专利名称：二咖啡酰奎宁酸制备方法与应用的制作方法
二咖啡酰奎宁酸制备方法与应用技术领域：
本发明属于天然产物化学技术领域。更具体地，本发明涉及二咖啡酰奎宁酸，还涉及一种由金银花叶提取二咖啡酰奎宁酸的方法，还涉及所述二咖啡酰奎宁酸的用途。背景技术：
金银花(Lonicera japonica Thunb)为忍冬科植物忍冬，我国大部分地区均产，其茎叶和花是常用的抗病原微生物、抗炎解热、保肝利胆的中药，目前主要用金银花花蕾入药，而且还作为提取绿原酸的工业原料，用量较大，价格较高。金银花叶片是生产金银花的副产品，产量很大，是花蕾的10倍左右，药源丰富，应该充分利用。金银花叶片及其粗提物在临床上及现代抑菌试验中均表现出和花蕾相当，甚至好于花蕾的抑菌效果，但现有技术对金银花叶抑菌方面的研究只是基于金银花叶的粗提物，抑菌活性目标成分不清晰，杂质多，干扰重。
梅林在“秀山金银花、叶、茎中绿原酸的检测及其抑菌作用研究”，《药物研究》，第3期(2001年)中公开检测金银花花蕾、叶片和茎的绿原酸含量，并比较了不同部位抑菌活性，结果表明金银花叶提取物有较好的抑菌效果，具较高的开发价值。武雪芬、景小琦在“金银花叶药用成 分的提取及抑菌试验”，《天然产物研究与开发》，第3期(2001年)中、赵彦杰在“金银花叶提取物的抑菌效果研究”，《食品科学》，第7期(2007年)中都对金银花叶提取物的抗菌作用进行了初步研究，比较了金银花叶粗提物及粗黄酮、酚酸的抑菌活性，没有对最佳的抑菌活性物进行追踪。李玉杰在“微粉化技术对金银花叶抑菌效果的研究”，《吉林农业科技学院学报》，第4期(2010年)中探讨了金银花叶粉碎粒度对抑菌活性物质提取效果的影响，认为金银花叶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果较强，没有涉及抑菌活性成分纯化。张宁、曹光群在“金银花叶的抑菌活性和抗氧化性研究”，《牙膏工业》第3期(2008年)中提出，金银花叶乙醇提取物抗菌谱较广，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最为显著。
食品是人类赖以生存和发展的物质基础，应当具有营养价值、安全性。近十多年随着经济日益全球化和国际食品贸易的日益扩大，由致病菌引起的重大食品安全事件屡屡发生。目前人们常使用化学防腐剂减少致病菌，尽管化学防腐剂对微生物有一定的抑制作用，但它具有一定的毒副作用，对人体健康存在潜在的危害，以我国广泛使用的食品防腐剂苯甲酸为例，苯甲酸及其钠盐因有积蕴中毒现象的报道，国际上对其使用一直存有争议，欧共体儿童保护集团认为它不宜用于儿童食品中，日本也对它的使用做出了严格限制。因此研发使用方便，效果好且无毒副作用的天然食品防腐剂已受到世界各国的普遍重视。
中草药以其独特的理念及对疾病的独特疗效而倍受世人的关注，其有效性与安全性在漫长的历史中得到了证实。将中草药用作食品防腐剂，不仅可以避免化学防腐剂的毒性危害，且病原菌不易产生耐药性，而且还可以赋予食品独特的风味，是一种深受消费者欢迎的，具有广阔前景的新型天然防腐剂。
鉴于现有食品技术存在的一些技术缺陷，针对化学防腐剂在食品保鲜中出现的问题，本发明人经过大量实验研究，终于完成了本发明。
发明内容
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。
本发明的另一个目的是提供所述的二咖啡酰奎宁酸。
本发明的另一个目的是提供所述二咖啡酰奎宁酸的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法。
该提取方法的步骤如下:
A、原料采收及预处理
6-8月份采收的金银花叶，置于电热恒温鼓风干燥箱中在温度38 42°C下鼓风干燥6 10小时，干燥的绿色金银花叶片进行粉碎，通过40目筛得到金银花叶粉。
金银花为常绿植物，一年四季均可采收叶片，5月份为金银花的盛花期，收获花以后，6 8月份天气晴好，有效成分富集，有效成分含量为一年中最高。因此，6 8月份为采收金银花叶的最佳时期。将采收的叶片均匀放于电热恒温鼓风干燥箱中，其厚度约1.5cm，于温度40°C下鼓风干燥8小时，其中的多酚类成分保持完好。本发明使用的电热恒温鼓风干燥箱例如是吴江新亿阳烘箱制造厂生产的电热恒温鼓风干燥箱。
获得绿色的干燥叶片，使用中药材加工技术领域里通常使用的粉碎设备，例如青岛迈科隆粉末技术设备有限公司生产的MZ-50中药粉碎机进行粉碎，然后使用中药材加工技术领域里通常使用的筛分设备，例如华恒机械设备有限公司生产的HH-800-2S800直筛机进行筛分，收集40目筛下金银花叶粉末，然后置于杭州汇尔仪器设备有限公司、北京兴运科诺科贸中心、北京杰韦弗有限公司销售的玻璃干燥器中保存备用。
