mg:ml);特别是50 100 1 (mg:ml);在下文实例中如未特别注明，是50mg :1ml。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，将曲普瑞林加载到离子交換柱上后，用碱性溶液(其可称为流动相B)洗脱(至直使流出液的pH恒定)。在一个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在ー个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为5-50mmol/L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液；在ー个实施方案中，所述碱性溶液(流动相B)是浓度为约20mmol/L的氢氧化钠溶液。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，用碱性溶液(其可称为流动相
B)洗脱至直使流出液的pH恒定后，再用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的pH恒定。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(b)中，用酸性溶液(流动相A)洗脱至直使流出液的PH恒定后，再用盐溶液(其可称为流动相C)洗脱，收集主峰流出液(其中含有转化成盐型的曲普瑞林)。在一个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是氯化钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸铵、或磷酸ニ氢钾的水溶液；在ー个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)的浓度是50-1000mmol/L ;在ー个实施方案中，所述盐溶液(流动相C)是0. 7mol/L氯化钠溶液。 根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(C)中，将步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用こ腈稀释(例如可以稀释至こ腈浓度达1%_10%，例如约5%);将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X(其为こ腈溶液，例如浓度为1%-10%的こ腈水溶液，例如浓度约5%的こ腈水溶液)洗脱(例如5-180min，例如约30min);接着用流动相Y(其为こ腈溶液，例如浓度为10%-50%的こ腈水溶液，例如浓度约20%的こ腈水溶液)洗脱，收集主峰流出液(其中含有纯化的曲普瑞林)；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%(下文各实施例中终产物均控制水分含量在3-5%之间)。任选地，可以用流动相Z (其为こ腈溶液，例如浓度为60%-95%的こ腈水溶液，例如浓度约80%的こ腈水溶液)对柱子平衡(例如5-50min)以使柱子活化，以用于下一批次纯化工艺。根据本发明第二方面的纯化方法，其中步骤(C)中，所述硅胶是十八烷基硅烷键合娃胶。在一个实施方案中，所述娃胶柱是制备型的娃胶柱；在一个实施方案中，所述娃胶柱规格可以为 10*250mm、20*250mm、30*250mm、50*250mm、100*250mm、150*250mm、300*250mm、或450*250mm。在一个实施方案中，所述硅胶粒径为5 15微米，例如10微米。硅胶柱的规格是本领域技术人员根据具体操作需求而可以容易地选择地，在下文中，如未特别说明，所用的娃胶柱为50*250mm,粒径10微米的Lichrospher RP-18色谱柱(德国产)。根据本发明第二方面的纯化方法，其中进行最終的色谱洗脱纯化时，由于最终纯化步骤中使用到こ腈，因此本发明终产物中可能残余有微量的こ腈，控制こ腈的量是有必要的，通过减压干燥或真空干燥或者冷冻干燥是可以容易地除去こ腈的，或者可以容易地除去こ腈以使こ腈量降低到0.04%以下(可照气相色谱法測定)。本发明后文各实施例所得精制醋酸曲普瑞林中中，こ腈含量均低于0. 03%。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了ー种曲普瑞林，其中こ腈含量低于0. 03%。进ー步地，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一项所述方法获得的曲普瑞林；或者本发明第三方面提供了本发明第二方面任一项所述方法获得的曲普瑞林。本发明的曲普瑞林具有纯度高的特点。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，除了 Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0. 2%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检測，除了 Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于0. 15%。在一个实施方案中，本发明曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，其中D-Arg相对于全部精氨酸而言均小于0. 2%，优选小于0. 15。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了ー种曲普瑞林，其中こ腈含量低于0. 03%。在本发明中，可以对获得的曲普瑞林进行氨基酸组成检测，检测方法如下取曲普瑞林5mg,置硬质安瓿瓶中，加6mol/L盐酸溶液5ml,充氮后封ロ，于110°C下反应24小时，冷却，启封，水浴蒸发至近干，加水溶解至适当浓度，作为供试品溶液；另取甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸各对照品，制成与供试品中各氨基酸浓度相当的溶液，作为对照品溶液；用氨基酸分析方法，以各氨基酸总摩尔数的八分之一作为1，计算各氨基酸的相对比值。