花生nbs-lrr基因及其在烟草抗青枯病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因 AhRRS5 及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程【技术领域】。该基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。构建过量表达载体转化烟草，通过对转基因植株进行青枯菌接种鉴定和分子检测，其在烟草中超表达可显著提高转基因烟草对青枯病的抗性，表明 AhRRS5 在植物应答青枯病菌侵染中起着重要的调节作用，这对植物的抗青枯病基因工程育种应用有重要意义，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。
【专利说明】花生NBS-LRR基因及其在烟草抗青枯病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种花生青枯病抗性相关基因4^况^及其超表达载体的构建及在烟草抗青枯病基因工程中的应用，属于植物基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物在生长发育过程中会受到诸如细菌、病毒、真菌以及昆虫等病原生物的侵扰，但是由于复杂而漫长的的生物进化过程中，植物已经形成了一套完整的，有效的防御病害侵染的机制。在植物和病原物互作过程中，一些病原物被植物的第一道防线阻止杀死，一些被植物的先天性免疫系统中的PTI抑制，但是还有一些病原物通过分泌毒性因子保持病原菌的毒力，这些毒性因子抑制PTI，引发植物感病，导致植物产生效应物引发的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS),通常植物会产生一种由效应物引发的先天性免疫反应即ETI，ETI通常是由R蛋白介导的，R基因编码的产物能直接或间接识别病原菌的效应蛋白(无毒蛋白，avr-R)，并侵染部位启动快速的防御应答机制，通常会引起植物细胞的超敏反应(HR)，激发下游一系列防卫反应。
[0003]由R基因介导的植物抗病性研究早已有报道，根据Flor的“基因对基因”假说，植物细胞中的R基因能够专一'I"生识别病原物中的无毒基因(avirulence gene, avr),并激发植物的抗病反应，只有当携带R基因的植物与带有avr基因的病原物发生作用时，植物才能表现抗病，缺少任何一方都会导致感病。这一遗传假说对于解析植物宿主-病原物的互作关系提供了理论基础。目前R蛋白和avr蛋白直接的作用的证据并不多，多数情况下抗病基因编码的R蛋白是通过植物中称之为“卫士蛋白”的其他蛋白协作与无毒Avr蛋白间接相互作用。最近，“诱饵模型”认为卫士蛋白被“诱饵蛋白”所取代，“诱饵蛋白”只是替代物而不是Avr作用的目标。大部分的R基因通常包括核苷酸结合位点(nucleotide bindingsite, NBS)和亮氨酸富集重复(leucine-rich repeat, LRR)结构域,NBS结构域通常由不同的保守结构域组成如P-Loop，GLPL, Kinase-2和Kinase_3a模块，这些保守的模块在植物的信号转导中起重要作用，在病原菌侵染时这些模块通常能够通过激酶区的激活来诱导防御反应。LRR结构域通常由包含亮氨酸的24个氨基酸残基，在植物与病原菌互作起着蛋白之间的互作以及植物与病原菌的识别作用。NBS-LRR类抗病基因根据N端的结构差异分为两大亚类:TIR-NBS-LRR类抗病基因和CC/LZ-NBS-LRR类抗病基因。
[0004]目前已经在单双子叶植物中克隆得到了 70多个抗病基因，大量的R基因通过图位克隆和转座子标签等方法已经在农作物上克隆和鉴定。由于大多数植物的抗青枯病基因并不是单个基因控制的，而是由数量遗传性状控制的，而这种数量性状控制青枯病抗性的位点在很多植物上如番茄，茄子，烟草，苜蓿等被鉴定，由单基因控制的青枯病抗性目前只有拟南芥上两个基因RRSPm及，拟南芥上通过图位克隆获得的一个抗青枯病基因
是一类典型TIR-NB-LRR类抗病基因，而且在其C端具有一个可以激活下游防御基因表达的转录因子WRKY，青枯菌的/?/--是抗病基因似对应的无毒基因，在其N端有一个便于向核内转运的细胞核定位信号(nuclear located signal,NLS) ;W57~/t基因的N端的LRR结构域能够识别并结合无毒蛋白PopP2，在PopP2核定位信号NLS使得RRSl-R蛋白导向细胞核内，在核内会通过WRKY转录因子结构域活化下游信号的传导，进而引发下游防御相关基因的表达，从而产生对青枯菌的抗性。而及是拟南芥另外一个抗青枯病的基因是LRR-RLK类基因，并不是严格意义上的NBS-LRR类基因，但是及?汉7以基因是通过胞外激酶区磷酸化调控下游基因对青枯病的防御反应。
