专利名称：利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法
技术领域：
本发明属于微藻制备生物柴油技术新能源领域，具体的说是涉及一种利用双溶剂体系提取微藻及其提取物的综合利用方法。
背景技术：
开发可再生新能源是当今世界的热点，生物质能是其中重要的一方面，生物质是生物通过光合作用形成的，吸收利用二氧化碳，减轻温室效应，利于碳的循环利用。微藻的种类繁多，分布广泛，生长繁殖速度快，光能利用效率更高，不占用土地，环境适应能力强，是一种很有前景的生物质能源。部分微藻中的油脂含量高，可达20 40%，因此被认为是未来生物能源供应的重要原料。但是现有技术中微藻的提取方法具有溶剂毒性大、污染严重、成本高等缺点，而且现有技术中微藻的提取方法只对微藻的油脂进行提取利用，其它副产品和有机溶剂都弃之不用，不能对微藻资源进行有效的综合利用，不利于环保。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，该方法能够综合利用微藻资源来提取蛋白成分、油脂以及对剩余固体回收做饲料或肥料，经济价值高，不会造成溶剂的过大消耗和环境污染。本发明解决的技术问题是，在较低的能耗下，高效的提取微藻中的油脂，把提取出来的藻油作为制备生物柴油的原材料。同时未破坏藻细胞中蛋白的活性，并在提取分离过程中，最大化的提取微藻的蛋白成分。整个工艺过程中，可以做到极性与非极性的回收再利
用。 本发明是通过以下技术方案实现的:一种利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其包括如下步骤:
a、首先将收取的藻液进行离心收集，再经喷雾干燥处理后得到干藻粉；
b、在藻粉中加入非极性有机溶剂，将微藻粉和非极性有机溶剂(如石油醚)的混合液置于搅拌釜内，在300 500r/min的转速下进行强力搅拌，搅拌温度为30 50°C，搅拌时间30min 180 min ；
C、然后再将经过b步骤处理的混合液中加入极性有机溶剂(如乙醇)并置于搅拌釜内，在300 500r/min的转速下搅拌，搅拌温度为30 50°C,搅拌时间30min 180 min ；
d、饲料的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的下层残渣经过第一次水洗，将水洗后所得的下层固体在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65°C的条件下减压蒸馏30 60min，最后得到的剩余物质用于制备饲料或是肥料；
e、蛋白的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的上层溶液与经过第一次水洗所得的上层溶液合并在一起，并进行第二次水洗，得到的下层溶液加入硫酸钙进行盐析处理，盐析后回收蛋白成分；
f、油脂的获取步骤:将经过第二次水洗后所得的上层有机溶液在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65 的条件下减压蒸懼30 60min,最后剩余的物质即为油脂；
g、溶剂的回收步骤:将经过d步骤减压蒸馏和f步骤减压蒸馏的有机溶剂分离出来，再次回收利用。将e步骤盐析后得到的上层液体与d步骤经过第一次水洗后得到的下层固体混合后得到混合液，将混合液在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65°C的条件下减压蒸馏30 60min,最后得到的物质用于制备饲料。根据本发明的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，所述的微藻为小球藻、角毛藻、金藻中的一种或几种。根据本发明的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，所述的过程中溶剂的用量比应遵循的比列为，微藻与非极性有机溶剂和极性有机溶剂的固液质量比均为1:15 1:25，且非极性有机溶剂与极性有机溶剂的体积比为1:1。根据本发明的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种。根据本发明的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，所述的非极性有机溶剂为石油醚、正己烷或环己烷中的一种或几种。本发明的原理:基于“相似相溶”原理，藻粉与混合的提取溶剂充分接触后，其中极性溶剂与细胞膜的极性脂结合，从而破坏脂质与蛋白质分子间的氢键和静电作用，使非极性溶剂进入细胞并溶解胞内疏水的中性脂成分，充分萃取后在体系中加水，极性溶剂溶于水相而与含油脂的氯仿相分层，实现油脂的分离与提取。细胞破坏过程中，胞内亲水性的蛋白溶于水，剩余的细胞碎片还有大量的纤维素以及部分蛋白成分，整个提取工艺中温度适中，搅拌速度合理以及选择的溶剂安全，故此可以做到剩余物质的利用与回收。
