多特异性抗体的制作方法

多特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及二价多特异性抗体，尤其是结合人HER1、人HER2和人HER3的二价三特异性抗体、其制备和用途。
【专利说明】多特异性抗体
[0001] 本发明涉及新的二价多特异性抗体，尤其是三特异性或四特异性抗体，尤其是结 合人HER1、人HER2和人HER3的二价三特异性抗体、其制备和用途。
[0002] 发明背景
[0003] 改造的蛋白质，如能够结合两个不同抗原的双特异性抗体为本领域所知。可以使 用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生此类双特异性结合蛋白质。
[0004] 最近过去的几年，已经开发了多种多样的重组双特异性抗体形式，例如通过 融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体（参见例如Coloma, M. J.， 等，Nature Biotech.15 (1997) 159-163 ;TO 2001/077342 ;和 Morrison, S. L.，Nature Biotech.25(2007)1233-1234。
[0005] 还开发了若干能够结合两个或多个抗原的其他新的形式，其中不再保留抗体核 心结构（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM),如二抗体、三抗体或四抗体、微抗体（minibody)、若 干单链形式（scFv、Bis-scFv)(Holliger，P.，等，Nature Biotech. 23(2005) 1126-1136; Fischer, N.，和 L6ger，0?，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ;Shen，J.，等，J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74 ;Wu，C.，等，Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297)。
[0006] 所有这些形式都使用接头来将抗体核心（IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)与其他 结合蛋白质（例如scFv)融合或者融合例如两个Fab片段或scFv (Fischer, N.，和 L6ger，0?，Pathobiology 74 (2007) 3-14)。尽管接头对改造双特异性抗体具有优势是显而 易见的，但是它们还可能在治疗背景中引起问题。事实上，这些外来肽可能引发针对接头本 身或蛋白质与接头之间的连接免疫应答。此外，这些肽的柔性性质使得它们更易于被蛋白 水解切割，可能导致差的抗体稳定性、聚集和增加的免疫原性。此外，可能希望通过维持与 天然发生的抗体的高度相似性来保留通过Fc部分介导的效应子功能，如例如补体依赖性 细胞毒性（CDC)或抗体依赖性细胞毒性（ADCC)。
[0007] 因此，理想的是，目标应该是开发这样的双特异性抗体，其与天然发生的抗体（像 IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)在一般结构上非常相似，与人序列具有最小的偏差。
[0008] WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253 ;W02009/080254 和 Schaefer,等，PNAS 108 (2011) 11187-11192 涉及双特异性二价抗体。
[0009] WO 2008/027236 ;W0 2 0 10 / 1 08 1 2 7 和 Bo s t r om, J.，等，Science 323 (2009) 1610-1614涉及使可变重链和轻链结构域VH和VL多样化以引入二元特异性 的方法。WO 2010/136172涉及三特异性或四特异性抗体，然而其是三价或四价的，WO 2007/146959涉及全细胞型（pan-cell)表面受体特异的治疗。
[0010] 该技术不适合作为容易地开发针对具有IgG样结构和IgG样分子量的三种或四种 抗原的重组多特异性抗体的基础。迄今为止，产生这样的二价三特异性或四特异性抗体是 不可能的，所述抗体与天然发生的二价抗体具有相似的结构，但没有其他融合的结合结构 域。
[0011] 发明概沭
[0012] 本发明涉及多特异性抗体，其包含：
[0013] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0014] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0015] 或
[0016] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0017] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0018] 或
[0019] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0020] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0021] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述抗体是二价三特异性或四特异 性抗体。
[0022] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述抗体是三特异性的并包含
[0023] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0024] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0025] 或
[0026] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0027] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0028] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于
[0029] 在A)的情况下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ; 或
[0030] 在B)的情况下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0031] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于
[0032] 在A)的情况下，第一抗原是人HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ; 或
[0033] 在B)的情况下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0034] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述抗体是四特异性的并包含
[0035] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0036] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0037] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中，可 变域VL和VH被彼此替换；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0038] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）可变域VL和VH被彼此替换，
[0039] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0040] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于
[0041] a)的全长抗体的重链的CH3结构域与b)的全长抗体的修饰重链的CH3结构域各 自在这样的界面处相遇，所述界面在抗体CH3结构域之间包含原始界面；
[0042] 其中改变所述界面，以促进三特异性抗体或四特异性抗体的形成，
[0043] 其中所述改变的特征在于：
[0044] i)改变一条重链的CH3结构域，
[0045] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到另一条重链的CH3结构域的原始界 面的一条重链的CH3结构域的原始界面内，
[0046] 氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在定位在另一条重链的 CH3结构域的界面内的腔中的一条重链的CH3结构域的界面内产生隆凸，
[0047] 和
[0048] ii)改变另一条重链的CH3结构域，
[0049] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到第一个CH3结构域的原始界面的第 二个CH3结构域的原始界面内，
[0050] 氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二个CH3结构域的 界面内产生腔，在所述第二个CH3结构域的界面内定位了第一个CH3结构域的界面内的隆 凸。
[0051] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于
[0052] 具有较大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、 色氨酸（W)，并且具有较小侧链体积的所述氨基酸残基选自丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸 (T)、缬氨酸（V)。
[0053] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于通过引入半胱氨酸（C)作为在每个 CH3结构域的相应位置中的氨基酸来进一步改变两个CH3结构域，从而能够在两个CH3结构 域之间形成二硫键。
[0054] 本发明的其他实施方案是制备本发明的多特异性抗体的方法，
[0055] 其包括步骤
[0056] a)用包含这样的核酸分子的载体转化宿主细胞，所述核酸分子编码
[0057] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0058] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0059] 或
[0060] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0061] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0062] 或
[0063] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0064] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0065] b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和
[0066] c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
[0067] 本发明进一步包含编码本发明的多特异性抗原结合蛋白质的核酸。
[0068] 本发明进一步包含这样的载体，其包含编码本发明的多特异性抗原结合蛋白质的 核酸。
[0069] 本发明的其他实施方案是宿主细胞，其包含
[0070] _包含这样的核酸分子的载体，所述核酸分子编码
[0071] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；
[0072] 和
[0073] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0074] 或
[0075] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0076] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0077] 或
[0078] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0079] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0080] 本发明的其他实施方案是组合物，优选本发明抗体的药物组合物或诊断组合物。+
[0081] 本发明的其他实施方案是包含本发明的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂 的药物组合物。
[0082] 本发明的其他实施方案是用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患 者施用治疗有效量的本发明的抗体。
[0083] 这是第一次提供了具有IgG样结构和IgG样分子量的针对三个或四个抗原的多特 异性抗体。
[0084] 根据本发明，可以通过仅在两条全长抗体臂的一对重链和轻链（HC/LC)中替换某 些结构域（例如替换/交换VH结构域和VL结构域，或替换/交换CHl结构域和CL结构域； 或替换/交换VH和CHl结构域以及VH和VL结构域）来提高想要的多特异性抗体相比于 不想要的副产物的比例。如此，可以减少产生不想要的功能异常副产物的轻链与错误重链 的不想要的错配（VH1与VH2和/或VH2与VH1的错配）（参见图3)。
[0085] 附图描沭
[0086] 图1 :特异性结合第一抗原1的无CH4结构域的全长抗体的图示结构，具有包含典 型顺序的可变域和恒定域的两对重链和轻链。
[0087]图2a_d :本发明不同的三特异性或四特异性抗体的图示结构，所述抗体的特征在 于替换全长抗体轻链/重链中的VL/VH结构域和/或CL/CH1结构域，以防止轻链和重链错 配（CH3结构域没有或有额外的突起进入孔的修饰）
[0088] 图2a :三特异性抗体，其包含
[0089] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链（例如具有多样化 的VH1和VL1);和
[0090] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链（具有VH2和VL2)，其 中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0091] 图2b :三特异性抗体，其包含