通常而言，曲普瑞林的上述8种氨基酸的相对比值均应为1. 0左右，并且通常在0. 8 1. 2之间，常规药用要求的曲普瑞林原料药的上述8种氨基酸的相对比值均应在0. 85 1. 15之间。本发明人出人意料地发现，在纯化工艺中使用特定的离子交換柱等纯化条件，终产物中甘氨酸的相对比值趋近于1，在0. 9 1.1之间。由此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了ー种曲普瑞林，其中甘氨酸的相对比值在0.9 1.1之间。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任ー实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进ー步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致吋，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，使用的氨基酸如未特别标示其构型时，均指-L型氨基酸。在本发明中，使用到如下的ー些Fmoc保护或未保护的氨基酸作为起始原料Fmoc-L_Gly-0H、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Arg (pbf)-0H> Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (boc) -0H> Fmoc-L-Tyr (tBu) -0H> Fmoc-L-Ser (tBu) -0H> Fmoc-L-trp (boc) -0H>Fmoc-L-His (trt)-0H、H_Pyr-0H。在本发明中还使用到Rink-amide MBHA树脂作为载体,其取代量为0. 84mmol/g，在标示树脂投料量时均有类似含义；如果直接以摩尔量标示树脂投料量，表示所加入的树脂的取代量，以摩尔(mol)或者毫摩尔(mmol)计。固相多肽合成中一般需要将a-氨基以及侧链活性基团保护起来。目前使用比较多的a-氨基保护基为叔丁氧羰基(Boc)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)两种。Boc基团需要反复采用50%的三氟こ酸(TFA)来脱除，肽树脂切割一般采用氢氟酸(HF)，对环境以及实验设备都有较高的要求，而Fmoc基团可以使用哌啶轻易地脱除，切割采用TFA，与Boc法相比，具有反应条件温和、合成效率高以及切割条件温和等优点，逐渐取代了 Boc基团而成为目前固相多肽合成的首选a-氨基保护基。在本发明中使用经Fmoc保护的氨基酸。酰胺键形成促进剂例如但不限于H0AT (CAS No. 39968-33-7)、HOBT (1-Hydroxybenzotriazole)、6-Cl-H0Bt (6-Chloro-l-Hydroxy-lH-Benzotriazole)、或其组合。有机碱例如但不限于NMM、DIEA、三甲基吡啶、或其组合。本发明需要解决的技术问题是公开一种固相合成曲普瑞林的合成方法以及纯化エ艺，解决目前现有的技术存在的上述缺陷。本发明固相合成曲普瑞林的方法大体上包括如下步骤(I)以rink amide MBHA树脂、rink amide am树脂或knorr树脂(这些树脂是容易从商业途径购得的)为起始原料，用固相合成的方法按照曲普瑞林氨基酸序列依次连接保护氨基酸，最后得到氨基酸侧链被保护的多肽；(2)用切割液将氨基酸的侧链保护基及多肽从树脂上同时切割下来，用こ醚沉淀洗涤后，获得粗品；(3)将粗品用醋酸水溶液溶解，依次经过离子交換柱和C18反相柱，冻干后，得到曲普瑞林(其为符合国家药典标准的曲普瑞林原料药产品)。在本发明的上下文中，对脱帽反应或者肽偶联反应进行反应程度检测时，如未另 外说明，均是采用如下方式的茚三酮检测法进行1、脱帽反应程度检测法毎次用小试管取大约0. 5-lmg树脂，用こ醇洗涤后，往试管中依次加入4滴缓冲液(20mg苯酚溶于50mlこ醇+25ml吡啶)，I滴Vc-こ醇溶液(4X 10-5mol/L)，2滴茚三酮溶液(500mg茚三酮溶于IOmlこ醇，50g/L)，用超声波进行脱氨处理。然后在沸水浴中加热5min，观察树脂及试管中溶液的顔色，进而判断反应的进行程度；若显蓝色则反应完全，若不显蓝色则反应不完全需重新进行此歩。2、肽偶联反应程度检测试剂(I) Ig茚三酮，溶于10-50ml无水こ醇；(2) 3. 2g苯酚，溶于ト20ml无水こ醇；(3)0. 4ml KCN储液(0. OlM KCN)，溶于19. 6ml吡啶。3、肽偶联反应程度检测方法在待检测的经肽偶联反应的树脂中，将上述三种试剂按1:1 1比例依次各滴加2滴，通过颜色观察来判断反应是否完全，此法灵敏度达到99%以上。若溶液及树脂为黄色，则表明树脂上无残留一 NH2;若溶液及树脂为紫色、淡蓝色或蓝色，则表明树脂上仍有残留的一 NH2，顔色越深，表明残留的-NH2越多，肽的耦联反应越不完全，需延长反应时间。按照本发明，所说的依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法,包括如下步骤Fmoc-Gly-树脂的制备、Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Tyr (Tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、Fmoc-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg(Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备、H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg (Pbf) -Pro-GIy_ 树脂的制备。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Gly-树脂的制备包括以下步骤称取一定量树脂(0. 3-1. 2mmol/g)于反应柱中，然后加入ニ氯甲烷，振荡并浸泡20-90分钟，用ニ氯甲烷、甲醇、ニ甲基甲酰胺分别交替清洗两次，抽滤以除去溶剤。