一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:原料处理、超声波处理、高压处理、蛋白粗提和蛋白纯化，干燥后得成品。相比现有的技术，产品含量高，时间大为缩短。
【专利说明】一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种亲糖蛋白的制备方法，具体涉及一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]海藻生长在海洋中，是植物中的隐花植物。无根本意义上的根茎叶，通过袍子来繁殖。有一些海藻类可以入药，如海带、紫菜、裙带菜、石花菜、龙须菜等。最常见的海藻是大型的海草、绿藻、红藻、褐藻等。在水深50公尺以内形成明显的生长带。生长在高潮线上的海藻长暴露在空气中，低潮线以下的海藻则不能长期暴露于空气中，所以不能近海岸线生长。如墨角藻、巨藻、海囊藻和海带藻等则只能生长在18度以下的冷水水域。它们一般被认为是简单的植物，由于藻类的结构简单，所以有的植物学家将它跟菌类同归于低等植物的“叶状体植物群”。海藻中具有增强免疫力和抗癌细胞的物质，如多糖类，红藻、紫菜、海萝等中有含有这一类物质。海藻中还含有多种食物纤维，能够帮助消化和促进废物排泄等功能。海藻中含有多种维他命，对心脏病等各种病症都有着一定的缓解作用。其含有烟酸碱能够治疗关节炎、偏头痛和失眠等症状。其含有的氨基酸、脂肪酸、无机元素等对人体健康有着一定的良性影响。
[0003]海藻还含有一种特殊的蛋白质称为亲糖蛋白，它对特定糖类具有亲和性而与之非共价结合。亲糖蛋白和细胞膜糖分子结合后会造成细胞沉降现象，因此是一种凝集素。研究发现海藻的亲糖蛋白不但可以凝集红血球、肿瘤细胞、淋巴球、酵母、海洋细菌及单细胞蓝绿藻，也能促进小老 鼠及人体淋巴球分裂作用。有些海藻亲糖蛋白能抑制肿瘤细胞的增殖，如抑制白血病细胞株及老鼠乳癌细胞的增长。又如将海藻亲糖蛋白予以染色并结合在癌细胞上，便可以诊断或追踪人体内癌细胞的分裂及转移情形。台湾将海藻亲糖蛋白应用在人体保健及医药方面的研发，多数尚在开始的阶段，不如多糖类成熟，有待积极研究开发。可预期的是海藻亲糖蛋白未来在免疫系统机能诊断、肿瘤形成及转移诊断及其它临床应用上，具有很大潜力。当前首先应加强海藻活性种类筛选，进而分离纯化亲糖蛋白，并分析其生化特性及构造，以供后续研究及扩大未来应用，提高其在医药及保健上的价值。目前，针对从海藻中提取亲糖蛋白的研究报道比较少。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种工艺成熟、适合生产的从海藻中提取亲糖蛋白的方法。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0006]一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:
[0007]a.原料处理:将新鲜海藻洗净后加入纯净水绞碎；
[0008]b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2,并保持10-20min,使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至0kgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理20-30min，作用温度40_50°C，功率为200-300W，过滤，得到海藻蛋白提取液；[0009]c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置10-15分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置10-15分钟，收集沉淀；
[0010]d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过葡聚糖凝胶柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液；
[0011]e.将流出液冷冻干燥后，得成品。
[0012]本发明所述的海藻优选海草、绿藻、红藻和褐藻。
[0013]优选的，步骤a中海藻和纯净水的重量比为1:1-4 ；
[0014]优选的，步骤b中超声波处理时间25min。
[0015]优选的，步骤b中超声波作用温度45°C。
[0016]优选的，步骤b中超声波功率250W。
[0017]优选的，步骤c中葡聚糖凝胶柱的型号SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-1OO 和 SephadexG-200。
[0018]采用本发明的方法以新鲜海藻为原料提取亲糖蛋白，与现有技术相比，本发明的优点:
[0019]1、本法明方法将 超声波、高压等先进技术综合使用来制备海藻亲糖蛋白，工艺创新，适合大生产。工艺成熟、可靠，该法能够节约成本、减少能耗，提高提取效率。
[0020]2、海藻中亲糖蛋白属于胞内蛋白质，因此要进行亲糖蛋白的提取前必须先使其溶出，故须要破碎其细胞壁、细胞膜以使蛋白溶于提取液中。目前常用的使细胞破碎的方法有:反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、和组织捣碎法等。但是在实际操作时反复冻融法操作起来相对简便，但是一般只适用于少量样品的处理；化学试剂处理法，比如用十二烷基磺酸钠破坏细胞膜提取蛋白，但是由于该法加入了化学试剂势必会增加后期蛋白纯化的难度，而且操作不当也极易引起蛋白质变性；溶胀法在蒸馏水中需要浸泡至少10d，或在低盐溶液中也要浸泡3-4d，周期过长而少用。本发明采用超声波、高压技术来进行细胞破碎，适合工业化生产。
[0021]3、蛋白粗提:目前常用的方法有:盐析法、结晶法、等电点沉淀法和超滤法等。等电点沉淀法的原理是蛋白质在其等电点时溶解度最小，故可将其沉淀析出，但是由于亲糖蛋白对PH值较为敏感，在不同pH值下亲糖蛋白的稳定性不同，易引起蛋白变性；结晶法的提取原理是不同种类亲糖蛋白在低浓度硫酸铵中可产生不同结晶体，此方法虽纯度很高，但其提取周期较长；超滤法是应用超滤膜来过滤亲糖蛋白的粗提液，获得亲糖蛋白粗制品，该法的优点在于产品易于干燥，脱水方便，且提取的亲糖蛋白安全无毒，易于纯化，但是膜容易堵塞。本发明中使用硫酸铵溶液的盐析法，通过加入盐溶液使蛋白沉淀析出，其沉淀效果较好。
【具体实施方式】
[0022]下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0023]实施例1:
[0024]一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:
[0025]a.原料处理:将IOkg海草洗净后加入纯净水IOkg绞碎；
[0026]b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2,并保持IOmin,使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至Okgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理30min，作用温度40°C，功率为300W，过滤，得到海藻蛋白提取液；