B、有效成分提取
按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:15 20，使用55 65重量％乙醇水溶液提取溶剂，对步骤A得到的金银花叶粉在温度68 72°C的条件下加热回流提取1.5 2.5h，然后进行离心分离，得到的上清液使用旋转蒸发仪在温度52 58°C与压力0.001 0.0lMPa的条件下进行减压浓缩，其浓缩物在温度-55°C下再进行冷冻干燥，得到一种粗提物。
使用乙醇水 溶液提取溶剂提取金银花叶粉时所使用的设备是目前化工技术领域里通常使用的设备，例如衡阳市合创药机科技有限公司销售的DTQ系列多功能提取罐等设备。
旋转蒸发仪主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂，从而可以分离和纯化反应产物。旋转蒸发仪通常配备蒸馏烧瓶、回流蛇形冷凝管、恒温水槽、减压泵与接收烧瓶等。本发明使用的旋转蒸发仪是目前市场上销售的产品，例如上海羌强仪器设备有限公司销售的旋转蒸发仪。
冷冻干燥是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰升华为蒸气而除去水的干燥方法。物料可先在冷冻装置内冷冻，再进行干燥。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。冷冻干燥机是由干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵、加热/冷却装置等组成。本发明使用的冷冻干燥机是目前市场上销售的产品，例如上海市比朗仪器有限公司销售的冷冻干燥机。
优选地，步骤A得到的金银花叶粉在温度70°C的条件下加热回流提取2.0h。
C、大孔吸附树脂预处理
大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡20 28小时，让其充分溶胀，然后用无水乙醇淋洗直至得到的析出液与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，再用去离子水淋洗至无乙醇，然后依次用4 6重量％盐酸、纯水、4 6重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡,流过树脂柱,其浸泡液与树脂的体积比为2 4 ;最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性，然后浙干树脂，待用；
大孔吸附树脂是一种不含交换基团，但具有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中选择地吸附有机物，在环保、食品、医药技术等领域得到了广泛的应用。大孔吸附树脂在其内部存在一些未聚合的单体、残存的致孔剂、分散剂与引发剂等，因此在使用前需要进行预处理。
本发明使用的大孔吸附树脂是HPD500大孔吸附树脂或NKA-2大孔吸附树脂。它们都是目前市场上销售的产品，例如郑州勤实科技有限公司销售的HPD500大孔吸附树脂。
D、柱层析分离
称取25 35克在步骤B得到的粗提物溶解于18 22重量％乙醇水溶液中，让其以130 200ml/min通过5cmX60cm大孔吸附树脂层析柱进行吸附，再分别让水、40 45重量％乙醇水溶液、52 58重量％乙醇水溶液洗脱剂以流速0.8 1.2BV/h分别通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱剂的总量为4 6BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，然后进行真空浓缩，冷冻干燥，与标准物质的高效液相色谱和质谱对比确定，其52 58重量％乙醇洗脱液冻干物为二咖啡酰奎宁酸。它是一种含有3，5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸和4，5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸的混合物，即二咖啡酰奎宁酸防腐剂。
其HPLC洗脱梯度如下:
权利要求
