专利名称：蜈蚣酶解物抗血栓性多肽的制作方法
技术领域：
本发明属生物化学中的多肽药物技术领域。
背景技术：
随着社会人口的老龄化和生活水平的不断提高，高血脂症、动脉粥样硬化及由之演变而来的心、脑血管血栓栓塞性疾病的发病率逐年增加。血栓性疾病是一种常见病，发病率约为千分之二，是由于血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，使主要器官发生缺血和梗塞而引起机能障碍的各种疾病。其中血液凝固、血小板聚集、红细胞压积增高等，都是形成血栓的几种直接原因。这是一类严重影响健康的疾病，市场上对于预防和治疗血栓性疾病药物的需求量呈现出逐年增长的势头。因此，治疗此类疾病的药品的研究开发就显得尤为重要。抗血检形成的重要机制包括抑制凝血系统的活化和对血小板聚集的抑制。凝血过程由于启动环节不同而分为内源性与外源性凝血两条途径，无论内源性还是外源性凝血途径最终都通过激活凝血因子使纤维蛋白原变为纤维蛋白，从而发生凝血。抑制凝血因子及纤溶作用能有效的抑制血栓的生成。检测抗血栓物质对凝血因子的抑制和纤溶活性对筛选抗血栓药物有着重要的意义。血小板对止血和血栓形成有着重要的作用，血小板聚集是血栓形成的必经途径，具有和依替巴肽类似抗血小板聚集的六肽能够抑制血小板聚集，能同时减少血栓的生成，明显的延长CT，TT, P T，PRT和APTT。血小板抑制剂能有效的抑制和治疗心血管疾病。蜈蚣中含有抗血栓组分，代龙等对蜈蚣抗血栓作用进行了研究，比较了 6种不同提取工艺对凝血酶源时间(PT)、纤溶活性(FA)、大鼠凝血时间(CT)及静脉血栓重量(TW)的影响，发现6种工艺的PT、FA、CT、TW4项指标与空白对照组相比较均有明显差异。You等从韩国产蜈蚣中分离纯化出一种具有纤维蛋白溶解活性的丝氨酸蛋白酶，scolonase，其分子量为25KD，等电点4.8。结构解析结果表明该酶由244个氨基酸组成。现代药理研究表明，动物类药材发挥作用的主要为其小肽类成分。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收人血而发挥药效，故用胃蛋白酶提取方法模拟体内消化过程，以得到蜈蚣在体内产生药效的小分子肽。本发明基于上述研究，从蜈蚣毒素中分离纯化出一个由七个氨基酸组成的多肽，通过测定其APTT和PT时间，并且通过生色底物法来确定其抗凝活性。
发明内容
本发明涉及一种对内源凝血途径和血小板抑制作用，从而抗血栓的多肽，该多肽是蜈蚣酶解，经超滤得到小分子，用凝胶层析、反相高效液相色谱分离纯化后所得。本发明所提供的蜈蚣酶解物纯化的抗血栓多肽是利用Edman降解法测得其氨基酸序列的，序列为 Asp-Leu-Asp-Hi s-Tyr-Ser-Phe。本发明所提供的蜈蚣毒素抗凝多肽，经质谱测定期分子量为895.4Da。
本发明所提供的多肽，经测试具有抗凝活性:在0.2mg/mL-lmg/mL范围内对血小板聚集的抑制作用具有剂量依赖性；在0.2mg/mL-lmg/mL范围内能延长APTT时间，也呈现剂量依赖性。
具体实施例方式1、蜈蚣酶解物抗血栓活性多肽的制备a、取70g蜈蚣，由南京先声药店提供，加入20倍量人工胃液，密闭，于37°C恒温水浴作用30min后,加入4.0 %胃蛋白酶水解4h,将酶解液置于100°C恒温水浴作用IOmin,冷却至室温，以8000r/min离心15min,取上清液，，将之前得到的产物用0.45um滤膜过滤,利用IOOOODa的滤膜将大小分子分开，冻干。b、上述溶液样品通过葡聚糖凝胶Sephadex G-50纯化,柱高100cm,直径2.6cm。用去离子水平衡后，上样lmL，流动相去离子水，流速为0.6ml/min。每管收集
4.8ml，共收集180管。根据214nm吸收值合并组分。C、活性组分C用C8-HPLC柱纯化，柱高25cm，直径0.46cm。用10%乙腈(含0.1%了 4)201^平衡后，0.2511^样品上样，先用10%乙腈(0.1%TFA) IOmL洗脱，然后用90%乙腈(0.1% TFA) 30mL进行0-30%梯度洗脱，流速为lml/min，检测波长214nm和280nm。收集活性峰c_10，冷冻干燥。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明发明范围。
