一种卡贝缩宫素的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种卡贝缩宫素的制备方法，所述的方法包括如下步骤：将Fmoc-Cys(Mmt)-OH与羟基官能团树脂偶联得到Fmoc-Cys(Mmt)-树脂。将Fmoc-Cys(Mmt)-树脂脱除Fmoc后得到H-Cys(Mmt)-树脂。将Fmoc-Asn(Trt)-OH与H-Cys(Mmt)-树脂偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-树脂。按照固相合成的方法重复脱Fmoc、缩合反应的步骤，得到如A结构的多肽树脂。A脱Fmoc后，与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯反应得到B；B经过弱酸裂解得到C，然后经环化、裂解得到如式D的片段；D经过强酸体系裂解得到E。将Fmoc-Gly-OH和氨基树脂混合后经偶联反应，脱Fmoc后得到H-Gly-树脂。按照固相合成的方法重复上述步骤得到F。将片段E与F偶联得到如式G的多肽树脂。G经裂解后得到卡贝缩宫素H。本发明方法总收率高，杂质含量少，产物纯度高，具有较大的产业化前景。
【专利说明】一种卡贝缩宫素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽药物制备方法领域，具体涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。
【背景技术】
[0002]卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种化学合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，其临床和药理特性与天然产生的催产素非常类似，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。目前国内只有原研厂家辉凌公司的进口药和辉凌中国的产品巧特欣，市场还处于保护期。
[0003]国外专利情况:
专利ES2115543，采用固液结合合成法:先通过常规的多肽固相合成法，采用HOBt/DIC偶联体系得到 H-Tyr (Me)-1le-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂，该肽树脂和 4-氯丁酸缩合生成 4_Cl-Butyl_Tyr (Me) -1le-Gln-Asn-Cys (Trt) -Pro-Leu-Gly-树脂，经过酸裂解后得到线性肽 4-Cl-Butyl-Tyr (Me) -1le-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2,线性肽在乙腈和水(V: V=1:1)中用IM NaOH调节pH=9，环化得到卡贝缩宫素，环化采用的碱包括LiOH、NaHC03、DIEA、DMAP ；
国内专利情况:
深圳瀚宇药业有限公司2009年申请了专利“一种固相制备卡贝缩宫素的方法”，专利号为CN10555272A。采用了 Alloc保护半胱氨酸的巯基(Fmoc-Cys (Alloc) -OH)，其它的氨基酸如下:Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Pro-0H、Fmoc-Asn (Trt) -0H>Fmoc-Gln (Trt) _0H、Fmoc-1le-0H、Fmoc_Tyr (OMe)-0H。以Rink Amide氨基树脂为固相合成的载体,经过依次偶联原料氨基酸得到 H-Tyr (Me) -1le-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Alloc) -Pro-Leu-Gly-氨基树脂，接着与X (CH2) 3C00H (X代表卤素，优选Br)反应得到Br-C (CH2) 2C0NH_Tyr (Me) -1le-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Alloc) -Pro-Leu-Gly-氨基树脂,采用四三苯基膦钮/苯基硅烷/DCM 脱除 Alloc 保护基得到 fc-C(CH2) 2C0NH-Tyr (Me) -1le-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys-Pro-Leu-Gly-氨基树脂，加入碱进行固相环化，得到卡贝缩宫素-氨基树脂，再经过裂解(裂解试剂是TFA/水/苯酚/乙二硫醇/苯甲硫醚)即可得到卡贝缩宫素粗肽，该粗肽通过离子交换柱的方法制备卡贝缩宫素衍生物(如卡贝缩宫素的醋酸盐、盐酸盐等)。
深圳键元医药科技有限公司在2010年申请了 “一种具有宫缩作用药物的生产工艺”的专利(CN102146122A)。在专利中采用保护的氨基酸Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、Fmoc-Gln (Trt)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH 为原料，Rink Amide MBHA 为载体，通过 TBTU /HOBt/DIEA 缩合得到 Fmoc-Tyr (Me)-1le-Gln (Trt)-Asn (Trt)-Cys (Trt)-Pro-Leu-Gly-氨基树月旨，以 1% TFA/DCM脱除半胱氨酸侧链保护，然后与4-溴丁酸在DIEA/DMF作用生成Fm0c-Tyr(Me)-1le-Gln (Trt)-Asn (Trt)-Cys ((CH2)3COOH)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂。该肽树脂脱去 Fmoc 后，在TCTU/DIEA/DMF下环化生成卡贝缩宫素-氨基树脂，该片段经裂解(裂解试剂TFA =EDT:水=95:2.5:2.5)即可得到卡贝缩宫素粗肽。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种固相片段法合成卡贝缩宫素的方法，该方法的反应条件温和，收率高，单杂含量低，有利于实现规模化生产。
[0005]本发明的技术方案包括以下步骤:
