Deae柱层析提纯尿促性素的技术方法
【专利摘要】本发明公开了采用DEAE柱层析提纯尿促性素的技术方法，其特征是绝经期妇女的尿液通过高岭土吸附、乙酸铵盐溶、协和树脂吸附得到尿促性素协和品，然后将尿促性素协和干粉按比例溶于配好的缓冲液中，通过DEAE树脂吸附的方法对尿促性素进一步纯化。具体步骤包括缓冲液配制、DEAE吸附、洗涤、洗脱、沉淀、干燥得尿促性素。此技术通过DEAE柱层析法提纯得到的尿促性素，其效价能够达到350iu/mg。
【专利说明】DEAE柱层析提纯尿促性素的技术方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，利用柱层析可将混合物中各组分分离的特性，将绝经期妇女尿液经过高岭土吸附、乙酸铵盐溶、协和树脂吸附得到的尿促性素协和品，再经过上样、洗涤、洗脱、沉淀、干燥等步骤提纯得到尿促性素柱分离中间品。
【背景技术】
[0002]尿促性素(HMG)是由人脑下垂体前叶部分分泌的一种糖蛋白促性腺激素，一般是从绝经期或绝经期后妇女的尿液中经提取纯化而制得。妇女在行经期间HMG的含量有所波动，但较低，只有妇女进入绝经期或之后的十几年中，其尿中HMG的含量方达到高峰(60-100iu/L尿)，并能维持在一个稳定的水平上，HMG含有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)，其所含比例近似1:1。临床主要用于治疗妇女因功能性不排卵所致的不育症；男性因激素水平低下所引起的精子过少或活力不足。另外，还用于治疗诸如妇女闭经、月经不调、男女性机能失调等症。
[0003]1928年Ascbheim首先报道了从更年期妇女尿液中发现了活性物质，之后报道虽不少，但真正对HMG的了解和制备，是从20世纪60年代的Donimi开始，并逐渐形成比较规范化的工艺来制备的。我国从20世纪70年代开始研究，80年代正式进入临床试验阶段，90年代开始大量生产。
[0004]在实际生产中，由于尿促性素协和干粉中组分较多，利用柱层析可将杂质成分去除，保留有效组分。
【发明内容】
[0005]本发明提出的DEAE柱层析提纯尿促性素的具体方法，包括以下步骤:
[0006]1、溶液的配制:
[0007]①0.02-0.09mol/L Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7.5):称取 Tri s-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调PH7.5 ;
[0008]②0.1-0.5mol/L Tris-HCl 洗脱液(ρΗ7.5):称取 Tris-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调PH7.5。
[0009]2、DEAE-Cellulose 树脂处理；
[0010]①将DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来,装入桶中，用纯化水浸没搅匀,静止I小时，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没过夜；
[0011]②将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5mol/L HCl浸没，搅拌I小时，过滤，用纯化水洗至中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡，搅拌I小时，过滤，再用纯化水洗至中性；
[0012]③将树脂滤干，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl缓冲液(ρΗ7.5)反复平衡到ρΗ7.5
后，用缓冲液浸没，待用；
[0013]④将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准
[0014]3、上样:
[0015]在2-15°C条件下，将尿促性素协和干粉按1-3 =100-300倍比例(Kg:L)溶解于0.02-0.09mol/L的Tris-HCl缓冲液中搅拌溶解；上样:流速控制在50_55ml/min。
[0016]4、洗涤:
[0017]上样结束后，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液洗涤至流出液OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.25以下，流速控制在60ml/min左右。
[0018]5、洗脱:
[0019]用0.1-0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.5)洗脱，流速控制在 70ml/min 左右，洗脱至流出OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.35以上，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.35以下，停止收集流出液。
[0020]6、沉淀:
[0021]计量流出收集液体积，转入不锈钢桶内，加入5倍量(V/V)95%冷乙醇，用搅拌棒搅拌均匀，然后置低温间沉淀过夜。
[0022]7、干燥:
[0023]弃去桶内的上清液，沉淀物置入离心机中离心30分钟，弃去上清液；沉淀物用适量的无水乙醇脱水，离心弃去上清液，重复两次；最后，将沉淀物置于五氧化二磷做吸水剂的真空干燥箱内干燥，干燥后得柱分离干燥品。
[0024]本发明公开了采用DEAE柱层析提纯尿促性素的技术方法，其特征是经过将处理的DEAE-Cellulose树脂装入柱子内，然后将尿促性素协和干粉按比例溶于配好的缓冲液中，然后经过上样、洗涤、洗脱、沉淀、干燥得柱分离干燥品。此技术通过柱层析将尿促性素中间品各组分分离开来，从而去除杂质，达到纯化尿促性素的目的。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]1、溶液的配制:
[0027]①0.05mo 1/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5):称取Tris-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调PH7.5。
[0028]②0.2mol/L Tris-HCl洗脱液(pH7.5):称取Tris-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调PH7.5。
[0029]2、DEAE-Cellulose 树脂处理；
[0030]①将DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静止I小时，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，纯化水浸没过夜。
[0031]②将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用