[0005]花生(Arachis hypogaea.L)是世界上四大油料作物之一，是我国重要的出口作物，在我国国民生产中占据重要的地位。而由青枯雷尔氏{Ralstonia solanacearum)引起的青枯病严重影响着花生的产量、品质、生产和加工，有些地区由青枯病引起的花生产量会减产10%-50%不等，有些地区则会绝收。目前还没有有效的防治手段解决青枯病问题。花生青枯病的分子生物学机制尚无人研究，严重影响着花生抗青枯病的分子育种。随着大规模测序和功能基因组学的发展，越来越多的R基因将会被发现，这些R基因将会通过反向遗传学的方法确定其功能，而了解这些R基因与病原菌互作的分子机制将为植物的抗病分子机制以及分子育种提供理论基础，具有重要的研究价值和意义。
[0006]本发明针对以上【背景技术】，根据花生抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA与花生生物非生物胁迫测序构建的基因芯片杂交结果在抗病品种上获得一个受青枯菌诱导上调表达2倍的NBS-LRR基因，通过RACE技术获得其全长cDNA序列，具有典型的R基因的特征保守结构域，亚细胞定位于细胞核上，在抗感花生品种接种青枯囷后抗、感青枯病品种都能能够上调表达，而感病品种则上调较多，构建过量表达载体通过农杆菌介导转化烟草表现对青枯病的抗性。通过对转基因烟草接种青枯菌后防御相关基因的分析，推测可能参与花生对青枯菌的防御反应。这就为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。
【发明内容】
[0007]本发现提供了一种受青枯菌诱导上调表达花生NBS-LRR类抗病基因AhRRS5R哀在烟草抗青枯病基因工程中的应用，将大力促进烟草抗青枯病基因工程的发展与应用。
[0008]本发明提供了一种花生NBS-LRR基因，命名为况基因，该基因含有如SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。所述的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。花生基因能够显著提高烟草青枯病的抗性能力，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础。
[0009]本发明的花生基因主要通过抗青枯病花生品种在接种青枯菌和非接种的mRNA与其杂交获得了大量的基因表达差异的信息，对青枯菌诱导差异表达上调2倍的NBS-LRR类抗病基因进行全长cDNA的克隆，克隆全长基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本发明还提供了包含所述花生NBS-LRR基因的超表达载体；以及，所述超表达载体的构建方法:酶切连接替换植物表达载体PBI121-GUSA中的⑶S基因，构建CaMV 35S启动子驱动基因的植物表达载体pBI121-AhRRS5-0E。
[0011]最后，本发明提供了所述的花生NBS-LRR基因或所述的超表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。
[0012]本发明的花生必似基因功能鉴定是通过酶切连接替换植物表达载体pBI 121-GUSA中的⑶S基因，构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS遙因植物表达载体pBI121-AhRRS5-0E，将其转化ΕΗΑ105农杆菌，通过叶盘法将其导入翠碧一号烟草上，对转基因烟草进行青枯菌的接种，进而对其进行抗性鉴定，结果证明提高了该转基因对烟草的抗青枯病性。
[0013]本发明的花生基因超表达烟草相比野生型烟草对青枯病抗病能力显著提高，表明该基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为RACE获得必观基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA的电泳图；
图2为过量表达载体的构建及验证；
图3为亚细胞定位结果；
图4为在抗、感青枯病花生品种中的表达差异；*，**分别表明两两均值差异显著(Ρ〈0.05)和差异极显著(Ρ〈0.01)。
[0015]图5为必似?在转基因烟草中超表达对青枯病侵染的抗性。
【具体实施方式】
[0016]【实施例1】RACE获得必观基因3’未知序列和5’未知序列