本发明的有益效果是:本发明将微藻粉先加入非极性有机溶剂混合搅拌提取，再加入极性有机溶剂混合搅拌，两次搅拌于同一搅拌釜内进行，控制温度和转速。固液分离后，进行水洗，多次分离液体，进行分离，最终获得目标成分以及有机溶剂的回收。本发明综合利用微藻资源提取盐析出其中的蛋白和萃取油脂，剩余生物质可作动物饲料或肥料，其中提取分离方法简单，对设备要求不苛刻，过程利于放大。溶剂可以再次回收利用，不会造成消耗和污染。本发明对于微藻中有用物质的提取以及微藻生物能源的产业化、微藻蛋白的深加工产业化具有的重要意义。本发明利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法还具有如下优点:1、利用双溶剂体系提取微藻，综合利用被提取出的各种成分，有效地利用其中具有经济效益的成分，降低微藻制备出来的生物柴油的成本；2、可以回收有机溶剂，并分离出被再次利用，有利于有机物的回收再利用和降低成本；3、双溶剂体系提取相比现有技术中如超临界CO2、真空爆破法等方法,具有效率闻、能耗低等优点。
图1是本发明利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法的流程图。
具体实施例方式下面实施例对于本发明进行更详细的描述。需要指出，这些描述和实施例都是为了使本发明更便于理解，而非对本发明的限制。本发明的保护范围以所附的权利要求为准。
本发明中，除非另外规定规定，百分比“ ％ ”以重量计。实施例中所用的强力搅拌机型号为JB90-D，生产厂家为上海标本模型厂。实施例中所用的高速台式离心机型号为TGL-16G，生产厂家为上海安亭科学仪器厂。实施例中所用的恒温槽型号为CH3030，生产厂家为上海方瑞仪器有限公司。实施例中所用的气相色谱仪型号为FULI9790，生产厂家为上海温岭分析仪器有限公司，所用毛细管色谱柱型号为30QC3/EC20-0.5，生产厂家为SGE，Australia。实施例中所用的化学试剂均为国药集团化学试剂有限公司提供。微藻中物质提取率评价方法:
本发明中，采用“提取率”表示从微藻中提取物质的效率，具体地，油脂提取率、粗蛋白提取率通过下列公式计算:
油脂提取率=藻油质量X藻油脂肪酸含量八干藻粉质量X干藻粉中脂肪酸含量)χ100% 粗蛋白提取率=提取出蛋白质量/ (干藻粉质量X干藻粉中蛋白含量)X100%
实施例中用气相色谱法测定获取的藻油中脂肪酸含量，用凯氏定氮法测定粗蛋白的含量。实施例1:
实施例1考察工艺步骤对小球藻提取的效率。小球藻是目前培养最广泛的工程类藻种，其细胞壁较一些其他藻种细胞较厚，处理难度较大故此作为典范进行实施。所用小球藻为嘉兴泽元生物制品有限责任公司提供，具体步骤如下所示:
a、首先将微藻进行离心处理步骤，经过喷雾干燥处理后得到干藻粉；
b、取干藻粉20g向其中加入非极性有机溶剂石油醚300ml，将藻粉和非极性有机溶剂的混合液置于搅拌爸内，在500r/min的转速下进行强力搅拌,搅拌时间定为60分钟,搅拌温度设置在50°C ；
C、然后再将经过b步骤处理的混合液中加入极性有机溶剂乙醇300ml，并置于搅拌釜内，在500r/min的转速下搅拌，搅拌时间45分钟，搅拌温度设置在50°C ；
d、饲料的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的下层残渣经过第一次水洗，将水洗后所得的下层 固体在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏60min,最后得到的物质用于制备饲料；
e、蛋白的获取步骤:将经过c步骤处理 的混合液静置，将静置后得到的上层溶液与经过第一次水洗所得的上层溶液合并在一起，并进行第二次水洗，得到的下层溶液加入硫酸钙进行盐析处理，冷冻后回收蛋白成分；