加入脱帽试剂室温下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Gly-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。上述DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU表示ー种或者多种组合使用作为肽偶联剂；HOBT/HOAT表示ー种或者两种作为酰胺键形成促进剂，即其中“/”如未另外特别说明，表示“和或者或”的关系。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌唆，可以溶于DMF中(浓度1:1_5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU HOBT/HOAT DIEA/NMM=1 1-3 1-3 :2-6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反·应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Pro-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌唆，可以溶于DMF中(浓度1:1_5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 1-3 1-3 :2-6。在本发明方法的一个实施方案中,Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Arg (Pbf) -OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检測，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 1-3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中,Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取Fmoc-Leu-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检測，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 1-3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-D-Trp(Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此歩。称取Fmoc-D-Trp (Boc)-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加 入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Tyr(Tbu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此歩。称取Fmoc-Tyr (Tbu) -OH 适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU 适量、H0BT/H0AT 适量，加入ニ 甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Ser(tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg(Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶齐U。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此歩。称取 Fmoc-Ser (Tbu) -OH 适量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 适量、H0BT/H0AT 适量，加入ニ 甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2. 5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-Trp(Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护 基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取 Fmoc-Trp (Boc) -OH 适量、DCC/DI C/HATU/HCTU/HBTU 适量、H0BT/H0AT 适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5 5:1，优选3 5:1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，Fmoc-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取 Fmoc-His (Trt) -OH 适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU 适量、H0BT/H0AT 适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0.5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5 5 :1，优选3 5 :1。上述脱帽试剂可以为哌唆，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0.5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，H-Pyr-His(Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu)-D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂的制备包括以下步骤向上一肽偶联反应步骤获得的Fmoc保护氨基酸树脂中加入脱帽试剂，在一定温度下振荡反应5-50分钟，去掉氮端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，并抽滤除去溶剤。