[0092] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链（例如具有多样化 的VH1和VL1);和
[0093] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链（具有VH2和VL2)，其 中可变域VL和VH被彼此替换并且恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0094] 在两条重链中具有示例性CH3修饰（"突起进入孔"）
[0095] 图2c :三特异性抗体，其包含
[0096] a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链（具有VH1和VL1)和；
[0097] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链（例如具 有多样化的VH2和VL2)，其中可变域VL和VH被彼此替换；
[0098] 在两条重链中具有示例性CH3修饰（"突起进入孔"）
[0099] 图2d :四特异性抗体，其包含
[0100] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链（例如具有多样化 的VH1和VL1)和；和
[0101] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链（例如具 有多样化的VH2和VL2)，其中可变域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被 彼此替换。
[0102] 图3 :A:二元亲和力crossmab原理的图示概述。交换技术用于重链、轻链组合，其 识别一条Fab臂上的一个抗原。
[0103] B:交换技术用于重链、轻链组合，其识别一条Fab臂上的两个抗原。包括二硫化物 稳定的突起进入孔技术（重链I :S354C、T366W ;重链2:T366S、L368A、Y407V、Y349C)可以 用于任一种组合。
[0104] 图4 :由于轻链和重链错配（产生错配的VHl与VH2和/或VH2与VH1)产生的不 想要的功能异常副产物的图示结构。
[0105] 图5 :A:用于克隆重链构建体的真核表达载体的图不。
[0106] B:用于克隆轻链构建体的真核载体的图示。
[0107] 图6 :A:VEGF-Her2-DAF测试表达的分析性HPLC的结果。蛋白A免疫沉淀材料的 (A、C、E)生物学重复1和（B、D、F)生物学重复2(K:H=转染质粒的突起进入孔比例）。
[0108] B: VEGF-Her2-DAF表达的SDS-PAGE。两份相等的样品代表蛋白A免疫沉淀材料的 技术重复的分析（NR，非还原条件；Red，还原条件）
[0109] C:分析性HPLC中与洗脱时间和大小相关的标记蛋白。
[0110] 图7 :A:VEGF-Her2-DAF-xAng2测试表达的分析性HPLC的结果。蛋白A免疫沉淀 材料的（A、C、E)生物学重复1和（B、D、F)生物学重复2(K:H =转染质粒的突起进入孔比 例）。
[0111] B: VEGF-Her2-DAF-xAng2表达的SDS-PAGE。两份相等的样品代表蛋白A免疫沉淀 材料的技术重复的分析（NR，非还原条件；Red，还原条件）。
[0112] 图 8 :A:VEGF-Her2-DAF-xHerl-Her3DAF 测试表达的分析性 HPLC 的结果。（A, B)生 物学重复1和2。
[0113] B: VEGF-Her2-DAF-xHerl-Her3DAF 表达的 SDS-PAGE。（A, B)是在 A 中呈现的分析 性HPLC的重复分析（NR，非还原条件；Red,还原条件）。
[0114] 图 9 :KiH Herl-Her3DAF-xHer2 表达的 SDS-PAGE(NR，非还原条件；Red，还原条 件）。
[0115] 图10 :利用三特异性抗体KiH Herl-Her3DAF-xHer2的增殖测定。（A)A431与 30 ii g/mL三特异性抗体或对照IgG抗体温育。加入抗体5天后，进行ATP释放测定（Cell Titer Glow, Promega)。（B) A431与30 iig/mL所示抗体温育。加入抗体5天后，进行ATP释 放测定（Cell Titer Glow, Promega)。
[0116] 图 11 :利用三特异性抗体 KiH Herl-Her3DAF-xHer2 的增殖测定。MDA-MB-175VII 细胞与三特异性抗体KiH Herl-Her3DAF-XHer2或对照IgG抗体的稀释系列温育。加入抗 体 5 天后，进行 ATP 释放测定（Cell Titer Glow, Promega)。
[0117] 图 12 :KiH Herl-Her3DAF-xHer2 或各亲本抗体的结合动力学。（A、B、C) Ist 和 2nd注射表示ErbB受体胞外结构域添加的顺序。
[0118] 图13 :在A431表皮样癌细胞中三特异性Herl-Her3DAF-xHer2抗体对ADCC的诱 导。
[0119] 单个格子的像宽是170. 83 iim
[0120] 上列对应于CMFDA标记的肿瘤细胞（通常在绿色通道中显示）
[0121] 下列对应于PKH26标记的天然杀伤细胞（通常在红色通道中显示）
[0122] 发明详沭
[0123] 本发明涉及多特异性抗体，其包含：
[0124] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0125] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0126] 或
[0127] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0128] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0129] 或
[0130] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0131] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0132] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述抗体是三特异性的并包含
[0133] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0134] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0135] 或
[0136] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0137] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0138] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述抗体是四特异性的并包含
[0139] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0140] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0141] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中，可 变域VL和VH被彼此替换；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0142] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）可变域VL和VH被彼此替换。
[0143] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0144] 根据本发明，可以通过仅在一对重链和轻链（HC/LC)中替换某些结构域提高想要 的多特异性抗体相比于不想要的副产物（由于轻链与特异性结合其他抗原的抗体的"错 误"重链的错配，参见图3)的比例。尽管两个全长HC/LC对的第一对保持基本上不被改变， 但是两个全长HC/LC对〇的第二对被以下替换修饰：
[0145] -龙链:可变轻链结构域VL被特异性结合第二抗原的所述抗体的可变重链结构域 VH替换，和/或恒定轻链可变域CL被特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定重链结构域 CHl替换，和
[0146] -差链:可变重链结构域VH被特异性结合第二抗原的所述抗体的可变轻链结构域 VL替换，和/或恒定重链可变域CHl被特异性结合第二抗原的所述抗体的恒定轻链结构域 CL替换。
[0147] 因此，本发明所得的多特异性抗体是人工抗体，其包含
[0148] A)
[0149] a)特异性结合第一和第二抗原的抗体的轻链和重链；和
[0150] b)特异性结合第三抗原的抗体的轻链和重链，
[0151] 其中（特异性结合第三抗原的抗体的）所述轻链含有可变域VH，而不是VL
[0152] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0153] 其中（特异性结合第三抗原的抗体的）所述重链含有可变域VL，而不是VH
[0154] 和/或恒定域CL，而不是CHl ;
[0155] 或
[0156] B)
[0157] a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
[0158] b)特异性结合第二和第三抗原的抗体的轻链和重链，
[0159] 其中（特异性结合第二和第三抗原的抗体的）所述轻链含有可变域VH，而不是VL
[0160] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0161] 其中（特异性结合第二和第三抗原的抗体的）所述重链含有可变域VL，而不是VH
[0162] 和/或恒定域CL，而不是CHl ;
[0163] 或
[0164] C)
[0165] a)特异性结合第一和第二抗原的抗体的轻链和重链；和
[0166] b)特异性结合第三和第四抗原的抗体的轻链和重链，
[0167] 其中（特异性结合第三和第四抗原的抗体的）所述轻链含有可变域VH，而不是VL
[0168] 和/或恒定域CHl，而不是CL
[0169] 其中（特异性结合第三和第四抗原的抗体的）所述重链含有可变域VL，而不是VH
[0170] 和/或恒定域CL，而不是CH1。
[0171] 在本发明的额外方面，可以通过修饰特异性结合三特异性或四特异性抗体内的第 一和第二抗原的所述全长抗体的CH3结构域来进一步提高想要的二价多特异性抗体相比 于不想要的副产物的该提高比例。
[0172] 因此，在本发明的一个优选实施方案中，可以通过"突起进入孔"技术改变本发明 的所述三特异性或四特异性抗体的CH3结构域（在重链和修饰的重链中），所述技术以若 干实例详细描述于例如恥 96/027011，把(^￥37，18.，等，？1'(^6111￡叩.9(1996)617-621;和 Merchant, A. M.，等，Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681 中。在该方法中，改变两个 CH3 结构域的相互作用表面，以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异源二聚体化。（两条 重链的）两个CH3结构域中的一个可以是"突起"，而另一个是"孔"。二硫键的引入进一步 稳定了异源二聚体（Merchant, A.M?，等，Nature Biotech. 16(1998)677-681 ;Atwell，S.， 等，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26 - 35)并增加了产量。
[0173] 因此，在本发明的一个方面，所述三特异性或四特异性抗体进一步的特征在于
[0174] a)的全长抗体的重链的CH3结构域与b)的全长抗体的修饰重链的CH3结构域各 自在这样的界面处相遇，所述界面在抗体CH3结构域之间包含原始界面；
[0175] 其中改变所述界面，以促进三特异性抗体或四特异性抗体的形成，其中所述改变 的特征在于：
[0176] i)改变一条重链的CH3结构域，
[0177] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到另一条重链的CH3结构域的原始界 面的一条重链的CH3结构域的原始界面内，
[0178] 氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在定位在另一条重链的 CH3结构域的界面内的腔中的一条重链的CH3结构域的界面内产生隆凸，
[0179] 和
[0180] ii)改变另一条重链的CH3结构域，
[0181] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到第一个CH3结构域的原始界面的第 二个CH3结构域的原始界面内，
[0182] 氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二个CH3结构域的 界面内产生腔，在所述第二个CH3结构域的界面内定位了第一个CH3结构域的界面内的隆 凸。
[0183] 优选地，具有更大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪 氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0184] 优选地，具有更小侧链体积的所述氨基酸残基选自丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨 酸（T)、缬氨酸（V)。
[0185] 在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸（C)作为在每个CH3结构域的相应位置 中的氨基酸来进一步改变两个CH3结构域，从而能够在两个CH3结构域之间形成二硫键。