f、油脂的获取步骤:将经过第二次水洗后所得的上层有机溶液在压力为0.02mpa、温度为45°C的条件下减压蒸馏30min，最后剩余的物质即为藻油；
g、溶剂的回收步骤:将经过d步骤减压蒸馏和f步骤减压蒸馏的有机溶剂分离出来，回收利用。将e步骤盐析后得到的上层液体与d步骤经过第一次水洗后得到的下层固体混合后得到混合液，将混合液在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏30min，最后得到的物质用于制备饲料。实施过程中也可以用其他的非极性或极性溶剂代替石油醚与乙醇。实施例结果见下表。实施例2:
实施例2考察工艺步骤对杜氏盐藻提取的效率。杜氏盐藻的油脂含量较高，所用杜氏盐藻为中科院武汉水生研究所提供，具体步骤如下所示:
a、首先将微藻进行离心处理步骤，经过喷雾干燥处理后得到干藻粉；
b、取干藻粉5g向其中加入非极性有机溶剂石油醚100ml，将藻粉和非极性有机溶剂的混合液置于搅拌釜内，在300r/min的转速下进行强力搅拌，搅拌时间定为45分钟，搅拌温度设置在50°C ；
C、然后再将经过b步骤处理的混合液中加入极性有机溶剂乙醇100ml，并置于搅拌釜内，在300r/min的转速下搅拌，搅拌时间45分钟，搅拌温度设置在50°C ； d、饲料的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的下层残渣经过第一次水洗，将水洗后所得的下层固体在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏60min,最后得到的物质用于制备饲料；
e、蛋白的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的上层溶液与经过第一次水洗所得的上层溶液合并在一起，并进行第二次水洗，得到的下层溶液加入硫酸钙进行盐析处理，冷冻后回收蛋白成分；
f、油脂的获取步骤:将经过第二次水洗后所得的上层有机溶液在压力为0.02mpa、温度为45°C的条件下减压蒸馏30min，最后剩余的物质即为藻油；
g、溶剂的回收步骤:将经过d步骤减压蒸馏和f步骤减压蒸馏的有机溶剂分离出来，回收利用。将e步骤盐析后得到的上层液体与d步骤经过第一次水洗后得到的下层固体混合后得到混合液，将混合液在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏30min，最后得到的物质用于制备饲料。实施过程中也可以用上述其他的非极性或极性溶剂代替石油醚与乙醇。实施例结果见下表。实施例3:
实施例3考察工艺步骤对螺旋藻提取的效率。螺旋藻的蛋白含量较高，运用广泛。所用螺旋藻为山东滨州天健生物科技有限公司提供，具体步骤如下所示:
a、首先将微藻进行离心处理步骤，经过喷雾干燥处理后得到干藻粉；
b、取干藻粉20g向其中加入非极性有机溶剂石油醚400ml，将藻粉和非极性有机溶剂的混合液置于搅拌爸内，在350r/min的转速下进行强力搅拌,搅拌时间定为45分钟,搅拌温度设置在40°C ；
C、然后再将经过b步骤处理的混合液中加入极性有机溶剂乙醇400ml，并置于搅拌釜内，在350r/min的转速下搅拌，搅拌时间45分钟，搅拌温度设置在40°C ；
d、饲料的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的下层残渣经过第一次水洗，将水洗后所得的下层固体在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏60min,最后得到的物质用于制备饲料；
e、蛋白的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的上层溶液与经过第一次水洗所得的上层溶液合并在一起，并进行第二次水洗，得到的下层溶液加入硫酸钙进行盐析处理，冷冻后回收蛋白成分；
f、油脂的获取步骤:将经过第二次水洗后所得的上层有机溶液在压力为0.02mpa、温度为45°C的条件下减压蒸馏30min，最后剩余的物质即为藻油；
g、溶剂的回收步骤:将经过d步骤减压蒸馏和f步骤减压蒸馏的有机溶剂分离出来，回收利用。将e步骤盐析后得到的上层液体与d步骤经过第一次水洗后得到的下层固体混合后得到混合液，将混合液在压力为0.04mpa、温度为65°C的条件下减压蒸馏30min，最后得到的物质用于制备饲料。实施过程中也可以用上述其他的非极性或极性溶剂代替石油醚与乙醇。实施例结果见下表:
实施例提取效率表
权利要求
1.一种利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法包括如下步骤: a、首先将微藻进行离心处理步骤，经过喷雾干燥处理后得到藻粉； b、在藻粉中加入非极性有机溶剂，将微藻粉和非极性有机溶剂的混合液置于搅拌釜内，在300 500r/min的转速下进行强力搅拌,搅拌时间30min ； C、然后再将经过b步骤处理的混合液中加入极性有机溶剂，并置于搅拌釜内，在300 500r/min的转速下搅拌,搅拌时间30min ； d、饲料的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的下层固相经过第一次水洗，将水洗后所得的下层固体在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65°C的条件下减压蒸懼30 60min,最后得到的物质用于制备饲料； e、蛋白的获取步骤:将经过c步骤处理的混合液静置，将静置后得到的上层溶液与经过第一次水洗所得的上层溶液合并在一起，并进行第二次水洗，得到的下层溶液加入硫酸钙进行盐析处理，盐析后回收粗蛋白成分； f、油脂的获取步骤:将经过第二次水洗后所得的上层有机溶液在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65°C的条件下减压蒸懼30 60min,最后剩余的物质即为粗藻油； g、溶剂的回收步骤:将经过d步骤减压蒸馏和f步骤减压蒸馏的有机溶剂分离出来，再次回收利用。
2.根据 权利要求1所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:将e步骤盐析后得到的上层液体与d步骤经过第一次水洗后得到的下层固体混合后得到混合液，将混合液在压力为0.02 0.04mpa、温度为45 65°C的条件下减压蒸懼30 60min,最后得到的物质用于制备饲料。
3.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述的微藻为小球藻、杜氏盐藻、螺旋藻、角毛藻、金藻中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述微藻与非极性有机溶剂和极性有机溶剂的固液质量比均为1:15 1:25。
5.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述非极性有机溶剂与极性有机溶剂的体积比为1:1。
6.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:在b步骤和c步骤中，两次搅拌均是在温度为30 50°C的条件下搅拌30min。
7.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述的极性有机溶剂选自甲醇、乙醇或异丙醇中的一种或几种。
8.根据权利要求1或2所述的利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，其特征在于:所述的非极性有机溶剂选自石油醚、正己烷或环己烷中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种利用双溶剂体系提取微藻获得提取物的方法，包括如下步骤将微藻进行离心、收集和喷雾干燥后，加入非极性有机溶剂，如石油醚，并倒入搅拌釜里进行搅拌，再向其中加入极性有机溶剂，如乙醇，进行物质提取。固液分离后，得到的固相进行晒干储备用作饲料原料，将上层液体与水洗液进行合并混合，静置后将所得下层水相加入硫酸钙盐析出其中的蛋白成分，其余液相回收有机溶剂。本发明利用微藻资源提取出其中的粗蛋白和萃取油脂，剩余物质可作动物饲料或肥料，其提取分离方法简单，提取效率高，对设备要求不苛刻，过程利于放大，所选用的非极性溶剂与极性溶剂均可以再次回收利用，不会造成消耗和污染，不会对操作人员产生安全隐患。
文档编号C07K1/30GK103184097SQ20131006343
公开日2013年7月3日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者黄俊超, 官芸, 杨洁, 王涛 申请人:黄俊超