采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法
【专利摘要】一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法，属于款冬酮制备【技术领域】。本发明以款冬花的干燥花蕾为原料，以三元溶剂体系为溶剂系统，经制备原料浸膏、配制三元溶剂系统和制备款冬酮产品的简单工艺而得产品。本发明具有工艺简单，节省溶剂，缩短生产周期，生产成本低，能提高产品的分离效率和产品的纯度，稳定性和重现性较好，制备量大等特点。本发明可广泛应用于从款冬花中快速分离出款冬酮产品，特别解决了开展药理药效实验研究中在实验室批量制备款冬酮单体产品的难题。
【专利说明】采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于款冬酮制备【技术领域】，具体涉及利用高速逆流色谱仪，采用可调三元溶剂体系从款冬花中快速分离款冬酮的制备方法。
【背景技术】
[0002]款冬花来源于菊科植物款冬花(Tussilago farfara L)的干燥花蕾，是一种常用中药，具有润肺下气，化痰止咳等功效。款冬花含有萜类、黄酮类、生物碱类、挥发油类等多种化学成分。款冬酮是一种倍半萜类化合物，是款冬花的特有成分，是款冬花植物质量控制的专属性指标成分，具有升压、呼吸兴奋、提高心肌收缩率、抗血小板聚集等作用。款冬酮(Tussilagone)的分子式:C23H3405，分子量:390.52，为无色棱晶。
[0003]高速逆流色谱技术(High-SpeedCountercurrent Chromatography, HSCCC)是近年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术。该技术能保证较高峰型分辨率，具有操作简便，分离量大，样品无损耗，分离效率高，理论回收率为100%，重现性好和分离环境缓和等优点，现已广泛应用于生物、医药等领域化学物质的制备分离和纯化。
[0004]现在从款冬花中分离款冬酮的方法，如2011年34卷第5期《Quim Nova》的“(PREPARATIVE SEPARATION AND PURIFICATION OF SESQUITERPENOIDS FROM Tussilagofarfara L.BY HIGH-SPEED COUNTER CURRENT CHROMATOGRAPHY) ”，公开的方法为:以款冬花的干燥花蕾为原料，石油醚为提取溶剂，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的四元溶剂系统，经提取、溶剂系统的配制、分离、纯化等工艺步骤，分离时间7小时，得到32mg纯度为99.5%的款冬酮。该方法的主要缺点是:①采用四元溶剂系统，该溶剂系统较为复杂，平衡耗时较长，制备周期长，不利于款冬酮的快速分离制备产品分离时间较长，且溶剂消耗量大，提高了制备成本；③该提取方法及溶剂系统分离制备款冬酮的效率较低，产品产量少，不利于批量制备款冬酮，增加了制备成本。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有从款冬花中分离款冬酮方法的不足，提供一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法，具有分离产品纯度高、制备量大、操作简单、分离时间短，制备成本低、便于批量制备等特点，是从款冬花中快速分离并纯化得到款冬酮的理想方法。
[0006]实现本发明目的之技术方案是一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮方法，以款冬花的干燥花蕾为原料，以三元溶剂体系为溶剂系统，经过制备原料浸膏、配制三元溶剂系统和制备款冬酮产品的简单工艺而得产品。所述方法的具体步骤如下:
[0007](I)制备原料浸膏