[0186] 在一个优选的实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体在"突起链"的CH3结构 域中包含T366W突变，并且在"孔链"的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变。还可 以例如通过将Y349C突变引入到"突起链"的CH3结构域中并且将E356C突变或S354C突 变引入到"孔链"的CH3结构域中来使用CH3结构域之间的额外链间二硫键（Merchant, A. M，等，Nature Biotech. 16(1998)677-681)。因此，在另一优选实施方案中，所述三特异性 或四特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，而在两个CH3结构 域中的另一个中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突变，或者所述三特异性或四特异性抗体 在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C、T366W突变，而在两个CH3结构域中的另一个中 包含S354C、T366S、L368A、Y407V突变（一个CH3结构域中的额外Y349C突变和另一个CH3 结构域中的额外E356C或S354C突变形成了链间二硫键）（总是根据Kabat的EU索引进行 编号）。还可以备选地或额外地使用如EP 1 870 459 Al描述的其他突起进入孔技术。所 述三特异性或四特异性抗体的优选实例是在"突起链"的CH3结构域中的R409D ;K370E突 变和在"孔链"的CH3结构域中的D399K ;E357K突变（总是根据Kabat的EU索引进行编 号）。
[0187] 在另一优选的实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体在"突起链"的CH3结构 域中包含T366W突变，而在"孔链"的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变，并且额 外地，在"突起链"的CH3结构域中包含R409D ;K370E突变，而在"孔链"的CH3结构域中包 含 D399K ;E357K 突变。
[0188] 在另一优选的实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体在两个CH3结构域中 的一个中包含Y349C、T366W突变，而在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、 L368A、Y407V突变，或者所述三特异性或四特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含 Y349C、T366W突变，而在两个CH3结构域中的另一个中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突 变，并且在"突起链"的CH3结构域中额外地包含R409D ;K370E突变，而在"孔链"的CH3结 构域中包含D399K ;E357K突变。
[0189] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于
[0190] 在A)的情况下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3,并且第三抗原是HER2 ; 或
[0191] 在B)的情况下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HER1，并且第三抗原是HER3。
[0192] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨 基酸序列。
[0193] 在一个实施方案中，多特异性抗体是二价三特异性抗体并包含
[0194] a)特异性结合人HERl和人HER3的全长抗体的轻链和重链；和
[0195] b)特异性结合人HER2的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被 彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0196] 在一个实施方案中，特异性结合人HERl、人HER3和人HER2的此类二价三特异性抗 体包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨基酸序列。
[0197] 在一个实施方案中，特异性结合人HERl、人HER3和人HER2的此类二价三特异性抗 体包含SEQ ID N0s:4、9、13和18的氨基酸序列并且所述抗体的特征在于具有以下性质：
[0198] i)抗体以通过表面等离振子共振在37°C测定的KD I. 7E_08[M]的亲和力结合人 JERl (胞外结构域E⑶）；和
[0199] ii)抗体以通过表面等离振子共振在37°C测定的KD 4. 4E_09[M]的亲和力结合人 ffiR2(胞外结构域E⑶）；和
[0200] iii)抗体以通过表面等离振子共振在37°C测定的KD 1.8E-09[M]的亲和力结合 人HER2(胞外结构域E⑶）；和
[0201] iv)抗体可以同时结合人Herl和人Her2或同时结合人Her3和人Her2 ;
[0202] 在一个实施方案中，特异性结合人HERl、人HER3和人HER2的此类二价三特异性抗 体包含SEQ ID N0s:4、9、13和18的氨基酸序列并且所述抗体的特征在于以下性质中的一 种或多种：
[0203] i)浓度为50 ii g/mL的抗体抑制MDA-MB-175乳腺癌细胞的生长超过85% ;
[0204] ii)浓度为30 ii g/mL的抗体抑制A431表皮样癌细胞（其表达HERl)的生长超过 50% ;和
[0205] iii)抗体在A431表皮样癌细胞中诱导ADCC并且由此在2. 5小时内清除了大概 100 %的癌细胞；
[0206] 在一个实施方案中，特异性结合人HERl、人HER3和人HER2的此类二价三特异性抗 体包含SEQ ID NOs: 4、9、13和18的氨基酸序列并且其中抗体在Asn297(根据Kabat进行 编号）处被糖链糖基化，由此所述糖链内岩藻糖的量是65%或更低（在另一实施方案中，所 述糖链内岩藻糖的量在5% -65%之间，在一个实施方案中在20% -40%之间）。
[0207] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于在A)的情况下，第一抗原是人 HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ;或在B)的情况下，第一抗原是人cMET， 第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0208] 在一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于包含SEQ ID NOs:4、10、13和19的 氨基酸序列。
[0209] 术语"全长抗体"表示由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的抗体（参见图1)。 全长抗体的重链是这样的多肽，其在N-端到C-端方向上由抗体重链可变域（VH)、抗体恒定 重链结构域I (CHl)、抗体铰链区（HR)、抗体重链恒定域2 (CH2)和抗体重链恒定域3 (CH3) 组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;并且在IgE亚类的抗体的情况下，任选地还包括抗体重 链恒定域4 (CH4)。优选地，全长抗体的重链是在N-端到C-端方向上由VH、CH1、HR、CH2和 CH3组成的多肽。全长抗体的轻链是在N-端到C-端方向上由抗体轻链可变域（VL)和抗体 轻链恒定域（CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定域（CL)可以是K (kappa) 或入（lambda)。全长抗体链通过在CL结构域和CHl结构域之间（即轻链和重链之间）的 多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体 的实例是天然抗体像IgG (例如，IgGl和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE)。本发明的全长抗体 可以来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合的或人源化的抗体。
[0210] 本发明的全长抗体包含各自由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原 结合位点均特异性结合a)任一个单个抗原或b)结合两个不同抗原（参见下文）。所述全 长抗体的重链或轻链的C-端意指在所述重链或轻链的C-端的最后一个氨基酸。
[0211] 例如可以通过使全长抗体的可变重链和轻链结构域VH和VL多样化，从而引 入二元特异性来获得特异性结合两个不同抗原（例如第一抗原和第二抗原，或第三和 第四抗原）的全长抗体（或全长抗体的轻链和重链），技术描述于WO 2008/027236 ;W0 2010/108127 和 Bostrom, J.，等，Science323(2009) 1610-1614(其全部通过参考并入本 文）中。结合例如第一抗原和第二抗原的具有二元特异性的所得VH和VL现在可以用于 本发明多特异性的一条臂中，而另一条臂对第三抗原（或第三和第四抗原）特异。多样化 的VL和VH可以同时或互斥地结合第一个表位和第二个表位，并可以选自例如VEGF/HER2、 VEGF-A/HER2、HER2/DR5、VEGF-A/PDGF、HERl/HER2、CD20/BR3、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/ VEGF-D、TNFa /TGF-P、TNFa /IL-2、TNFa /IL-3、TNFa /IL-4、TNFa /IL-5、TNFa /IL6、 TNFa /IL8、TNFa /IL-9、TNFa /IL-10、TNFa /IL-Il、TNFa /IL-12、TNFa /IL-13、TNFa / IL-14、TNF a /IL-15、TNF a /IL-16、TNF a /IL-17、TNF a /IL-18、TNF a /IL-19、TNF a / IL-20、TNF a /IFN a、TNF a /CD4、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET 受体、HER2/Fc、HER2/ HER3 ;HER1/HER2、HER1/HER3、EGFR/HER4、TNFa /1L-3、TNFa /IL-4、IL-13/CD40L、IL4/ CD40L、TNF a /ICAM-1、TNFR1AL-IR、TNFR1/IL-6R 和 TNFR1/IL-18R。
[0212] 如本文所用的术语"结合位点"或"抗原结合位点"表示配体（例如抗原或其抗原 片段）实际结合的并且来自抗体的抗体分子的区域（或在二元特异性全长抗体的情况下， 是两个配体，例如第一和第二抗原结合）。抗原结合位点包括VH/VL的抗体重链可变域（VH) 对。
[0213] 特异性结合想要的抗原的抗原结合位点可以来自a)针对抗原的己知抗体或b) 通过例如使用抗原蛋白质或核酸或其片段的从头免疫方法或通过噬菌体展示获得的新抗 体或抗体片段。如果想要结合例如第一和第二抗原的二元特异性抗体，那么结合所述第 一抗原的所得抗体的 VH 和 VL 必须如 WO 2008/027236 ;W0 2010/108127 和 Bostrom, J.， 等，Science 323 (2009) 1610-1614 (其全部通过参考并入本文）所述被修饰/多样化。
[0214] 本发明的抗体的抗原结合位点含有六个互补性决定区（CDRs)，其在不同程度上有 助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变域⑶Rs(CDRHl、⑶RH2和⑶RH3)和三 个轻链可变域⑶Rs (⑶RLl XDRL2和⑶RL3)。通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来 确定CDR和构架区（FRs)的程度，在所述数据库中已根据序列之间的可变性而定义了那些 区域。本发明范围内还包括的是包含较少⑶Rs的功能抗原结合位点（即，其中通过三个、 四个或五个CDRs确定结合特异性）。
[0215] 抗体特异性指抗体对抗原特定表位的选择性识别。天然抗体例如是单一特异性 的。双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。因此三特异性抗体是具有三种 不同抗原结合特异性的本发明抗体。本发明的四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异 性的抗体。
[0216] 其中抗体具有多于一种特异性时，所识别的表位可以结合单个抗原或结合多于一 个抗原。
[0217] 如本文所用的术语"单特异性"抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结 合位点结合相同抗原的相同表位。
[0218] 如在本申请中所用的术语"价"表示在抗体分子中存在的结合位点的特定数量。例 如天然抗体或本发明的全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。在一个实施方案中，本 发明的多特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体是二价三特异 性的或二价四特异性的。
[0219] 本发明的全长抗体包括一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球 蛋白种类包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它们的 亚型。在优选的实施方案中，本发明的全长抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
[0220] 如在本文使用，术语〃单克隆抗体〃或〃单克隆抗体组合物〃指单一氨基酸组成 的抗体分子制品。
[0221] 术语〃嵌合抗体〃指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区， 以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，所述抗体通常通过重组DNA技术进行制 备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的"嵌合抗体"的其它优选形 式是那些，其中恒定区己经相比初始抗体的恒定区而被修饰或改变以产生根据本发明的特 性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体（FcR)结合。也将这种嵌合抗体称作"类别转换抗 体"。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的 DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。生产嵌合抗体的方法包括在本领域公知的 常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison, S.L.,等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984)6851-6855 和 US 5, 202, 238 和 US5, 204, 244。