1.一种从金银花叶片中提取二咖啡酰奎宁酸的方法，其特征在于该方法的步骤如下: A、原料采收及预处理 6-8月份采收的金银花叶，置于电热恒温鼓风干燥箱中在温度38 42°C下鼓风干燥6 10小时，干燥的绿色金银花叶片进行粉碎，通过40目筛得到金银花叶粉； B、有效成分提取按照以kg计金银花叶粉与以L计提取溶剂的比1:15 20，使用55 65重量％乙醇水溶液提取溶剂，对步骤A得到的金银花叶粉在温度68 72°C的条件下加热回流提取.1.5 2.5h，然后进行离心分离，上清液使用旋转蒸发仪在温度52 58°C与压力0.001 .0.0lMPa的条件下进行减压浓缩，浓缩物在温度_55°C下再进行冷冻干燥，得到粗提物； C、大孔吸附树脂预处理 大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡20 28小时，让其充分溶胀，然后用无水乙醇淋洗直至得到的析出液与等量蒸馏水混合后无白色浑浊现象，再用去离子水淋洗至无乙醇，然后依次用4 6重量％盐酸、纯水、4 6重量％氢氧化钠水溶液进行浸泡,流过树脂柱,其浸泡液与树脂的体积比为2 4 ;最后用大量纯水进行洗涤，洗涤至流出水为中性，然后浙干树脂，待用; D、柱层析分离 称取25 35克在步骤B得到的粗提物溶解于18 22重量％乙醇水溶液中，让其以130 200ml/min通过5cmX 60cm大孔吸附树脂层析柱进行吸附,再分别让水、40 45重量％乙醇水溶液、52 58重量％乙醇水溶液洗脱剂以流速.0.8 1.2BV/h分别通过其层析柱进行梯度洗脱，各洗脱剂的总量为4 6BV，分步收集洗脱液，采用高效液相色谱法检测其成分，合并含有相似成分的洗脱液，然后进行真空浓缩，冷冻干燥，与标准物质的高效液相色谱和质谱对比确定，其52 58重量％乙醇洗脱液冻干物为二咖啡酰奎宁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂是HPD500大孔吸附树脂或NKA-2大孔吸附树脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其HPLC洗脱梯度如下:
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色谱法在下述条件下进行检测: 色谱柱:250mmX4.6mmAlItimaC18柱，粒径5 y m ;流动相A为色谱纯乙腈，流动相B为.0.2%磷酸水溶液；柱温40°C ;流速0.7mL/min ;检测波长238nm ;灵敏度2.000AUFS ;进样量IOiiL;每个样品平行测定3次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的质谱在下述条件下进行检测: 质谱检测采用Agilent6540超高解析度四级杆-飞行时间质谱仪，离子极性，ESI(±)，扫描范围:130-800amu，干燥气流速(氮气)7L/min,干燥气温度400°C，负离子模式:S.V.:-4000V, 0.V.:-101V, F.R.V.:_380V。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述方法得到的二咖啡酰奎宁酸，其特征在于它是3，5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸与4，5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸的混合物。
7.根据权利要求6所述的二咖啡酰奎宁酸在抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌中的用途。
8.根据权利要求6所述的二咖啡酰奎宁酸作为肉品防腐剂的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于将二咖啡酰奎宁酸水或15 25重量％乙醇乙醇溶液加到肉品中，混匀进行保鲜，其二咖啡酰奎宁酸的量是所述肉品重量的0.3%。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的肉品是猪肉或鸭肉。
全文摘要
本发明涉及一种由金银花叶提取二咖啡酰奎宁酸的方法，还涉及所述二咖啡酰奎宁酸及其用途。该方法包括原料采收及预处理、有效成分提取、大孔吸附树脂预处理与柱层析分离等步骤。本发明的二咖啡酰奎宁酸对肉品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，对肉品保鲜效果好，能很好地控制肉品颜色、挥发性盐基氮、细菌总数等的变化。本发明方法使用乙醇作为提取溶剂，避免使用化学防腐剂所带来的不安全性，本方法操作简单，成本低廉，便于广泛推广使用。
文档编号C07C67/48GK103214371SQ20131013369
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日
发明者熊建华, 洪艳平, 汤凯洁, 林丽萍, 杜华英, 张清峰, 张凤英, 王文君 申请人:江西农业大学