[0008]以款冬花的干燥花蕾为原料，以石油醚为提取溶剂。先将原料放入粉碎机中进行粉碎，并经50~100目的铁筛过筛，收集过筛的原料粉末,未过筛的原料再放入粉碎机中粉碎。然后按原料粉末的质量(g):石油醚的体积(HiL)之比为1:5~10的比例，将原料粉末和石油醚溶剂放置于超声提取器中，在超声功率为300~500W、超声工作频率为30~50KHZ条件下，进行超声提取，然后将提取液过滤，分别收集滤液和滤渣。再按滤渣的质量:石油醚的体积之比为Ig:5~IOmL的比例，将滤渣和石油醚溶剂加入超声提取器中提取，再在超声功率为300~500W、超声工作频率为30~50KHZ条件下，进行超声提取，然后将提取液过滤，再分别收集滤液和滤渣，如此重复I~3次，每次提取均为0.5~2小时。最后合并滤液，并将最后收集的滤液放置于旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，就制备出原料浸膏I ;将最后收集的滤渣经发酵等处理后可作为绿色农肥产品原料。
[0009](2)配制三元溶剂体系
[0010]第(I)步完成后，以A和B及C三个组分为原料，其中:A组分为石油醚或正己烷；B组分为甲醇；C组分为水，按照A组分:B组分:C组分的体积之比1:1.3~1.5:0.2~0.5的比例，将A、B、C三个组分放置于容器中，搅拌混合均匀后，就制备出高速逆流色谱可调三元溶剂体系。然后，再将所述的三元溶剂体系放置于分液漏斗中，静置分层12~24小时，待上下相平衡后，分别收集上相和下相，备用。
[0011](3)制备款冬酮
[0012]第⑵步完成后，先以第⑴步制备出的原料浸膏I为待溶解样本，以第⑵步收集的下相溶剂为溶剂，按照所述待溶解样本的质量(g):所述溶剂的体积(HiL)之比为1:30~40的比例，将所述的待溶解样本加入到所述的溶剂中，搅拌至完全溶解为止，就制备出分离样品II。然后，以第(2)步收集的上相为固定相，并通过泵以20~25mL/min的流速泵入整个逆流色谱仪中的色谱柱中，以第(2)步收集的下相为流动相，在高速逆流色谱仪的转速为750~900rpm/min和温度为20~30°C的恒温条件下，将所述的流动相以2~3mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待检测信号平稳即系统平衡后由进样阀进分离样本II，进行高速逆流色谱分离。最后，根据检测器图谱，从高速逆流色谱仪的出口收集目的组分，放置于冷冻干燥箱中，低温冷冻干燥，就制备到款冬酮产品。
[0013]本发明采用上述技术方案后，主要有以下的优点及有益效果:
[0014]1.本发明方法快速分离制备款冬酮，是以款冬花干燥花蕾为原料，对其进行石油醚提取，再通过溶剂配置，最后通过高速逆流技术进行分离制备得款冬酮。制备工艺简单，整个制备过程中节省溶剂，产品收率较高，因此，生产成本低，便于推广应用，可实现产物的批量制备；
[0015]2.本发明直接采用超声法用石油醚提取，能降低大极性成分的干扰和影响，也能提高提取效率；实现了采用高速逆流色谱法对款冬酮的分离与纯化一体化，提高了分离效率；
[0016]3.本发明采用三元溶剂体系，降低四元溶剂的复杂程度，缩短了溶剂系统的平衡时间，降低了分离制备时间，能将分离时间控制在2.5h以内完成，因此缩短了生产周期，进一步降低了生产成本；
[0017]4.本发明方法的制备量大，单次制备量可达到SOmg以上，并能连续进样分离，能实现了实验室大量分离制备产品的目的，便于小批量制备；
[0018]5.采用本发明方法制得的产品纯度高，单次制备纯度可达98%以上，此纯度已满足开展药理药效研究或实验室制备单体标准品的要求，制得产品可直接作为款冬酮的标准品使用；该方法稳定性和重现性都比较好；
[0019]6.采用可调三元溶剂系统快速批量分离制备款冬酮，对款冬花的开发和医用具有重要的意义，采用本发明方法，样品在分离纯化处理过程中无损失。
[0020]本发明可广泛应用于从款冬花中快速分离出较大量款冬酮产品，特别解决了开展药理药效研究或药物研发中在实验室批量制备单体样本的难题。
【具体实施方式】
[0021]下面结合【具体实施方式】，进一步说明本发明。
[0022]实施例1
[0023]一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法的具体步骤如下:
[0024](I)制备原料浸膏