[0222] 术语〃人源化抗体〃指这样的抗体，其中的构架或〃互补性决定区〃 (CDR)己经被 修饰为包括与亲本免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案 中,将鼠⑶R移植到人抗体的构架区以制备〃人源化抗体"。参见例如，Riechmann, L.，等 人，Nature 332 (1988) 323-327;和 Neuberger, M.S.,等人，Nature 314 (1985) 268-270。本 发明涵盖的"人源化抗体"的其它形式是那些，其中恒定区己经相比于初始抗体的恒定区 而另外被修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体（FcR) 结合。
[0223] 如在本文使用，术语"人抗体"旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变 区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的（van Dijk, M.A.,和van de Winkel, J. G.，Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物（例如小鼠）中 产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全 部所有组成成分或选定部分（selection)。在此种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白 基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体（参见例如Jakobovits, A.，等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90(1993)2551-2555 ; Jakobovits, A.，等人，Nature 362(1993)255-258; Bruggemann，M.，等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文 库中产生（Hoogenboom, H. R?，和 Winter, G.，J.，Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ;Marks，J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole 等人，和 Boerner 等人的技术也可以 用于制备人单克隆抗体（Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, (1985)第 77 页）和 Boerner, P.，等人，J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如己经对 根据本发明的嵌合和人源化抗体所提及的，如在本文中使用的术语"人抗体"还包括这样 的抗体，其在恒定区内被修饰以产生根据本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结 合，例如通过〃类别转换〃即改变或突变Fc部分（例如自IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 突变）。
[0224] 如在本文使用，术语〃重组人抗体〃旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分 离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离自针对人免疫球 蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体 表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人 抗体己经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源 自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的 序列。
[0225] 如本文使用，〃可变域"（轻链（VL)可变域，重链（VH)的可变域）意指直接参与 抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且 每个结构域包括4个构架（FR)区，所述构架区的序列是普遍保守的，其通过3个〃高变区 〃（或互补性决定区，⑶Rs)相连接。构架区采用￠-折叠构象且⑶R可以形成连接￠-折 叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构并与来自另一条链的CDR-起形 成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力方 面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。
[0226] 用于本文时，术语"高变区"或"抗体的抗原结合部分"指负责抗原结合的抗体 的氨基酸残基。高变区包括来自〃互补性决定区〃或〃⑶Rs〃的氨基酸残基。〃构架〃或 "FR"区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变域区域。因此，抗体的轻链和重链 从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过 此种构架氨基酸分开。特别地，重链的⑶R3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat，E. A.,等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,出版号 91_3242，Bethesda，MD(1991))的标准 定义确定⑶R和FR区域。
[0227] 如在本文使用，术语"结合"其特异结合7"特异性结合"指在体外测定法中， 优选地在用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定（BIAcore，GE-HealthcareUppsala,瑞 典）中，抗体与抗原的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗 体的缔合的速率常数）、kD(解离常数）和Kd (kD/ka)定义。在一个实施方案中，结合或特异 性结合表示l(T8m〇l/l或更低，优选10_9M-10_13mol/l的结合亲和力（KD)。
[0228] 因此，本发明的多特异性抗体优选以l(T8m〇l/l或更低，优选KT 9-l(T13m〇l/l的结 合亲和力（Kd)特异性结合对其特异的每种抗原。
[0229] 术语〃表位〃包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中， 表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，以及在 某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特性。表位是被抗体结 合的抗原区域。
[0230] 在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复合体混合物中优先识别其靶 抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。
[0231] 在其他实施方案中，本发明的多特异性抗体的特征在于所述全长抗体是人IgGl 亚类的或具有突变L234A和L235A的人IgGl亚类的。在其他实施方案中，本发明的多特异 性抗体的特征在于所述全长抗体是人IgG2亚类的。在其他实施方案中，本发明的多特异性 抗体的特征在于所述全长抗体是人IgG3亚类的。在其他实施方案中，本发明的多特异性抗 体的特征在于所述全长抗体是人IgG4亚类的或具有额外突变S228P和L235E的人IgG4亚 类的。在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体的特征在于所述全长抗体是人IgGl亚类 的，具有额外突变S228P的人IgG4亚类的。
[0232] 现在已经发现，本发明的多特性抗体具有改善的特征，如生物或药理学活性、药物 动力学性质或毒性。它们可以用于例如治疗疾病，如癌。
[0233] 如在本申请中使用，术语"恒定区"意指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。 恒定区不直接参与抗原的结合，但是显示多种效应子功能。取决于抗体重链的恒定区的氨 基酸序列，将抗体分为下述类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些中的一些可以被进一 步分为亚类如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定 区分别被称为a、S、e、Y和ii。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区（CL)被 称为 K (kappa)和入（lambda)。
[0234] 如本申请所使用，术语〃源自人来源的恒定区〃意指亚类IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链K或A区域。这样的恒定区是现 有技术中公知的并且例如由Kabat，E. A.，描述（参见，例如Johnson, G.，和mi, T. T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ;Kabat，E. A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)。
[0235] 当IgG4亚类的抗体显示出减少的Fe受体（FcYRIIIa)结合时，其它IgG亚 类的抗体显示出强烈的结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc糖类）、 Pr〇329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、ne253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fe受体结合（Shields，R. L.， 等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund，J.，等人，FASEB J.9(1995) 115-119; Morgan, A.，等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;EP 0307434)。
[0236] 在一个实施方案中，根据本发明的抗体与IgGl抗体相比具有减少的FcR结合。因 此，全长亲本抗体涉及IgG4亚类的FcR结合或具有S228、L234、L235和/或D265中突变 的IgGl或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在全长亲 本抗体中的突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在全 长亲本抗体中的突变在IgG4中是S228P和L235E，并且在IgGl中是L234A和L235A。
[0237] 抗体的恒定区直接涉及ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用）和 CDC(补体依赖的细胞毒性）。补体激活（CDC)由补体因子Clq与大多数IgG抗 体亚类的恒定区结合而起始。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的限定的蛋 白-蛋白相互作用所引起。这样的恒定区结合位点是现有技术中已知的，并且例如 由 Lukas, T. J.，等人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ;Brunkhouse, R.和（]〇13四，]\ J.，Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ;Burton，D.R.，等人，Nature 288(1980)338-344; Thomason，J.E.，等人，Mol.Immunol.37 (2000) 995-1004; Idiocies, E.E.,等人，J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ;Hearer，M.，等人，J.Virol. 75(2001) 12161-12168; Morgan, A.，等人，Immunology 86 (1995) 319-324;和 EP 0307434 所描述。此类恒定区结 合位点例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329 (根据 Kabat的EU索引编号）。
[0238] 当指免疫球蛋白重链恒定区的残基或位置时，一般使用"EU编号系统"或"EU索 引（根据Kabat)"（例如，在通过参考明确并入本文的Kabat, E.A?，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service, National Institutes of Health Publication No.91_3242，Bethesda,MD(1991)中报道了EU索引）。
[0239] 术语"抗体依赖性细胞毒作用（ADCC)"指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗 体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达抗原的 细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自血沉棕黄层的纯化的效 应细胞，如单核细胞或天然杀伤（NK)细胞或永久生长的NK细胞系。
[0240] 术语〃补体依赖性细胞毒性（⑶C) 〃指由补体因子Clq与大多数IgG抗体亚类的 Fc部分结合而起始的过程。Clq与抗体的结合由在所谓的结合位点的限定的蛋白_蛋白相 互作用所引起。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的（见上）。这些Fc部分结合位点 例如特征在于氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 (根据 Kabat 的EU索引编号）。亚类IgGl、IgG2和IgG3的抗体通常显示包括Clq和C3结合的补体激 活，而IgG4不激活补体系统并且不结合Clq和/或C3。
