制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法
【专利摘要】本发明涉及制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，利用高纯度大豆皂苷Ab、碳二亚胺试剂和十二胺制备得到目标产物；采用分析型HPLC、PDA检测器和ELSD检测器检测目标产物；采用ESI-MS鉴定目标产物的分子量；采用制备型液相色谱纯化分离得到十二胺的亲脂性衍生物AbD；采用NMR解析目标产物的结构。与现有技术相比，本发明制备了高纯度修饰物AbD，目标产物分子量为1603，产率为6.94％，溶血率低，对小鼠脾脏淋巴细胞的体外免疫有增强作用，同时提高了OVA免疫小鼠血清中四种特异性抗体的水平。
【专利说明】制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物技术，尤其是涉及一种制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法。
【背景技术】
[0002]大豆皂苷隶属于五环三萜类齐墩果烷型皂苷，由大豆苷元(Soyasapogenol)和低聚糖两部分组成。它主要存在于大豆种子中，约占后者的0.6%-6.2%，是三萜类同系物的羟基和糖分子环状半缩醛羟基失水缩合而成。大豆皂苷苷元分为:苷元(Soyasapogenol)A、昔兀B和昔兀E ;糖链上的单糖主要有β -D-匍萄糖、β -D-半乳糖、β -D-木糖、a -L-鼠李糖、a-L-阿拉伯糖、β-D-葡萄糖醛酸等6种。近年来国内外学者通过对大豆皂苷的生物学、生理学和药学的活性试验都证明有多种有益的生理功效，包括抗肿瘤、抗癌、降血脂、降胆固醇、降甘油三酯、抗血栓、抗凝血和免疫调节作用等。
[0003]皂苷是两亲分子，由亲水基团糖链和疏水基团苷元构成。研究发现皂苷的生理活性不仅与苷元，还与其糖链结构关系密切。糖侧链的个数、糖链上的特殊基团都会影响皂苷的生物活性。由于天然的皂苷分子可能有许多缺点而不一定是最佳活性状态，对皂苷的糖链进行修饰是获得高生物活性物质的一种方法。通常将待引入基团连接到糖链中的羧基、氨基、羟基等基团上进行衍生化，完成皂苷的修饰。
[0004]目前国内外对于大豆皂苷单体的修饰主要集中于酶法的水解。金凤燮等人利用霉菌发酵提取酶液分解大豆 皂苷，水解部分或全部糖链，Chang等利用人的排泄物中微生物菌群发酵酶解大豆皂苷单体Ab，逐一减少其所含糖链直至苷元。
[0005]“佐剂”来源于拉丁文单词，意思为帮助。其自身可能无免疫原性，但可与抗原共同作用，延长/增强免疫反应。上世纪二十年代起在疫苗中使用佐剂以来，其种类与数量不断增加，其中免疫刺激复合物(ISCOMs)在疫苗中作为亚单位佐剂的使用引起了人们的高度重视。铝胶作为最广泛使用的免疫佐剂，安全无毒。然而，铝胶只能诱导Th2免疫反应，而对Thl型免疫应答无显著作用，这就导致铝胶对于一些传统传染源引起的疾病无能为力。
[0006]其他效果更强的佐剂如脂多糖(LPS)、弗氏完全佐剂(FCA)因其高毒性限制了在人用疫苗上的使用。如南美皂树皮中提取分离得到的皂苷Quil A及其主要成分QS-21等作为免疫佐剂虽然对Thl型和Th2型免疫反应都有强烈的诱导作用，显著增强机体体液免疫和细胞免疫水平。但是，它们毒副作用大、溶血性强以及稳定性差。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供结构新颖、药用价值大、溶血率低、安全性高且可提高机体免疫力等特点的一种免疫佐剂活性增强的大豆皂苷Ab亲脂性衍生物的制备方法。本发明通过碳二亚胺法合成得到反应产物，取乙酸乙酯层经分析型HPLC检测，ES1-MS鉴定目标产物分子量后，由液相制备型HPLC分离纯化得到目标产物，NMR对其做出有效地检测和判断。[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0009]制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，采用以下步骤:
[0010](I)利用高纯度大豆皂苷Ab、碳二亚胺试剂和十二胺制备得到目标产物；
[0011 ] (2)采用分析型HPLC、PDA检测器和ELSD检测器检测目标产物；
[0012](3)采用ES1-MS鉴定目标产物的分子量；
[0013](4)采用制备型液相色谱纯化分离得到十二胺的亲脂性衍生物AbD ;
[0014](5)采用NMR解析目标产物的结构。
[0015]步骤⑴具体采用以下步骤:
[0016]a、混合反应:将高纯度大豆皂苷Ab溶于吡啶，先后加入二环己基碳二亚胺，N-羟琥珀酰亚胺和十二胺，其中大豆皂苷、二环己基碳二亚胺、N-羟琥珀酰亚胺、十二胺的质量比为80: 65-70: 35-40: 80-85，磁力搅拌转速为800r/min，室温下反应3天；
[0017]b、加水终止反应:向反应混合液中加入超纯水，超纯水与吡啶的体积比为1: 1，控制磁力搅拌转速为800r/min,室温过夜；
[0018]C、静止分层:过夜处理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与超纯水的体积比为2: 1，振荡器间歇振摇lOmin，转至分液漏斗静置过夜，得到水层和乙酸乙酯层。
[0019]所述的高纯度大豆皂苷Ab的纯度大于99% (w/w)。
[0020]步骤⑵中，分析型HPLC在检测目标产物的色谱条件:分离柱=AquasilC18 (150mmX4.6mm, 3 μ m);温度:25°C;流速 lmL/min ;流动相 A:0.002% (v/v)乙酸-水溶液，B:0.002% (v/v)乙酸-乙腈溶液；检测器:PDA检测器的监控波长205nm，HPLC采用梯
度洗脱。
[0021 ] HPLC梯度洗脱程序如下:
【权利要求】
1.制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，该方法采用以下步骤: (1)利用高纯度大豆皂苷Ab、碳二亚胺试剂和十二胺制备得到目标产物； (2)采用分析型HPLC、PDA检测器和ELSD检测器检测目标产物； (3)采用ES1-MS鉴定目标产物的分子量； (4)采用制备型液相色谱纯化分离得到十二胺的亲脂性衍生物AbD； (5)采用NMR解析目标产物的结构。
2.根据权利要求1所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，步骤(1)具体采用以下步骤: a、混合反应:将高纯度大豆皂苷Ab溶于吡啶，先后加入二环己基碳二亚胺，N-羟琥珀酰亚胺和十二胺，其中大豆皂苷、二环己基碳二亚胺、N-羟琥珀酰亚胺、十二胺的质量比为80: 65-70: 35-40: 80-85，磁力搅拌转速为800r/min，室温下反应3天； b、加水终止反应:向反应混合液中加入超纯水，超纯水与吡啶的体积比为1: 1，控制磁力搅拌转速为800r/min，室温过夜； C、静止分层:过夜处理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与超纯水的体积比为2: 1，振荡器间歇振摇lOmin，转 至分液漏斗静置过夜，得到水层和乙酸乙酯层。
3.根据权利要求1或2所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，所述的高纯度大豆皂苷Ab的纯度大于99% (w/w) 0
4.根据权利要求1所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，分析型HPLC在检测目标产物的色谱条件:分离柱=AquasilC18 (150mmX4.6mm, 3 μ m);温度:25°C;流速 lmL/min ;流动相 A:0.002% (v/v)乙酸-水溶液，B:0.002% (v/v)乙酸-乙腈溶液；检测器:PDA检测器的监控波长205nm，HPLC采用梯度洗脱。
5.根据权利要求1所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用ES1-MS检测的条件:扫描范围:100-2000m/z，毛细管电压:1.5kV，样品流速:15 μ L/s ;扫描时间:3min ;流量:0.2mL/min ;温度:2000C0
6.根据权利要求1所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，步骤(4)中，制备型液相色谱的分析条件:Daisogel C18-10 μ m, 100 A(20mmX 250mm)分离柱；流速10mL/min ;流动相为A:水；B:0.01% (v/v)三氟乙酸-乙腈；检测器:PDA检测器；HPLC梯度洗脱，收集保留时间为95min的洗脱液，旋转蒸发后冻干浓缩液。
7.根据权利要求1所述的制备活性增强的免疫佐剂大豆皂苷亲脂性衍生物的方法，其特征在于，步骤(5)中,NMR的分析条件:扫场范围为13C:-12~230ppm, 1H:-1~13ppm ;溶剂:氘带DMSO。
【文档编号】C07H1/00GK104031111SQ201410245440
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】赵大云, 任小云, 冯凡 申请人:上海交通大学