[0027]c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置10分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置15分钟，收集沉淀；
[0028]d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过型号S印hadexG-200葡聚糖凝胶柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液；
[0029]e.将流出液冷冻干燥后，得海藻亲糖蛋白，含量98.56%。
[0030]实施例2:
[0031]一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:
[0032]a.原料处理:将IOkg绿藻洗净后加入纯净水40kg绞碎；[0033]b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2，并保持20min，使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至Okgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理20min，作用温度45°C，功率为200W，过滤，得到海藻蛋白提取液；
[0034]c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置15分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置10分钟，收集沉淀；
[0035]d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过型号SephadexG-75葡聚糖凝胶柱，以蒸懼水洗脱，收集流出液；
[0036]e.将流出液冷冻干燥后，得海藻亲糖蛋白，含量99.12%。
[0037]实施例3:
[0038]一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:
[0039]a.原料处理:将IOkg红藻洗净后加入纯净水20kg绞碎；
[0040]b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2,并保持15min,使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至Okgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理25min，作用温度50°C，功率为250W，过滤，得到海藻蛋白提取液；
[0041]c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置15分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置10分钟，收集沉淀；
[0042]d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过型号SephadexG-1OO葡聚糖凝胶柱，以蒸懼水洗脱，收集流出液；
[0043]e.将流出液冷冻干燥后，得海藻亲糖蛋白，含量99.67%。
[0044]实施例4:
[0045]一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤:
[0046]a.原料处理:将IOkg褐藻洗净后加入纯净水30kg绞碎；
[0047]b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2,并保持20min,使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至Okgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理30min，作用温度45°C，功率为250W，过滤，得到海藻蛋白提取液；
[0048]c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置12分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置10分钟，收集沉淀；
[0049]d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过型号SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，以蒸懼水洗脱，收集流出液；
[0050]e.将流 出液冷冻干燥后，得海藻亲糖蛋白，含量99.26%。
【权利要求】
1.一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，包括下述步骤: a.原料处理:将海藻洗净后加入纯净水绞碎； b.细胞破碎:将绞碎的海藻中放入高压罐中，加压至3kgf/cm2，并保持10-20min，使其压力均匀，然后在0-3秒突然使压力降至Okgf/cm2，过滤，将滤液用超声波处理20-30min，作用温度40-50°C，功率为200-300W，过滤，得到海藻蛋白提取液； c.蛋白粗提:向得到海藻蛋白提取液中，加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到25%，静置10-15分钟，继续加入硫酸铵溶液，使得硫酸铵的饱和度达到50%，静置10-15分钟，收集沉淀； d.蛋白纯化:将收集的沉淀通过葡聚糖凝胶柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液； e.将流出液冷冻干燥后，得成品。
2.根据权利要求1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤a中海藻为海草、绿藻、红藻和褐藻。
3.根据权利要求1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤a中海藻和纯净水的重量比为1:1-4。
4.根据权利要求1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤b中超声波处理时间25min。
5.根据权利要求 1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤b中超声波作用温度45 °C。
6.根据权利要求1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤b中超声波功率250W。
7.根据权利要求1所述的海藻中提取亲糖蛋白的方法，其特征在于:步骤c中葡聚糖凝胶柱的型号为 SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-1OO 和 SephadexG-200。
【文档编号】C07K14/405GK103951737SQ201410162538
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】归三岷 申请人:钦州市山海生物科技有限公司