[0241] 单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖组分而得以增强， 如在 Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和 US 6, 602, 684 中所述。 IgGl型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-连接 的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双触角寡糖嵌入在CH2结构域之间， 形成了与多肽骨架的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖 性细胞毒作用（ADCC)是必要的（Lifely，M.，R.，等人，Glycobiology 5(1995)813-822; Jefferis, R.，等人，Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ;Wright, A.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotechnol. 15(1997)26-32)。Umana，P.，等人 Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和TO 99/54342显示，￠(1, 4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III (〃Gn TIII〃），一种催化平 分型（bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中的过量表 达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖类的组成上的改变或其消除也 影响 Fe Y R 和 Clq 的结合（Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; Davies，J.，等人，Biotechnol. Bioeng.74 (2001) 288-294 ;Mimura，Y.，等人，J. Biol. Chem. 276(2001)45539-45547 ;Radaev，S.，等人，J.Biol. Chem. 276(2001) 16478-16483 ; Shields，R.L.，等人，J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604 ;Shields，R.L.，等人，丄 Biol.Chem. 277 (2002) 26733-26740 ;Simmons，L.C.，等人，J.Immunol. Methods 263(2002)133-147)〇
[0242] 增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如在WO 2005/018572、TO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835 和 WO 2000/061739中进行报道。
[0243] 在本发明的一个优选的实施方案中，三特异性或四特异性抗体在Asn297被糖链 糖基化（如果其包含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类的Fc部分，优选地IgGl或IgG3亚类的 Fc部分），由此在所述糖链中的岩藻糖的量是65%或更低（根据Kabat的编号）。在另一个 实施方案中，岩藻糖在所述糖链中的量在5%和65 %之间，优选在20%和40%之间。在另 一个实施方案中，所述糖链中的岩藻糖的量在〇%之间。根据本发明的"Asn297"意为在Fc 区域的约位置297定位的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以定位 在位置297上游或下游的一些氨基酸上（通常不超过±3个氨基酸），即在位置294和300 之间。在一个实施方案中，根据本发明的糖基化的抗体IgG亚类是人IgGl亚类的，具有突 变L234A和L235A的人IgGl亚类的，或IgG3亚类的。在另一个实施方案中，在所述糖链中 N-羟乙酰神经氨酸（NGNA)的量是1 %或更低和/或N-端a -1，3-半乳糖的量是1 %或更 低。糖链优选地显示出与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297连接的N-连接的聚糖的 特征。
[0244] 术语〃糖链显示出与在CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297连接的N-连接的聚 糖的特征"指在根据本发明的全长亲本抗体的Asn297的糖链具有与在未修饰的CHO细胞 中表达的相同抗体,例如如在WO 2006/103100中报道的那些抗体相同的结构和糖残基序 列，除了岩藻糖残基之外。
[0245] 如在本申请中使用，术语〃NGNA〃意指糖残基N-羟乙酰神经氨酸。
[0246] 人IgGl或IgG3在Asn297发生糖基化，如核心岩藻糖基化的双触角复合寡糖 糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgGl或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat，E. A.， 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版。Public Health Service，National Institutes of Health 出版号? 91-3242, Bethesda, MD. (1991)，以及 由 Briiggemann, M.，等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ;Love, T. W.，等人，Methods Enzymol. 178(1989)515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为G0， Gl ( a -1，6-或 a -1，3_)或 G2 聚糖残基（Raju, T. S.，Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53)。抗 体 Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier, F. H.，Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 描 述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297进行岩藻糖基化，量 为至少85%。全长亲本抗体的修饰的寡糖可以是杂合的或复合的。优选地，所述平分型、还 原/未岩藻糖基化的寡糖是杂合的。在另一个实施方案中，所述平分型、还原/未岩藻糖基 化的寡糖是复合的。
[0247] 根据本发明〃岩藻糖的量〃意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和（例如， 复合、杂合和高甘露糖结构）相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过 MALDI-T0F质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是在N-糖苷酶F处理的样品中由 MLDI-TOF鉴定的包含岩藻糖的结构相对于所有糖结构（例如，分别为复合、杂合和低聚和 高甘露糖结构）的百分比。
[0248] 根据本发明的抗体由重组方法产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本 发明抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明抗体的核酸的细胞。用于重 组生产的方法是现有技术中公知的并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以 及随后的抗体分离和通常纯化为药学可接受纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的 表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的 原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER. C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞（上清液或裂解后 的细胞）中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在 Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ;Geisse，S.，等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J. , Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ；fferner, R. G. , Drug Res. 48 (1998) 870-880 的综述文章中描述。
[0249] 根据本发明的三特异性或四特异性抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白 纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A琼脂糖、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或 亲和层析法。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤 细胞可以充当DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体 接着被转染到本不产生免疫球蛋白的宿主细胞如J1EK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中， 从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
[0250] 所述三特异性或四特异性抗体的氨基酸序列变体（或突变体）通过将适合的核苷 酸变化引入到抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如 上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述抗体特征如IgG同种型和抗原结合， 但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。
[0251] 如在本申请中使用，术语〃宿主细胞〃意指可以被改造以产生根据本发明的抗体 的任何种类的细胞体系。在一个实施方案中，将J1EK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。如 在本文中使用，表述〃细胞"、〃细胞系〃和〃细胞培养物〃可交替使用，且全部这些名称都 包括后代。因此，措词"转化体"和"转化的细胞"包括原代受试细胞和由其来源的培养 物，而不考虑转移数。还应理解由于有意或无意的突变，所有的后代的DNA内容可能并不精 确一致。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。在期望 不同的指定时，将从上下文中显而易见。
[0252] 在NSO细胞中的表达记载在，例如，Barnes, L. M.，等人，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ;Barnes, L. M.，等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬时表 达记载在，例如，Durocher, Y.，等人，Nucl. Acids. Res. 30(2002)E9中。可变域的克隆记 载在 Orlandi, R.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ;Carter，P.，等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;和 Norderhaug, L.，等人，J. Immunol. Methods204 (1997) 77-87 中。优选的瞬时表达系统（HEK 293)记载在 Schlaeger, E. -J?，和 Christensen, K?的 Cytotechnology 30 (1999)71-83 和 Schlaeger，E.-J?的 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中。
[0253] 适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结 合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
[0254] 当核酸被置于与另一条核酸序列具有功能性关系的位置时，该核酸为"有效连接 的"。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA为有效连接的，当前者作为参与多 肽的分泌的前蛋白表达时；启动子或增强子与编码序列为有效连接的，如果前者影响序列 的转录；或核糖体结合位点与编码序列为有效连接的，如果前者被置于的位置能促进翻译。 一般的，"有效连接的"意为连接的DNA序列为相邻的，在分泌前导序列的情况下为相邻的且 符合读框的。但是增强子不需要为相邻的。使用合适的限制性位点的连接来实现连接。如 果这样的位点不存在，则依照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
[0255] 通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl显带法（CsCl banding)、柱层析法、琼脂糖 凝胶电泳和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞组分或其它污染物，例 如其它细胞核酸或蛋白。参见Ausubel, F等人（编辑），Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)。不同的方法是 充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法（例如，蛋白A或 蛋白G亲和层析法），离子交换层析法（例如阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子交换（氨 基乙基树脂）和混合模式的交换）、亲硫吸附（例如，用￠-巯基乙醇和其它SH配体）、 疏水相互作用或芳香吸附层析法（例如用苯基琼脂糖、氮杂-arenophilie树脂或间氨 基苯基硼酸），金属螯合亲和层析法（例如用Ni (II)-和Cu(II)-亲和力材料）、大小排 阻层析法和电泳方法（如凝胶电泳、毛细管电泳）（Vi jayalakshmi, M. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。