[0025]以款冬花的干燥花蕾为原料，以石油醚为提取溶剂。先将原料放入粉碎机中进行粉碎，并经80目的铁筛过筛，收集过筛的原料粉末，未过筛的原料再放入粉碎机中粉碎。然后按原料粉末的质量(g):石油醚的体积(mL)之比为1:5的比例，将500g原料粉末和石油醚溶剂放置于超声提取器中，在超声功率为500W、超声工作频率为40KHZ条件下，进行超声提取，然后将提取液过 滤，分别收集滤液和滤渣，再按滤渣的质量(g):石油醚的体积(mL)之比为1:5的比例，再将滤渣和石油醚溶剂加入超声提取器中提取，再在超声功率为500W、超声工作频率为40KHZ条件下，再进行超声提取，然后将提取液过滤，再分别收集滤液和滤渣，如此重复3次，每次提取均为2.0小时，最后合并滤液。将最后收集的滤液放置于旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，就制备出原料浸膏111.80g ;
[0026](2)配制三元溶剂体系
[0027]第⑴步完成后，以A和B及C三个组分为原料，其中:A组分为正己烷；B组分为甲醇；C组分为水，按照A组分:B组分:C组分的体积之比1:1.4:0.4的比例，将A、B、C三个组分放置于容器中，搅拌混合均匀后，就制备出高速逆流色谱可调三元溶剂体系。然后，再将所述的三元溶剂体系放置于分液漏斗中，静置分层24小时，待上下相平衡后，分别收集上相和下相，备用。
[0028](3)制备款冬酮
[0029]第⑵步完成后，先以第⑴步制备出的原料浸膏I为待溶解样本，以第⑵步收集的下相溶剂为溶剂，按照所述待溶解样本的质量(g):所述溶剂的体积(HiL)之比为1:30的比例，将所述的待溶解样本加入到所述的溶剂中，搅拌至溶解为止，就制备出分离样品
II。然后，以第(2)步收集的上相为固定相，并通过泵以25mL/min的流速泵入整个逆流色谱仪中的色谱柱中，以第(2)步收集的下相为流动相，在高速逆流色谱仪的转速为SOOrpm/min和温度为25°C的恒温条件下，将所述的流动相以2.5mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待检测信号平稳即系统平衡后由进样阀进分离样本II，进行高速逆流色谱分离。最后，根据检测器图谱，从高速逆流色谱仪的出口收集目的组分，放置于冷冻干燥箱中，低温冷冻干燥，就制备到款冬酮产品。
[0030]实施例2
[0031]一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法，同实施实例1，其中:
[0032]第(I)步中:款冬花干燥花蕾经过粉碎机粉碎，经过100目铁筛过筛。然后按原料粉末的质量(g):石油醚的体积(HiL)之比为1:8的比例，将500g原料粉末和石油醚溶剂放置于超声提取器中，在超声功率为400W、超声工作频率为35KHZ条件下，进行超声提取4次，每次提取0.5小时。最后制备出原料浸膏112.80g ；
[0033]第⑵步中:以A组分为石油醚；B组分为甲醇《组分为水，按照溶剂体积之比为1:1.3:0.2的比例配制，之后静置分层18小时。
[0034]第(3)步中:所述待溶解样本质量(g)与所述溶剂的体积(mL)之比为1:35。通过泵将固定相以20mL/min流速泵入整个逆流色谱仪中的色谱柱，然后流动相在温度为30°C的恒温和高速逆流色谱仪转速为900rpm/min转速的条件下，以2mL/min流速泵入高速逆流色谱仪。
[0035]实施例3
[0036]一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法，同实施实例1，其中:
[0037]第(I)步中:款冬花干燥花蕾经过粉碎机粉碎，经过50目铁筛过筛。然后按原料粉末的质量(g):石油醚的体积(mL)之比为1:10的比例，将400g原料粉末和石油醚溶剂放置于超声提取器中，在超声功率为300W、超声工作频率为50KHZ条件下，进行超声提取3次，每次提取1.5小时。最后制备出原料浸膏111.32g ；
[0038]第⑵步中:以A组分为正己烷；B组分为甲醇《组分为水，按照溶剂体积之比为1:1.5:0.5的比例配制，之后静置分层12小时。
