一种合成卡贝缩宫素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种合成卡贝缩宫素的技术，解决了现有技术存在的成本高，纯度低，杂质多的问题。本发明的具体步骤为：首先，在wang树脂上依次偶联7个氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH；然后，去保护基Fmoc后，连接4-氯丁酸，裂解得到酰化的卡贝缩宫素7肽线性肽，在碱性条件下液环得到卡贝缩宫素7肽环肽粗肽，粗肽经纯化冻干后得到卡贝缩宫素7肽环肽精肽；最后，纯化冻干后的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶联，得到卡贝缩宫素。本发明提供了一种成本低、收率较高，适合规模化生产的卡贝缩宫素的合成工艺。
【专利说明】一种合成卡贝缩宫素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多肽类药物的合成方法，是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素卡贝缩宫素的合成方法。
【背景技术】
[0002]卡贝缩宫素，英名为=Carbetocin,为一种环状多肽，是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
[0003]捷克专利CS255616率先使用固相多肽合成方法合成卡贝缩宫素，具体步骤为:(I)合成 Z-1le-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-树脂，(2)裂解得到 Z-1le-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Leu-Gly-NH2, (3)氢化去保护得到 Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2, (4)Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 与 4-溴丁酸反应，得到 Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2, (5) Ile-Gln-Asn-Cys (C3H6COOH) -Pro-Leu-Gly-NH2 与 X-Tyr (Me) -OH 反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。该方法使用氢化去保护法，工业化生产设备操作安全隐患较大，同时该工艺需要多步液相合成，都需要对产物分离纯化或沉淀以便除去未反应的原料和副产物，这个 过程相当费时、繁琐，操作带来的损失非常大。总之，该方法不利于工业生产、应用价值不高。
[0004]西班牙专利ES2115543公开了一种卡贝缩宫素的制备方法，具体步骤为:(1)合成主肽链结构，N末端氨基与4-氯丁酸连接，(2)半胱氨酸巯基脱保护基团，同时断开多肽链与树脂的连接，(3)碱性条件下通过巯基的亲核进攻反应形成成硫醚键进行分子内的环化。该工艺为液相环化合成工艺，操作复杂，步骤相当费时，不利于工业生产、应用价值不高。
[0005]中国专利CN102477082 —种液相合成法合成卡贝缩宫素的方法，具体步骤为先分别合成中间体 1:4-Bromobutyryl-Tyr (me)-1le-OH、中间体 II:H-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-ome和中间体II1:H-Pro-Leu_Gly-NH2,接着中间体1、II和III在液相中缩合成未成环产品IV，最后IV在碱性条件下环化得到卡贝缩宫素。该方法为液相合成三个片段后再合成目的肽法，每次接肽以后都需要对产物分离纯化或沉淀以便除去未反应的原料和副产物，这个过程相当费时、繁琐，操作带来的损失非常大，因此不利于工业生产、应用价值不闻。
[0006]中国专利CN102260326、CN102796178、CN101555272都是通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，脱保护基，环化，得到卡贝缩宫素。该方法在合成过程中非常容易产生多甘和缺甘现象，且该方法多采用氨基树脂，价格昂贵，不适用于工业化规模生产。[0007]中国专利CN102146122通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，脱去半胱氨基酸的侧链保护基，接入溴丁酸，去末端氨基的Fmoc保护，环化，得到卡贝缩宫素。该方法合成中两次去保护，费时、繁琐，且固相环化收率不高。
[0008]现有卡贝缩宫素的固相合成过程中，由于合成步骤较多，纯度和收率不高，原料价格昂贵，不适于工业化规模生产。
[0009]本发明人用现有的合成方法，制备卡贝缩宫素，发现合成步骤较多，原料价格昂贵，纯度和收率不高，不适于工业化规模生产。为此，本发明人对卡贝缩宫素的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种卡贝缩宫素的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是:(I)选择一种合适的树脂等原料，解决氨基树脂价格昂贵、不适用于工业化生产的问题，(2)选择一种合适的工艺路线，解决卡贝缩宫素合成过程中容易出现多甘或缺甘等杂质的现象，以得到纯度和收率更高的产品(3)选择一种成本低廉且便于工业化规模生产的卡贝缩宫素的固相合成方法。
[0011]本发明的合成 路线如图1所示:如图1所示，首先在wang树脂上依次偶联上图1中所示的7个氨基酸，偶联氨基酸顺序为:Fmoc-Leu_0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1le_0H、Fmoc-Tyr (Me) -OH,去完保护基 Fmoc后，再在树脂上连接上4-氯丁酸，然后裂解得到图中的7肽线性肽，最后在碱性条件下液环得到7肽环肽片段，最后用纯化后的7肽环肽片段和H-Gly-NH2偶联，得到收率和纯度都较高的卡贝缩宫素。
[0012]本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc:荷甲氧羰基
Fmoc-AA:荷甲氧羰基保护的氨基酸
tBu:叔丁基
HOBt:1_羟基苯骈三唑
DIC:N，f - 二异丙基碳化二亚胺
Tyr(Me):酪氨酸侧链用甲基保护
Ile:异亮氨酸
Gln:谷氨酰胺
Asn:天门冬酰胺
Cys:半胱氨酸
Pro:脯氨酸
Leu:亮氨酸
Gly:甘氨酸
Trt:三苯甲基
Me:甲基
DMF:N，N' - 二甲基甲酰胺 Piperidine:六氢吡唳TFA:三氟醋酸
TIS:三异丙基硅烷
MeOH:甲醇
DCM:二氯甲烷
DMAP:4_ 二甲氨基吡啶
Kniser test检测试剂为:却三酮
DCC:N, N1-二环己基碳二亚胺
为此本发明提供一种卡贝缩宫素的合成方法，其步骤如下:
步骤1，固相合成酰化的卡贝缩宫素7肽线性肽树脂；
步骤2，去保护基Fmoc后，连接4-氯丁酸，然后裂解得到酰化的卡贝缩宫素7肽线性
肽；
步骤3，液环得到卡贝缩宫素7肽环肽粗肽，然后纯化冻干后得到卡贝缩宫素7肽环肽精妝；
步骤4，纯化冻干后的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶联，得到卡贝缩宫素。