[0256] 本发明的一个方面是包括根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面 是根据本发明的抗体在制造药物组合物中的应用。本发明的另一个方面是用于制造包括根 据本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包括与药物载体一起 配制的根据本发明的抗体的组合物，例如药物组合物。
[0257] 本发明的一个实施方案是本发明的多特异性抗体，用于治疗癌症。
[0258] 本发明的另一方面是所述药物组合物，用于治疗癌症。
[0259] 本发明的另一方面是本发明的抗体在制造用于治疗癌症的药物中的应用。
[0260] 本发明的另一个方面是通过向需要此类治疗的患者施用根据本发明的抗体以治 疗罹患癌症的患者的方法。
[0261] 如此处所使用的，"药用载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗 真菌剂、等渗和吸收延迟剂、和生理上相容的类似物。优选地，载体适用于静脉内的、肌内 的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用（例如通过注射或输注）。
[0262] 本发明的组合物可通过本领域公知的多种方法施用。熟练技术人员应当理解，施 用的途径和/或模式将根据想要的结果而变化。为了以某种施用途径施用本发明的化合 物，可能必须使用物质包被化合物、或将所述物质和化合物共同施用以避免其失活。例如可 在合适的载体中对受试者施用化合物，所述载体例如脂质体或稀释剂。可药用的稀释剂包 括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体，和用于临时配制无菌可注射 用的溶液或分散体的无菌粉末。这些用于药用活性物质的介质和活性剂的用途为本领域公 知的。
[0263] 如本文所用的短语"肠胃外给药"和"经肠胃外给药"，表示不同于肠和局部施用 的施用方式，通常是通过注射，包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏 内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内 注射和输注。
[0264] 如在本文中使用，术语癌症指增生性疾病，如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非 小细胞肺（NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑 素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、 结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、夕卜阴癌、霍奇金病、食管 癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、 前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾孟癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经 系统（CNS)肿瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施万细 胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状上皮细胞癌、垂体腺瘤和Ewings肉瘤，包括 上述癌症任何的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
[0265] 这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过前述灭菌 操作，以及通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸 等，均可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。另 夕卜，可注射药物形式的延迟吸收可以通过纳入延迟吸收的活性剂如单硬脂酸铝和明胶来实 现。
[0266] 无论所选的施用路径如何，可以以适宜水合物形式使用的本发明的化合物和/或 本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制为可药用剂型。
[0267] 根据本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动，以获得有效量的活 性成分，从而对于特定的患者、组合物和给药方式实现期望的治疗反应，而对患者没有毒 性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活 性、给药路径、给药时间、所采用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用特定组合 物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健 康和既往病史、以及医学领域众所周知的类似因素。
[0268] 组合物必需是无菌和流动的，其程度使得组合物可以通过注射器递送。除了水之 夕卜，载体优选地是等渗缓冲盐溶液。
[0269] 例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小，通 过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中纳入等渗剂， 例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。
[0270] 如本文所用的术语"转化"指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果没有 强大的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，那么例如通过Graham,和Van der Eh, Virology 52 (1978) 546fT描述的磷酸钙沉淀方法进行转染。然而，也可使用用于将DNA导入细胞中的 其他方法，例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有实质细胞壁结 构的细胞，例如，一种转染方法是如Cohen，F.N，等，PNAS 69(1972)7110et seq所述的使用 氯化钙的钙处理。
[0271] 如本文使用，"表达"指将核酸转录为mRNA的过程和/或随后将转录的mRNA (也称 作转录本）翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录本和编码的多肽统称为基因产物。如果 多核苷酸是源自基因组DNA，那么在真核细胞中的表达可包括mRNA的剪接。
[0272] "载体"是核酸分子，特别是自主复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中 和/或在宿主细胞之间转移。该术语包括主要用作将DNA或RNA插入细胞（例如染色体整 合）的载体、主要用作复制DNA或RNA的复制载体、和用作DNA或RNA转录和/或翻译的表 达载体。还包括提供一种以上所述功能的载体。
[0273] "表达载体"是多核苷酸，其在被引入到适当的宿主细胞时，能够被转录并翻译成 多肽。"表达体系"通常指包括能够用作产生理想的表达产物的表达载体的适当的宿主细 胞。
[0274] 本发明的又一方面是多特异性抗体，其包含
[0275] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0276] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的轻链和重链，其中所述重链的N端通过肽接 头与所述轻链的C端连接；
[0277] 或
[0278] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0279] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的轻链和重链，其中所述重链的N 端通过肽接头与所述轻链的C端连接；
[0280] 或
[0281] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0282] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的轻链和重链，其中所述重链的N 端通过肽接头与所述轻链的C端连接。
[0283] 如本发明中所用的术语"肽接头"表示具有氨基酸序列的肽，其优选为合成来源 的。本发明的这些肽用于将第二种全长抗体（其特异性结合第二抗原）的轻链的C端通过 肽接头连接到重链的N端。第二种全长抗体重链和轻链内的肽接头是具有至少30个氨基 酸长度，优选32-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个中，肽接头是具有32-40个氨 基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述接头是（GxS)n，其中G =甘氨酸，S =丝氨酸，（X = 3, n = 8、9或10并且m = 0、l、2或3)或（x = 4并且n = 6, 7或8并且 m = 0、1、2或3)，优选x = 4，n = 6或7并且m = 0、1、2或3，更优选X = 4, n = 7并且m =2。在一个实施方案中，所述接头是（G4S)6G2。
[0284] 在实施例表1中给出了此类多特异性抗体的一个实施方案：三特异性Herl/ Her3-scFab-IGFlR，其包含 SEQ ID N0s:4、ll 和 13 的氨基酸序列。
[0285] 提供以下实施例、序列表和图，以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中 给出。应理解，可以在所示方法中进行修饰，但不背离本发明的精神。
[0286] 氨某酸序列描沭
[0287] SEQ ID NO: I :HC/ 突起 /Her2/VEGF
[0288] SEQ ID N0:2:HC/孔/Her2/VEGF
[0289] SEQ ID N0:3:HC/突起/Herl/Her3
[0290] SEQ ID N0:4:HC/孔/Herl/Her3
[0291] SEQ ID NO: 5: HC/ 孔 /xAng2
[0292] SEQ ID N0:6:HC/突起/xAng2
[0293] SEQ ID N0:7:HC/孔/xIGFIR
[0294] SEQ ID N0:8:HC/孔/xHer3
[0295] SEQ ID N0:9:HC/孔/xHer2
[0296] SEQ ID N0:10:HC/孔/xcMet
[0297] SEQ ID N0:11:HC/孔/scFabIGFlR
[0298] SEQ ID N0:12:HC/孔/xHerl/Her3
[0299] SEQ ID NO:13:LC/Herl/Her3
[0300] SEQ ID N0:14:LC/Her2/VEGF
[0301] SEQ ID N0:15:LC/xAng2
[0302] SEQ ID N0:16:LC/xIGFlR
[0303] SEQ ID N0:17:LC/xHer3
[0304] SEQ ID N0:18:LC/xHer2
[0305] SEQ ID N0:19:LC/xcMet
[0306] SEQ ID N0:20:LC/xHerl/Her3
[0307] 在下文中，列出了本发明的实施方案：
[0308] 1.多特异性抗体，其包含：
[0309] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0310] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0311] 或
[0312] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0313] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0314] 或
[0315] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0316] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0317] 2.实施方案1的多特异性抗体，其特征在于所述抗体是二价三特异性或四特异性 抗体。
[0318] 3.实施方案1的多特异性抗体，其特征在于所述抗体是三特异性的并包含
[0319] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0320] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0321] 或
[0322] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0323] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0324] 4.实施方案3的多特异性抗体，其中
[0325] 在A)的情况下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ; 或
[0326] 在B)的情况下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0327] 5.实施方案1的多特异性抗体，其中所述抗体是二价三特异性抗体并且包含
[0328] a)特异性结合人HERl和人HER3的全长抗体的轻链和重链；
[0329] 和
[0330] b)特异性结合人HER2的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被 彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0331] 6.实施方案5的多特异性抗体，其中所述抗体的特征在于包含SEQ ID N0:4、9、13 和18的氨基酸序列。
[0332] 7.实施方案3的多特异性抗体，其中