[0039]第(3)步中:所述待溶解样本质量(g)与所述溶剂的体积(mL)之比为1:40。通过泵将固定相以22mL/min流速泵入整个逆流色谱仪中的色谱柱，然后流动相在温度为20°C的恒温和高速逆流色谱仪转速为750rpm/min转速的条件下，以3.0mL/min流速泵入高速逆流色谱仪。
[0040]实验结果
[0041]用实施例1所制备出的款冬酮产品，进行了称重和HPLC测定款冬酮纯度实验。
[0042]实验方法:
[0043]1、将制备出的款冬酮产品，经低温冷冻干燥后，用电子天平精确称量为97mg。
[0044]2、取冷冻干燥后并称重的款冬酮产品,用甲醇溶解后,作为高效液相色谱(HPLC)供试品。HPLC检测条件:安捷伦1260型，以SB-C18柱为色谱分离柱，洗脱溶剂:甲醇_水=85:15，流速:lmL/min，检测波长:220nm，柱温:25°C;按照上述条件设定HPLC参数，用微量进样器吸取20 y L供试品注入HPLC仪，采用DAD检测器进行全波长扫描，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算款冬酮产品峰面积占总面积的百分率，从而计算出款冬酮产品的纯度为。
[0045]款冬酮峰面积19896.9，总色谱峰面积为20152，计算得:
【权利要求】
1.一种采用可调三元溶剂体系快速分离款冬酮的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下: (1)制备原料浸膏 以款冬花的干燥花蕾为原料，以石油醚为提取溶剂，先将原料放入粉碎机中进行粉碎，并经50~100目的铁筛过筛，收集过筛的原料粉末，未过筛的原料再放入粉碎机中粉碎，然后按原料粉末的质量:石油醚的体积之比为Ig:5~IOmL的比例，将原料粉末和石油醚溶剂放置于超声提取器中，在超声功率为300~500W、超声工作频率为30~50KHZ条件下，进行超声提取，然后将提取液过滤，分别收集滤液和滤渣，再按滤渣的质量:石油醚的体积之比为Ig:5~IOmL的比例，再将滤渣和石油醚溶剂加入超声提取器中提取，再在超声功率为300~500W、超声工作频率为30~50KHZ条件下，再进行超声提取，然后将提取液过滤，再分别收集滤液和滤渣，如此重复I~3次，每次提取均为0.5~2小时，最后合并滤液，并将最后收集的滤液放置于旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，就制备出原料浸膏I ; (2)配制三元溶剂体系 第(I)步完成后，以A和B及C三个组分为原料，其中:A组分为石油醚或正己烷，B组分为甲醇，C组分为水，按照A组分:B组分:C组分的体积之比1:1.3~1.5:0.2~0.5的比例，将A、B、C三个组分放置于容器中，搅拌混合均匀后就制备出高速逆流色谱可调三元溶剂体系，然后，再将所述的三元溶剂体系放置于分液漏斗中，静置分层12~24小时，待上下相平衡后，分别收集上相和下相； (3)制备款冬酮 第(2)步完成后，先以第(I)步制备出的原料浸膏I为待溶解样本，以第(2)步收集的下相溶剂为溶剂，按照所述待溶解样本的质量:所述溶剂的体积之比为Ig:30~40mL的比例，将所述的待溶解样本加入到所述的溶剂中，搅拌至溶解为止，就制备出分离样品II，然后，以第(2)步收集的上相为固定相，并通过泵以20~25mL/min的流速泵入整个逆流色谱仪中的色谱柱中，以第(2)步收集的下相为流动相，在高速逆流色谱仪的转速为750~900rpm/min和温度为20~30°C的恒温条件下,将所述的流动相以2~3mL/min流速泵入高速逆流色谱仪，待检测信号平稳即系统平衡后由进样阀进分离样本II，进行高速逆流色谱分离，最后，根据检测器图谱，从高速逆流色谱仪的出口收集目的组分，放置于冷冻干燥箱中，低温冷冻干燥，就制备到款冬酮产品。
【文档编号】C07C67/48GK103524342SQ201310503497
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】徐溢, 曹坤, 张庆, 韩聪聪 申请人:重庆大学