[0013]其中，步骤I所述的固相合成方法，以低成本的wang树脂为起始原料，依次偶联 7 个氨基酸，偶联氨基酸顺序为:Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH>Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1 le_0H、Fmoc-Tyr (Me) -OH。
[0014]其中，步骤2所述去保护基Fmoc后，连接4-氯丁酸所用缩合试剂为:DIC，H0Bt，操作过程为:将4-氯丁酸和HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0-10°C，加入DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35°C下反应2小时。裂解条件为:裂解液为VTFA:VTis=95:5，裂解温度20-30°C，裂解时间2小时。
[0015]其中，步骤3所述的液环溶剂为VH2Q: Vacn=50:50,反应浓度为lmg/mL，反应温度:20-25 °C，反应液使用TEA调pH值至7_10。
[0016]其中，步骤4所述的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶联条件为:缩合试剂为:H0Bt、DCC，反应溶剂为:DMF，反应温度:在O0C反应2小时，然后在25°C反应6小时。
[0017]本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下:
1、卡贝缩宫素7肽环肽片段=H-Gly-NH2HCl:H0Bt =DCC的摩尔比的选择:
卡贝缩宫素7肽环肽片段=H-Gly-NH2 HCl:H0Bt =DCC的摩尔比为:1:1:1:1和1:1.2:1.2:1.1 ；
2、反应温度的选择:
25°C 和 35°C 和 45°C
3、反应时间的选择:
反应时间为:4小时、6小时和8小时。
[0018]为此提出了 6种实验条件:
实验条件1:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在25°C反应6小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精妝；
实验条件2:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、68.5mg (0.62 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 83.8mg (0.62mmol) H0Bt、89.6 μ I (0.62mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将127.9mg (0.62mmol) DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在25°C反应6小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精妝；
实验条件3:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在35°C反应6小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精妝；
实验条件4:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在45°C反应6小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精妝；
实验条件5:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将140.7mg(0.68mmoll)DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在25°C反应4小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精肽；
实验条件6:0.61g (0.62mmol)卡贝缩宫素7肽环肽片段、82.2mg (0.74 mmol)H-Gly-NH2.HCl 和 100.6mg (0.74mmol) HOBt、108 μ I (0.74mmol)三乙胺加入 5ml DMF 中搅拌溶解，冷却到0°C，将140.7mg(0.68mmol)DCC加入上述溶液中，在0°C反应2小时，然后在25°C反应8小时，过滤，油泵真空旋蒸除去DMF，经反相HPLC纯化、冻干后得到卡贝缩宫素精妝。
[0019]实验结果如下:
【权利要求】
1.一种合成卡贝缩宫素的方法，所述方法步骤如下: 步骤1，固相合成酰化的卡贝缩宫素7肽线性肽树脂； 步骤2，去保护基Fmoc后，连接4-氯丁酸，然后裂解得到酰化的卡贝缩宫素7肽线性肽； 步骤3，液环得到卡贝缩宫素7肽环肽粗肽，然后纯化冻干后得到卡贝缩宫素7肽环肽精妝； 步骤4，纯化冻干后的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶联，得到卡贝缩宫素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是: 其中，步骤I所述的固相合成方法，以低成本的wang树脂为起始原料，依次偶联 7 个氨基酸，偶联氨基酸顺序为:Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys (Trt) -OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -OH、Fmoc-1le_OH、Fmoc-Tyr (Me) -OH ； 其中，步骤2所述去保护基Fmoc后，连接4-氯丁酸所用缩合试剂为:DIC，HOBt，操作过程为:将4-氯丁酸和HOBt用溶剂DMF溶解，冰浴冷却温度为0-10°C，加入DIC，激活5分钟后加入到反应柱中与脱完保护的树脂进行反应，25-35°C下反应2小时，裂解条件为:裂解液为VTFA:VTis=95:5，裂解温度20-30°C，裂解时间2小时； 其中，步骤3所述的液环溶剂为VH2(): Vacn=50:50,反应浓度为lmg/mL，反应温度:20-25 0C，反应液使用TEA调pH值至7_10 ； 其中，步骤4所述的卡贝缩宫素7肽环肽片段和H-Gly-NH2.HCl偶联条件为:缩合试剂为:H0Bt、DCC,反应溶剂为:DMF，反应温度:在O0C反应2小时，然后在25°C反应6小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:固相合成时，起始树脂选用Wang树脂，降低了成本。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:先得到卡贝缩宫素7肽环肽片段，然后再将其与H-Gly-NH2.HCl偶联，有效避免了多甘和缺甘等杂质，得到高收率和高纯度的卡贝缩宫素。
【文档编号】C07K1/06GK103992390SQ201310412014
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】程丽, 杨东晖, 路杨, 周亮 申请人:杭州诺泰制药技术有限公司