[0333] 在A)的情况下，第一抗原是人HERl，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET ; 或
[0334] 在B)的情况下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HERl并且第三抗原是人HER3。
[0335] 8.实施方案1的多特异性抗体，其特征在于所述抗体是四特异性的并包含
[0336] a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0337] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0338] 9.实施方案1_5、7和8任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链和修饰重链 中，可变域VL和VH被彼此替换；并且其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0339] 10.实施方案权利要求1_5、7和8任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链 和修饰重链中，（仅）可变域VL和VH被彼此替换。
[0340] 11.实施方案1_5、7和8任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链和修饰重 链中，（仅）恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0341] 12.实施方案1-11任一项的多特异性抗体，其特征在于
[0342] a)的全长抗体的重链的CH3结构域与b)的全长抗体的修饰重链的CH3结构域各 自在这样的界面处相遇，所述界面在抗体CH3结构域之间包含原始界面；
[0343] 其中改变所述界面，以促进三特异性抗体或四特异性抗体的形成，
[0344] 其中所述改变的特征在于：
[0345] i)改变一条重链的CH3结构域，
[0346] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到另一条重链的CH3结构域的原始界 面的一条重链的CH3结构域的原始界面内，
[0347] 氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在定位在另一条重链的 CH3结构域的界面内的腔中的一条重链的CH3结构域的界面内产生隆凸，
[0348] 和
[0349] ii)改变另一条重链的CH3结构域，
[0350] 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到第一个CH3结构域的原始界面的第 二个CH3结构域的原始界面内，
[0351] 氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二个CH3结构域的 界面内产生腔，在所述第二个CH3结构域的界面内定位了第一个CH3结构域的界面内的隆 凸。
[0352] 13.实施方案12的多特异性抗体，其特征在于
[0353] 具有较大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、 色氨酸（W)，并且具有较小侧链体积的所述氨基酸残基选自丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸 (T)、缬氨酸（V)。
[0354] 14.实施方案12或13的多特异性抗体，其特征在于
[0355] 通过引入半胱氨酸（C)作为在每个CH3结构域的相应位置中的氨基酸来进一步改 变两个CH3结构域，从而能够在两个CH3结构域之间形成二硫键。
[0356] 15.用于制备实施方案1-14的多特异性抗体的方法，
[0357] 其包括步骤
[0358] a)用包含这样的核酸分子的载体转化宿主细胞，所述核酸分子编码
[0359] A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0360] b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH 被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl
[0361] 被彼此替换；
[0362] 或
[0363] B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0364] b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换；
[0365] 或
[0366] C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和
[0367] b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变 域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CHl被彼此替换。
[0368] b)在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和
[0369] c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
[0370] 16.核酸，其编码实施方案1-14的多特异性抗原结合蛋白质。
[0371] 17.载体，其包含编码实施方案1-14的多特异性抗原结合蛋白质的核酸。
[0372] 18.宿主细胞，其包含实施方案17的载体。
[0373] 19.实施方案1-14的抗体的组合物，优选药物组合物或诊断组合物。
[0374] 20.药物组合物，其包含实施方案1-14的抗体和至少一种药学上可接受的赋形 剂。
[0375] 21.实施方案1-14任一项的抗体，用于治疗癌症。
[0376] 22.实施方案1-14任一项的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途。
[0377] 23.用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的 实施方案1-14的抗体。
[0378] 24.用于治疗患有癌症的患者的方法，其特征在于通过向所述患者施用治疗有效 量的实施方案1-14的抗体。 实施例
[0379] 材料和方法
[0380] 重组DNA技术
[0381] 将标准方法用于操作 DNA,如在 Sambrook, J.，等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York，1989中所述。根据生产商的说明书来使用分子生物学试剂。
[0382] DNA和蛋白质序列分析以及序列数据管理
[0383] 在 Kabat，E. A.，等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 片反 Public Health Service, National Institutes of Health Publication No 91-3242, Bethesda(1991)中给出关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信 息。根据EU编号对抗体链的氨基酸进行编号（Edelman，G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85; Rabat, E. A.,等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 片反 NIH Publication No 91-3242 (1991))〇GCG's(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin) 软件包版本10. 2和Infomax's Vector NTI Advance suite版本8.0用于序列产生、作图、 分析、注释和举例说明。
[0384] DNA 测序
[0385] DNA序列通过在 sequiServe (Vaterstetten，德国）和 Geneart AG (Regensburg，德 国）进行的双链测序来确定。
[0386] 基因合成
[0387] 需要的基因区段由GeneartAG(Regensburg，德国）从合成的寡核苷酸和PCR产物 通过自动的基因合成进行制备。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆 到pGA18(ampR)质粒中。从转化的细菌纯化质粒DNA，并且通过UV光谱法测定浓度。通过 DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。
[0388] 表达质粒的构建
[0389] 将Roche表达载体用于构建编码所有的重链和轻链的表达质粒。所述载体由下述 元件构成：
[0390] _作为选择标记的潮霉素抗性基因，
[0391] -EB 病毒（Epstein-Barr virus, (EBV))的复制起点，oriP，
[0392] -载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，
[0393] _内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
[0394] -来自人巨细胞病毒（HCMV)的即时早期增强子和启动子，
[0395] -人1-免疫球蛋白多腺苷酸化（"poly A")信号序列。
[0396] 通过基因合成制备包含重链或轻链的免疫球蛋白基因以及具有CH-CL交叉的 crossmab构建体并将其克隆到所述pGA18(ampR)质粒中。通过定向克隆，使用cds上游的 5'BamHI和定位在CHl结构域中的3'KpnI限制性位点构建可变重链构建体。按照基因合成 安排可变轻链构建体（包含VL和CL)并通过定向克隆使用cds上游的5' BamHI和定位在 终止密码子下游的3' XbaI限制性位点进行构建。通过基因合成全长编码序列（VL-CH1或 VH-CL-CH2-CH3)或利用编码序列中的独特限制性位点按照部分基因合成来构建Crossmab 抗体。在交叉的轻链（VL-CHl)的情况下，仅安排覆盖具有5'BamHI和3'XbaI限制性位点 的完整cds的基因合成。对于重链构建体，重链载体的CH2结构域中的独特3'XhoI限制性 位点也可以用于具有5'BamHI限制性位点的定向克隆。将最终的表达载体转化到大肠杆菌 细胞中，分离表达质粒DNA(Minipr印）并进行限制性酶分析和DNA测序。将正确的克隆在 150ml LB-Amp培养基中培养，再次分离质粒DNA (Maxiprep)并通过DNA测序证实序列完整 性。
[0397] 免疫球蛋白变体在HEK293细胞中的瞬时表达
[0398] 根据生产商的说明书（Invitrogen, USA)，使用 FreeStyle? 293Expression System通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。对于小规模测试 表达，将30ml的0.5x IO6 HEK293F细胞/ml在转染前一天接种。第二天，质粒DNA (Iiig DNA/ml 培养体积）与 I. 2ml Opti-MEM? I Reduced Serum Medium(Invitrogen, C arlsbad，CA, USA)混合，随后加入 40u I 的 293Fectin? Transfection Reagent (Invitr ogen，Carlsbad，CA, USA)。将混合物在室温下温育15分钟并逐滴加入细胞中。转染一天 后，将 300ul L-谷氛酸胺（200mM，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和 600ul 含有 L-天冬酰胺的feed7、HyPep 1510、铵-Fe (III)柠檬酸盐、乙醇胺、痕量元素、D-葡萄糖、 不含RDMI的FreeStyle培养基注入每个烧瓶。转染三天后，使用自动化细胞活力分析仪 (Vi-CELL? XR，Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)和葡萄糖计（Accil-CHEK? Sensor comfort, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)测定培养基中的细胞浓 度、活力和葡萄糖浓度。此外，将300 ill的L-谷氨酰胺、300 ill非必需氨基酸溶液（PAN? Biotech, Aidenbach, Germany)、300 u 1 丙酮酸钠（lOOmM, Gibco, Invitrogen)、I. 2ml feed7 和ad 5g/L葡萄糖（D-(+)-葡萄糖溶液45% ,Sigma)注入每个烧瓶。最后，转染六天后， 通过在环境温度下，X3R Multifuge (Heraeus, Buckinghamshire, England)中 3500rpm 离心 15分钟收集抗体，上清液通过Steriflip过滤装置（0.22mm Millipore Express PLUS PES 膜，Mi 11 ipore，Bedford，M)无菌过滤并贮存在-20°C，直至进一步使用。
[0399] 双特异性抗体和对照抗体的纯化
[0400] 通过使用 Protein A-Sepharose?(GE Healthcare,瑞典）的亲和层析法和 SuperdeX200大小排阻层析法，将二价三特异性或四特异性抗体和对照抗体从细胞培养 物上清液中纯化出来。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液施加到HiTrapProteinA HP (5ml)柱上，所述柱用 PBS 缓冲液（IOmM Na2HPO4, ImM KH2PO4, 137mM NaCl 和 2. 7mM KC1, pH 7.4)平衡。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗出。将抗体和抗体变体用0. IM柠檬酸盐缓冲 液，pH 2. 8洗脱，并将包含蛋白的级分用0. Iml IM Tris，pH 8. 5中和。合并洗脱的蛋白级 分，用Amicon超离心滤器装置（MWC0:30K，Millipore)将其浓缩到3ml的体积，并负载到用 20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0 平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝胶过滤柱（GE Healthcare，瑞典）上。将具有低于5%的高分子量聚集体的包含纯化的双特异性抗体和对 照抗体的级分合并并以I. 〇mg/ml的等分试样存在_80°C。
[0401] 蛋白质定量