:图1A为经凝胶色谱分离纯化的色谱图:活性峰为峰C。图1B为经RP-HPLC分离纯化的色谱图:活性峰为c-10。2、蜈蚣酶解物抗血栓多肽的测序本发明所提供的蜈蚣毒素抗凝多肽用Edman降解法进行测序。Edman降解法是一种对蛋白质进行测序的化学方法，是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经过层析鉴定，余下的多肽链(少了一个残基)被回收再进行下一轮降解循环。整个测序过程是通过自动测序仪进行的。本发明所提供的多肽经Edman降解法测序，序列为Asp-Leu-Asp-His—Tyr—Ser—Phe。3、蜈蚣酶解物抗血栓多肽的APTT和PT活性测定a、小鼠的摘眼球取血离心管事先用3.8%的枸橼酸钠溶液润湿，并放入约100 μ I枸橼酸钠溶液，备用；左手姆、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部；中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部，捻动拇指，轻压取血侧眼部皮肤，使眼球充血突出；用弯头镊夹取眼球；根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶以不同流速垂直流入离心管；同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度；当血液流尽时，用脱白法处死小鼠。
b、分离贫血小板血浆(PPP)将小鼠血液与枸橼酸钠溶液混合均匀，配平后放入离心机，转速为3000r/min，离心时间为15min，离心完成后，吸取上清，分离得到贫血小板血浆(PPP)。
c、APTT 和 PT 的测定APTT试剂在37°C下预热不超过15min，CaCl2溶液37°C下预温15min。每个EP管根据分别加入50 μ I的PPP>50 μ I的样品溶液、100 μ I的APTT试剂于37°C下预热3min,加入150 μ ICaCl2溶液，测定凝固时间。PT试剂预热时间不低于IOmin但不高于30min，在EP管中加入25 μ 1ΡΡΡ、25 μ I样品于37°C下预热3min，加入50 μ IPT试剂，测定凝固时间。样品的水溶液浓度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、lmg/ml,对照组为
去离子水。每个浓度测定三次。对该多肽进行APTT和PT活性的测定，蜈蚣毒素抗凝多肽能够延长APTT，对PT没有延迟作用，且呈现剂量依赖性。其结果如下:蜈蚣毒素抗凝多肽APTT活性分析
权利要求
1.一种蜈蚣酶解物中的抗血栓多肽，其特征在于以蜈蚣全虫为原材料提取，由Asp-Leu-Asp-His-Tyr-Ser-Phe 组成的七妝，分子量为 895.4Da。
2.根据权利要求1所述蜈蚣酶解物抗血栓多肽的应用，其特征在于该多肽具有抗凝作用，能够延长APTT时间，对血小`板聚集具有抑制作用，可作为在抗血栓药物制备中的应用。
全文摘要
本发明公布从蜈蚣酶解物中分离出的多肽，并对其抗血栓性进行测定。应用凝胶层析和反相高效液相色谱等分离方法从蜈蚣酶解物中分离纯化出一个由七个氨基酸组成的多肽，应用Edman降解法测得其序列为Asp-Leu-Asp-His-Tyr-Ser-Phe，质谱法测得其分子量为895.4Da。并通过测定APTT和PT，以及抗血小板聚集活性测定该多肽的抗血栓活性。本发明中的多肽延迟APTT时间，有抑制血小板聚集的作用，具有抗血栓活性，可以应用于制备抗血栓药物。
文档编号C07K7/06GK103145800SQ20131006310
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者孔毅, 李帅, 邵妤, 李志裕, 周秋梅, 何志龙 申请人:中国药科大学