0.5mol/L HCl浸没，搅拌I小时，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5mol/L NaOH浸泡，搅拌I小时，过滤，再用纯化水洗至中性。
[0032]③将树脂滤干，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)反复平衡到pH7.5后，用缓冲液浸没，待用；
[0033]④将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.05mol Tris-HCl (pH7.5)缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准[0034]3、上样
[0035]在8-10°C条件下，将尿促性素协和干燥品18g溶于1800ml的0.05mol/LTris-HCl缓冲液(PH7.5)中，搅拌使其溶解；上样，流速控制在50-55ml/min。
[0036]4、洗涤
[0037]上样结束后，用0.05mol Tris-HCl (ρΗ7.5)缓冲液洗涤至流出液OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.25，流速控制在60ml/min。
[0038]5、洗脱
[0039]用0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(ρΗ7.5)洗脱，流速控制在70ml/min，洗脱至流出OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.37，滴加乙醇变浑浊后，开始收集流出液，直到OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.34，停止收集流出液。
[0040]6、沉淀
[0041]量出流出收集液体积，转入不锈钢桶内，加入5倍量(V/V)的95%冷乙醇，用玻璃棒搅拌沉淀，然后置冷库沉淀过夜。
[0042]7、干燥
[0043]次日，弃去桶内的上清液，然后离心30分钟，弃去上清液；再用少量的无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复两次；最后，将沉淀物置于用五氧化二磷做吸水剂的真空干燥箱内干燥，干燥后得柱分离干燥品9.0g。
[0044]经检测，最后得到的尿促性素柱分离干燥品效价为356iu/mg。
[0045]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容、依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.DEAE-Cellulose柱层析提纯尿促性素的技术方法，其特征在于，绝经期妇女的尿液经过高岭土吸附、乙酸铵盐溶、协和树脂吸附得到尿促性素协和品，将尿促性素协和品干粉溶解于配好的缓冲液中，经DEAE吸附、洗涤、洗脱、沉淀、干燥得尿促性素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)溶液的配制；
(2)DEAE-Cellulose 树脂处理； (3)DEAE树脂吸附:绝经期妇女的尿液经过高岭土吸附、乙酸铵盐溶、协和树脂吸附，得到的尿促性素协和品，溶解于0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液，流经装有DEAE树脂柱，吸附； (4)吸附结束后，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液洗涤树脂柱； (5)用0.1-0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)缓冲液洗脱，收集脱附液； (6)脱附液用乙醇沉淀； (7)离心、无水乙醇脱水，干燥即得。
3.根据权利要求书2(1)所述的方法，其特征在于，0.02-0.09mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5):称取Tris-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调pH7.5 ；0.1-0.5mol/L Tris-HCl洗脱液(pH7.5):称取Tris-HCl，量取纯化水，搅拌溶解，用盐酸调pH7.5。
4.根据权利要求书`2(2)所述的方法，其特征在于，①将柱内DEAE-Cellulose树脂用纯化水反冲下来，装入桶中，用纯化水浸没搅匀，静止I小时，倾去上清液及细小颗粒，反复三次，用纯化水浸没过夜； ②将DEAE-Cellulose树脂滤干，用少量纯化水洗涤，滤干后，装入桶中，用0.5mol/LHCl浸没，搅拌I小时，过滤，用纯化水洗至中性，再分别用0.5mol/L NaOH浸泡，搅拌I小时，过滤，再用纯化水洗至中性； ③将树脂滤干，用0.02-0.09mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)反复平衡到pH7.5后，用缓冲液浸没，待用； ④将上述平衡好的树脂装入柱内，柱装好后，再用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)缓冲液走柱，以流出液的pH近7.5为标准。
5.根据权利要求书2(3)所述的方法，其特征在于，在2-15°C条件下，将尿促性素协和品按1-3:100-300倍比例(Kg:L)溶解于0.02-0.09mol/L的Tris-HCl缓冲液中；流经0￡八￡树脂柱进行吸附。
6.根据权利要求书2(4)所述的方法，其特征在于，吸附结束后，用0.02-0.09mol/LTris-HCl (pH7.5)缓冲液洗涤至流出液OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.25以下。
7.根据权利要求书2(5)所述的方法，其特征在于，用0.1-0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)洗脱，洗脱至流出OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.35以上，开始收集洗脱液，直到OD值(375nm处，紫外吸光光度值)在0.35以下，停止收集洗脱液。
8.根据权利要求书2(6)所述的方法，其特征在于，计量洗脱液体积，加入5倍量的95%冷乙醇沉淀。
9.根据权利要求书2(7)所述的方法，其特征在于，离心后，沉淀物用适量的无水乙醇脱水两次，真空干燥得尿促性素。
【文档编号】C07K14/59GK103665146SQ201310648024
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】刘乃山, 刘君, 葛翠凤, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司