取少量树脂利用茚三酮检测法进行检测，显蓝色。若不显蓝色，则需重新进行此步。称取H-Pyr-OH适量、DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU适量、H0BT/H0AT适量，加入ニ甲基甲酰胺待其溶解后再加入适量DIEA/NMM，搅拌混匀后，倒入反应器中，一定温度下振荡反应0. 5-2. 5小吋。抽滤除去反应液，再分别用ニ甲基甲酰胺、甲醇、ニ氯甲烷交替清洗树脂两次，抽滤除去溶剤。茚三酮检测法进行检测，显黄色。若不是黄色，则需延长反应时间。在上述反应中，所添加的保护氨基酸与树脂的摩尔比为2.5 5:1，优选3 5:1。上述脱帽试剂可以为哌啶，可以溶于DMF中(浓度1:1-5)或者溶于ニ氯甲烷(DCM)中(浓度1:1-0. 5);上述反应温度可以为5-70°C ;上述肽偶联反应加入试剂的摩尔数比例为保护氨基酸DCC/DIC/HATU/HCTU/HBTU H0BT/H0AT DIEA/NMM=1 :1_3 :1_3 :2_6。在本发明方法的一个实施方案中，用切割液将氨基酸的侧链保护基及十肽从树脂上同时切割下来包括如下步骤将上述步骤中获得的H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu)-Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂加入预冷的切割液(零下 20°C至零上10°C )，在一定温度下反应1-10小时(例如1-5小时，例如约3小时)。减压除去切割液，加入大量こ醚沉淀，收集沉淀物，用こ醚洗涤数次(例如4-10次)，真空干燥，获得曲普 瑞林粗品。所述切割液中包含TFA、TIS、EDT、H20。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H20=50-98:1-10:1-10:0.ト5。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H20=90_98:1-5:1-5:0. 5-2。在一个实施方案中，所述切割液中四种组分的体积比为TFA: TIS: EDT: H20=95:2:2:1。在本发明方法的一个实施方案中，对获得的曲普瑞林粗品进行纯化的过程包括如下步骤将切肽步骤中得到的干燥的曲普瑞林粗品用醋酸水溶液溶解，过滤，滤液经过离子交换柱，收集流出主峰,然后再经过C18 (例如5 ii m)反相柱纯化，收集主峰，合并合格溶液，冻干。获得曲普瑞林精制品，可作为曲普瑞林的原料药。纯化的エ艺细节如本发明上、下文所述。在本发明中，测定氨基酸与树脂之间的偶联率可以采用重量法和比色法两种方法測定。特别是，如未另外说明，本发明上下文中测定氨基酸(特别是第一个氨基酸甘氨酸)与树脂之间的偶联率采用如下步骤所示比色法进行采用比色法的根据是脱保护的氨基酸暴露出来的氨基基团可以和专门的检测试剂发生顔色反应，这个反应是定量的，顔色的深浅和氨基基团的数量成正比。顔色的深浅可以用分光光度计测量，据此可以计算出来偶联率的数值。准确称取2-4毫克的连接了第一个氨基酸的树脂，放入EP管中，加入2-3滴冰こ酸和I毫升甲醇，洗涤后用I毫升甲醇洗涤3次。然后冻干，准确称重。加入偶联率检验专用试剂250微升，同时制空白。沸水浴反应5min，其间振荡2-3次。取出来后立即加入2. 8毫升こ醇至总体积为3毫升。充分摇匀，然后用こ醇扫基线，在570nm处测定样品和空白的吸光度。按照下列公式计算(-NH2 mmol/g) =[(样品一空白)X 体积(ml) X IO6] / (15000 X 样品重量)偶联率=ト[(-NH2mmol/gV(1000X理论交换当量)]在本发明中，可以通过測定曲普瑞林的氨基酸光学纯来考察产品的品质。曲普瑞林肽链中的十个肽中，有两个Trp氨基酸，其中ー个是D-构型，而另ー个Trp以及其它8个氨基酸均为L-型。在本发明中，如未另外说明，曲普瑞林氨基酸光学纯检测方法如下对经纯化的曲普瑞林水解后，经 CAT GmbH&Co. Chromatographie Und A nalysentechnik KG 光学纯检测各手性氨基酸的光学纯。测定本发明实施例1所得曲普瑞林精制品，结果显示除Trpタト，其它8个L-氨基酸光学纯度均大于99. 5%，这8个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0. 2%(D-Pro和D-His在0. 14 0. 18%之间，其它6个氨基酸的D-型对映体的比例均小于0. 13%)% ;并且对于精氨酸而言，其中D-型对映体的比例小于0. 1%。本发明设计的技术路线具有以下特点操作简单化，适合大規模生产，原料得到方便，收率高，成本低，生产周期短，质量稳定，所得样品符合国家药典中规定的曲普瑞林原料药的各项检测标准。极具有市场竞争力。在本发明中，使用到的一些试剂或原材料，它们的名称、来源等信息列举如下实施例与前述过程中所采用的原料列表如下
权利要求
1.曲普瑞林的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤 (a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解,过滤得滤液； (b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐,收集主峰流出液； (C)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶齐U，即得。
2.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，其中步骤(a)中 所述溶剂为醋酸水溶液； 所述醋酸水溶液为2-20% (v/v)的醋酸水溶液；和/或 溶解曲普瑞林所得溶液中曲普瑞林的浓度为O. 1-10%(w/v)。