1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征主要包括以下步骤:
(I)以0.5-1.1 mmol/g王树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为单体,依次连接Fmoc氨基酸，以 Fmoc-Tyr (OMe)-OH 为终止氨基酸,得到 Fmoc-Tyr (OMe) -1le-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Mmt)-树脂片段A。
[0006](2) A经脱Fmoc后，与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯反应得到B ;B在1%_5%的TFA/DCM作用下得到C ;然后C在树脂上环化得到D ;D以TFA/TIS/EDT为切肽试剂、在乙醚中沉淀形成E ；
(3)以Rinkamide AM树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为单体,依次连接氨基酸,得到片段F;
(4)E与F偶联得到G，G经裂解得到卡贝缩宫素粗品H ；
(5)将粗品溶于水，经过滤后通过制备HPLC进行分离纯化，得到卡贝缩宫素纯品。
[0007]2.根据本发明所述的方法，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次与王树脂相连得到如式A的多肽树脂；采用偶联至多肽树脂上的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合:DIC、HATU, TBTU, HBTU, PyBop, HOBt, Cl-HOBt, DIPEA、NMM, DIEA。
[0008]3.根据本发明所述的方法，Cys的侧链保护基为Mmt。
[0009]4.根据本发明所述的方法，脱除Mmt保护基试剂为1%_5%TFA的DCM溶液。
[0010]5.根据本发明所述的方法；H-Tyr (OMe)-1le-Gln (Trt)-Asn (Trt)-Cys (Mmt)-树脂与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯在选自由有机溶剂DCM，NMP和DMF组成的组中的至少一种溶剂中反应得到片段B。
[0011]6.根据本发明所述的方法，环化反应在树脂上进行，所用的试剂为:二异丙基乙基胺，三乙胺，LiOH等。
[0012]7.根据本发明所述的方法，采用E偶联至F肽树脂上的缩合剂为下述一种或多种组合:DIC、HATU, TBTU, HBTU, PyBop, HOBt, Cl-HOBt, DIPEA、NMM、DEPBT, DIEA。
[0013]8.根据本发明所述的方法，以TFA/TIS/HAc为切肽试剂，其比例为90.0:5.0:5.0，
最后在乙醚沉淀得到卡贝缩宫素的粗品H。
[0014]9.根据本发明所述 的方法，以C18柱为填料柱，通过制备HPLC进行分离纯化，流动相为硫酸铵的水溶液和乙腈的混合液，检测波长为280mm。
[0015]其中，化学物质A至H的化学结构如下所示:
【权利要求】
1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征主要包括以下步骤: (1)以0.5-1.lmmol/g王树脂为载体、Fmoc保护的氨基酸为单体,依次连接Fmoc氨基酸，以 Fmoc-Tyr (OMe) -OH 为终止氨基酸，得到 Fmoc-Tyr (OMe) -1le-Gln (Trt) -Asn (Trt) -Cys (Mmt)-树脂片段A ; (2)A经脱Fmoc后，与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯反应得到B ;B在1%_5%的TFA/DCM作用下得到C ;然后C在树脂上环化得到D ;D以TFA/TIS/EDT为切肽试剂、在乙醚中沉淀形成E ； (3)以Rinkamide AM树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为单体,依次连接氨基酸,得到片段F; (4)E与F偶联得到G，G经裂解得到卡贝缩宫素粗品H ； (5)将粗品溶于水，经过滤后通过制备HPLC进行分离纯化，得到卡贝缩宫素纯品； 其中，化学物质A至H的化学结构如下所示:
2.根据权利要求1所述的方法，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次与王树脂相连得到如式A的多肽树脂；采用偶联至多肽树脂上的缩合剂为下述缩合剂的一种或多种组合:DIC、HATU, TBTU, HBTU, PyBop, HOBt, Cl-HOBt, DIPEA、NMM, DIEA。
3.根据权利要求1所述的方法，Cys的侧链保护基为Mmt。
4.根据权利要求1所述的方法，脱除Mmt保护基试剂为1%_5%TFA的DCM溶液。
5.根据权利要求1 所述的方法；H-Tyr (OMe)-1le-Gln (Trt)-Asn (Trt)-Cys (Mmt)-树脂与溴代丁酸琥珀酰亚胺酯在选自由有机溶剂DCM，NMP和DMF组成的组中的至少一种溶剂中反应得到片段B。
6.根据权利要求1所述的方法，环化反应在树脂上进行，所用的试剂为:二异丙基乙基胺，三乙胺，LiOH等。
7.根据权利要求1所述的方法，采用E偶联至F肽树脂上的缩合剂为下述一种或多种组合:DIC、HATU, TBTU, HBTU, PyBop, HOBt, Cl-HOBt, DIPEA、ΝΜΜ、DEPBT, DIEA。
8.根据权利要求1所述的方法，以TFA/TIS/EDT为切肽试剂，其比例为90.0:5.0:5.0，最后在乙醚中沉淀得到卡贝缩宫素的粗品H。
9.根据权利要求1所述的方法，以C18柱为填料柱，通过制备HPLC进行分离纯化，流动相为硫酸铵的水溶 液和乙腈的混合液，检测波长为280mm。
【文档编号】C07K1/04GK103833831SQ201410076731
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】袁剑琳, 陈超, 张皓, 张巍, 张成广 申请人:海南双成药业股份有限公司