[0402] 使用具有预先填充的 Poros? A 蛋白 A 柱（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)的自动化 Ultimate 3000 系统（Dionex, Idstein, Germany)通过亲和层析 法定量蛋白质。所有样品装载到缓冲液A(0.2M Na2HPO4* [2H20]，pH 7.4)中并在缓冲液 B(0. IM柠檬酸，0. 2M NaCl，pH2. 5)中洗脱。为了测定蛋白质浓度，1.62的消光系数用于所 有样品。
[0403] 纯化蛋白质的分析
[0404] 通过使用在氨基酸序列基础上计算的摩尔消光系数测定280nm处的光密度（OD) 来测定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。在存在和缺少还原剂（5mM 1,4-二硫苏糖醇）和 利用考马斯亮蓝染色的情况下通过SDS-PAGE分析双特异性抗体和对照抗体的纯度和分子 量。根据生产商的说明书（4-20% Tris-Glycine gels)使用NuPAGE? Pre-Cast凝胶 系统（Invitrogen，USA)。在 25°C，使用 200mM KH2P04,250mM KCl，pH 7.0 运行缓冲液中的 Superdex 200分析性大小排阻柱（GE Healthcare, Sweden)通过高效SEC分析双特异性抗 体和对照抗体样品的聚集体含量。以0. 5ml/min的流速将25 ii g蛋白质注射到柱上并在50 分钟内等度洗脱。在通过Peptide-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促处 理去除N-聚糖后通过NanoElectrospray Q-TOF质谱验证还原性双特异性抗体轻链和重链 的氨基酸骨架的完整性。
[0405] 用于小规模分析的免疫沉淀
[0406] 对于所有样品，在补充有 5 % Tween? 20 (PBS-T，pH 7. 4, Fluka Analytical, Steinheim, Germany)的PBS中将30 Ii g的蛋白质稀释到相等的总反 应体积。力卩入 126 i! I Dynabeads? 蛋白 A(0. 24i! g 人 IgG/i! I Dynabeads 结合 力，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)并将溶液在室温和20rpm下温育90-120分钟，以允许 人IgG Fc结合连接磁珠的蛋白A (I. 4ml总反应体积）。珠用Iml PBS-T洗涤三次，在0. 4x g下离心30秒，以在管底收集溶液。丢弃上清液并将Dynabeads与30 ill的IOOmM柠檬酸 盐，pH 3 (水枸橼酸，Sigma)温育以洗脱蛋白质。然后，用3 ill的2M Tris，pH 9 (Fisher Scientific)中和溶液。
[0407] 分析性 HPLC
[0408] 使用具有 TSK-GEL G3000SW 凝胶过滤柱（7. 5mm ID X 30cm, TosoHaas Corp. , Montgomeryvilie, PA, USA)的 Agilent HPLC 1100(Agilent Technologies, Paulo Alto, CA, USA)分析抗体。将18 ill的洗脱蛋白质装载到缓冲液A(300mM NaCl，pH 7. 5中的 0.05M K2HPO4AH2PO4)中的柱上并根据大小进行分离。
[0409] 还原性和非还原性SDS-PAGE
[0410] 7iU的洗脱蛋白质与2x样品缓冲液（NllPAGE? LDS样品缓冲 液，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)混合并且另外的7 ii 1与含有10 %还原剂 (NllPAGE? Sample Reducing Agent，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的 2x 样品缓冲 液混合。将样品加热到70° 10分钟并装载到pre-cast NuPAGE? 4-12% BisTris Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)上。在 200V 和 125mA 下运行凝胶 45 分钟。然后，用 Millipore 水洗漆凝胶三次并用 SimplyBlue? SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 染色。在Millipore水中将凝胶脱色过夜。
[0411] 细胞系
[0412] 在补充有4mM L-谷氨酰胺、0? ImM非必需氨基酸和10%热灭活胎牛血清（Gibco) 的RPMI 1640培养基（Gibco)中维持A431。在补充有GlutaMax的DMEM/F12培养基（Gibco) 中维持MDA-MB 175VII细胞。根据标准的细胞培养方案繁殖细胞系。
[0413] 表面等离振子共振
[0414] 所有实验在Biacore TlOO (GE Healthcare)上进行。使用TlOO对照和评估软件包 (GE Healthcare, v2. 03)分析实验结果。测定形式是CM5芯片上的'多循环动力学'测定。 通过胺偶联的抗人IgG-Fc抗体（GE Healthcare BR-1008-39)捕获待分析的抗体。DAF和 pertuzumab用作参考对照。使用浓度系列，分别注射7个增加浓度的每种抗原（人Herl、 Her2和Her3胞外结构域）。在37°C下结合各MAbs〈HerX>的HerX的动力学表征：通过用 具有双重参考（against c = OnM并且FCl =空白表面）的Langmuirl: 1结合模型通过 Biacore评估软件拟合结合和解离相的表面等离振子共振信号的观察时间过程来评估标准 动力学。运行缓冲液是PBS-T。稀释缓冲液是含有BSA的PBST (c = lmg/mL)。
[0415] 以大约c = InM的浓度，流速5iil/min，时间72sec在流动室2、3和4上捕获 MAbs〈HerX>。分析物样品：将50 iil/min流速的7个增加浓度的HerX注射180sec结合时 间（c = 1.23-900nM,稀释因子3)。解离时间：1800sec。一式两份分析每个浓度。
[0416] 利用120sec的接触时间和50 ii 1/min的流速，使用3M MgC12 (由vendor推荐） 在每个循环后进行最后的再生。同时结合的分析：利用各ISOsec的接触时间，使用双重注 射模式连续注射Her2/Her3、Her3/Her2或Herl/Her2。如动力学实验中所观察，在饱和时 针对每种抗原选择抗原浓度。作为对照，第二次注射相同的抗原不升高应答水平，证明达到 了平衡。选择25°C的温度，以将解离最小化。测定每种组合的三个重复。流速30mL/min， 两次注射的双重注射，每次180sec。
[0417] 设计本发明的多种多特异性抗体以评估概念（参见下文表1)。通常，它们包括在 CH3结构域中的突起进入孔修饰（如可以在各序列中看到的）。
[0418] 表1 :本发明多特异性抗体的设计：数字表示序列表中的序列号（X表示在轻链和 重链中，CHl和CL已经交换）。
【权利要求】
1. 多特异性抗体，其包含： A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼 此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换； 或 B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换； 或 C) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换；并且 其中所述抗体是二价、三特异性或四特异性抗体。
2. 权利要求1的多特异性抗体，其特征在于所述抗体是三特异性的并包含 A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼 此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换； 或 B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换。
3. 权利要求2的多特异性抗体，其中 在A)的情况下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人HER2 ;或 在B)的情况下，第一抗原是人HER2,第二抗原是人HER1并且第三抗原是人HER3。
4. 权利要求1的多特异性抗体，其中所述抗体是二价三特异性抗体并且包含 a) 特异性结合人HER1和人HER3的全长抗体的轻链和重链； 和 b) 特异性结合人HER2的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼此 替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换。
5. 权利要求4的多特异性抗体，其中所述抗体的特征在于包含SEQIDN0:4、9、13和 18的氨基酸序列。
6. 权利要求3的多特异性抗体，其中 在A)的情况下，第一抗原是人HER1，第二抗原是人HER3并且第三抗原是人cMET;或 在B)的情况下，第一抗原是人cMET，第二抗原是人HER1并且第三抗原是人HER3。
7. 权利要求1的多特异性抗体，其特征在于所述抗体是四特异性的并包含 a) 特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b) 特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域 VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换。
8. 权利要求1_4、6和7任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链和修饰重链中， 可变域VL和VH被彼此替换；并且其中恒定域CL和CH1被彼此替换。
9. 权利要求1_4、6和7任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）可变域VL和VH被彼此替换。
10. 权利要求1_4、6和7任一项的多特异性抗体，其中在b)的修饰轻链和修饰重链中， (仅）恒定域CL和CH1被彼此替换。
11. 权利要求1-10任一项的多特异性抗体，其特征在于 a)的全长抗体的重链的CH3结构域与b)的全长抗体的修饰重链的CH3结构域各自在 这样的界面处相遇，所述界面在抗体CH3结构域之间包含原始界面； 其中改变所述界面，以促进三特异性抗体或四特异性抗体的形成，其中所述改变的特 征在于： i) 改变一条重链的CH3结构域， 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到另一条重链的CH3结构域的原始界面的 一条重链的CH3结构域的原始界面内，氨基酸残基被具有更大侧链体积的氨基酸残基替 换，由此在定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的腔中的一条重链的CH3结构域的界 面内产生隆凸， 和 ii) 改变另一条重链的CH3结构域， 从而在三特异性抗体或四特异性抗体内遇到第一个CH3结构域的原始界面的第二个CH3结构域的原始界面内， 氨基酸残基被具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二个CH3结构域的界面 内产生腔，在所述第二个CH3结构域的界面内定位了第一个CH3结构域的界面内的隆凸。
12. 权利要求11的多特异性抗体，其特征在于 具有较大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸（R)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨 酸（W)，并且具有较小侧链体积的所述氨基酸残基选自丙氨酸（A)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、 缬氨酸（V)。
13. 权利要求11或12的多特异性抗体，其特征在于 通过引入半胱氨酸（C)作为在每个CH3结构域的相应位置中的氨基酸来进一步改变两 个CH3结构域，从而能够在两个CH3结构域之间形成二硫键。
14. 用于制备权利要求1-13的多特异性抗体的方法， 其包括步骤 a) 用包含这样的核酸分子的载体转化宿主细胞，所述核酸分子编码 A) a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b) 特异性结合第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼 此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换； 或 B) a)特异性结合第一抗原的全长抗体的轻链和重链；和 b)特异性结合第二抗原和第三抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换； 或 c)a)特异性结合第一抗原和第二抗原的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第三抗原和第四抗原的全长抗体的修饰轻链和修饰重链，其中可变域 VL和VH被彼此替换，和/或其中恒定域CL和CH1被彼此替换。 b) 在允许合成所述抗体分子的条件下培养宿主细胞；和 c) 从所述培养物中回收所述抗体分子。
15. 核酸，其编码权利要求1-13的多特异性抗原结合蛋白质。
16. 载体，其包含编码权利要求1-13的多特异性抗原结合蛋白质的核酸。
17. 宿主细胞，其包含权利要求16的载体。
18. 权利要求1-13的抗体的组合物，优选药物组合物或诊断组合物。
19. 药物组合物，其包含权利要求1-13的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
20. 权利要求1-13任一项的抗体，其用于治疗癌症。
21. 权利要求1-13任一项的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途。
22. 用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的权利 要求1-13的抗体。
23. 用于治疗患有癌症的患者的方法，其特征在于通过向所述患者施用治疗有效量的 权利要求1-13的抗体。
【文档编号】C07K16/22GK104379604SQ201380027168
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2012年5月24日
【发明者】R·卡斯托尔迪, A·哈斯, C·克莱因, W·舍费尔, C·苏斯特曼 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司