3.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，其中步骤(b)中， 所述的离子交换柱为阳离子交换柱或阴离子交换柱)或其组合使用； 所述的离子交换柱是基质为聚羟基甲基丙烯酸酯的阳离子交换柱； 所述的离子交换柱选自Shodex IEC CM-825、Shodex IEC SP-825、Shodex IECSP-420N ;和 / 或 洗脱过程中，先用酸性溶液平衡柱子，再将样品加载到柱子上，然后再依次用碱性溶液、酸性溶液和盐溶液洗脱柱子，收集盐溶液洗脱所得的主峰流出液。
4.根据权利要求3的纯化方法，其特征在于，其中步骤(b)中， 所述的离子交换柱预先用酸性溶液例如2-20%醋酸溶液洗脱并使柱子平衡； 曲普瑞林加载到离子交换树脂中的加载量、是曲普瑞林与离子交换树脂的比率为10 200 I(mg:ml)； 将曲普瑞林加载到离子交换柱上后，用碱性溶液例如氢氧化钠溶液例如5-50mmol/L氢氧化钠溶液洗脱； 用碱性溶液洗脱至直使流出液的PH恒定后，再用酸性溶液例如2-20%醋酸溶液洗脱至直使流出液的PH恒定；和/或 用酸性溶液洗脱至直使流出液的PH恒定后，再用盐溶液例如氯化钠溶液洗脱，收集主峰流出液。
5.根据权利要求1的纯化方法，其中步骤(c)中，将步骤(b)中所得收集转化成盐型的曲普瑞林主峰流出液用乙腈稀释；将该稀释液加载到硅胶柱上，用流动相X(例如浓度为1%-10%的乙腈水溶液)洗脱；接着用流动相Y (例如浓度为10%-50%的乙腈水溶液)洗脱，收集主峰流出液；接着通过冷冻干燥除去溶剂使水分含量低于7%，得到纯化的曲普瑞林。
6.根据权利要求5的纯化方法，其特征在于，其中步骤(c)中，所述硅胶是十八烷基硅烷键合硅胶。
7.固相合成曲普瑞林的方法，其包括以下步骤 (1)向经浸泡处理的固相合成用树脂中加入溶解于溶剂中的Fmoc-Gly-OH、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Gly-树脂； (2)向上一步骤所得的肽偶合树脂中加入脱帽试剂，使物料进行反应以脱帽；接着加入溶解于溶剂中的保护氨基酸Fmoc-Ρ -ΟΗ、肽偶联剂、酰胺键形成促进剂和有机碱，使物料进行偶联反应，以形成Fmoc-Pro-Gly-树脂；(3)循环重复步骤(2)，并在每一循环操作的偶联反应中依次使用下列氨基酸以替换保护氨基酸 Fmoc-Pro-OH :Fmoc-L_Arg (pbf) -OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-trp (boc) -OH、Fmoc-L-Tyr(tBu)-0H>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L_trp(boc)-0H>Fmoc-L-His(trt)-OH和H-Pyr-OH,以最终形成十妝树脂H-Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -D-Trp (Boc) -Leu-Arg (Pbf) -Pro-Gly-树脂； (4)向步骤(3)所得十肽树脂中加入切割液进行切肽反应，以使十肽从树脂上切割下来，得到曲普瑞林；以上四个步骤进一步地可具体参见说明书第一方面任一实施方案；以及任选地，根据例如权利要求1-6任一项的纯化方法进行纯化以得到精制曲普瑞林。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于， 步骤(I)中进行偶联反应时，酰胺键形成促进剂是HOAT和HOBT两者组合使用；优选地，HOAT和HOBT 二者的用量比为1:1-4(摩尔比)，优选1:2_3(摩尔比)；和/或 步骤(2)和步骤(3)中进行偶联反应时，使用的酰胺键形成促进剂是H0AT。
9.根据权利要求7的方法，其中步骤⑶中，在第一循环操作使用Fmoc-L-Arg (pbf) -OH作为保护氨基酸进行偶联反应的过程中，与Fmoc-L-Arg (pbf) -OH 一起加入适量乳酸进行反应；在一个实施方案中，所述Fmoc-L-Arg (pbf) -OH与乳酸的摩尔比为 I 0. 1-0. 5，优选 I 0. 2-0. 3。
10.一种曲普瑞林，其特征在于 其经氨基酸光学纯检测，除了 Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于O. 2% ； 其经氨基酸光学纯检测，除了 Try以外，其它7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸而言均小于O. 15% ； 其经氨基酸光学纯检测，其中D-Arg相对于全部精氨酸而言均小于O. 2%，优选小于O.15% ； 其中乙腈含量低于O. 03% ； 甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸经氨基酸组成检测，各氨基酸的相对比值在O. 9 1.1之间；和/或 其是通过权利要求1-9任一项所述方法制备得到的。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度的曲普瑞林及其纯化方法。该高纯度的曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，7个氨基酸的D-型对映体比例相对于其相应氨基酸酸小于0.2%；D-Arg相对于全部精氨酸小于0.2%；乙腈含量低于0.03%；甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸经氨基酸组成检测，各氨基酸的相对比值在0.9～1.1之间。纯化方法包括步骤(a)将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；(b)将步骤(a)所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；(c)将步骤(b)所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。本发明方法收率高，产品质量稳定，生产成本低，操作简单，适合大生产。
文档编号C07K1/18GK103012564SQ20131001371
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者赵东明, 张明义, 张 林, 董国明, 王虎 申请人:成都天台山制药有限公司