根据花生非生物和生物胁迫454测序的转录组合成花生的表达谱基因芯片(罗氏公司合成)，利用抗青枯病品种接种前后芯片杂交筛选青枯菌诱导前后基因的差异表达获得候选基因片段，设计一对基因引物 PRRS _5_F (5’- GCTTTGTAGAGGCAAATCAAGGCTG -3’)和PRRS_5-R (5，- TGAAGAGAAGGCATCCAATCAGGTAAG -3’)；再根据模板单链 cDNA 合成过程所加的接头序列 RACE-F (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT)和 RACE-R (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd ⑴ 30N-1N-3’)，利用 PRRS_5_R 引物和 RACE-F 引物以及 PRRS _5_F 引物和RACE-R引物配对分别进行Y和:V - RACE反应，5' -RACE反应条件是94°C 5min—(94°C30s ^ 57 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30 cycles ^ 72 °C 1min ；3 ; -RACE 反应条件是 94 °C5min— (94°C 30s ^ 72 °C 2min)5cycles — (94 °C 30s ^ 64 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30cycles — 72°C 1min ;根据生物信息学预测的目的条带基因的大小对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5'和3'未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计全长cNDA弓I物AhRRS5- FL-FC 5’ -CATATAACTAAGTGTGGGCCATTTCGAGAGG -3’)和 AhRRS5_FL_R (5， - TGGGTTTATTGAGCAATATTTACACTATTTAC-3 ’)引物从单链cDNA扩增获得全长cDNA序列，对PCR产物有目的的回收连接进行T-A克隆，阳性克隆送华大基因有限公司测序并保存质粒。基因的3’未知序列和5’未知序列以及全长cDNA克隆的电泳图如图1所示；其全长cDNA序列如SEQ ID N0.1所
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[0017]【实施例2】必观超表达载体构建与验证
通过 AhRRS5-0E-F (5，- ATTAGGATCCACCATGGCTGAGAGTGCCATAGCCT-3’)和 AhRRS5_0E_R(5，- ATTTAGGCGCGCCTACACCTTTGAGAGAGTGCTGCGT-3’)这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到包括终止密码的基因cDNA开放阅读框，5'端3'端分别带有BamHl和Ascl酶切位点，对本实验室构建的由2XCaMV 35S启动子驱动的pBI121_GUSA和扩增得到的AhRRS5g的片段同时用BamHl (购自NEB公司)和Ascl (购自NEB公司)双酶切，回收目的片段，用T4连接酶16°C过夜连接，转化到大肠杆菌DH5 α菌株，构建P35S:: AhRRS5_0E超表达载体，经过PCR验证以及酶切验证确定其载体构建的正确性，其载体图如图2所示。通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。
[0018]【实施例3】必似?基因表达产物的亚细胞定位
对于亚细胞定位载体,通过 AhRRS5-SL-F (5，-ATTAGGATCCACCATGGCTGAGAGTGCCATAGCCT-3’ )和 AhRRS5-SL-R (5，-ATTAGGCGCGCCACACCTTTGAGAGAGTGCTGCGT-3’ )这对引物从具有完整读码框的质粒中扩增得到不包括终止密码的基因cDNA，5'端3'端分别带有BamHl和Ascl酶切位点，对本实验室构建的pBI_GFP和扩增得到的必基因同时用BamHl和Ascl双酶切，经过连接和转化构建p35S: -.AhRRS5::GFP载体。鉴定成功的重组质粒用基因枪轰击洋葱表皮细胞，导入洋葱表皮后，将平板放入组培室避光培养24-36h，使质粒编码的GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内充分表达。然后将洋葱表皮置于双蒸水中浸泡，随后在荧光显微镜上进行观察，观察条件为蓝色激发光，并进行图象采集。结果显示基因的编码产物定位在细胞核上(图3所示)。
[0019]【实施例4】在抗、感青枯病花生青枯菌处理后的表达模式分析
为了分析AhRRS5基因在抗、感青枯病花生品种接种青枯菌表达上的差异，本研究采取实时荧光定量PCR方法对抗、感青枯病花生材料粤油92 (YY 92)和新会小粒(XH)剪叶法接种青枯菌处理后，在不同时间点分析该基因的表达情况。采用CTAB法提取花生和烟草叶片的总RNA,根据PrimeScript Reverse Transcriptase逆转录酶(购自TAKARA公司)说明书进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA稀释10倍，2μ?为模板，以Ahactin，Ntactin为内参基因，米用Eppendorf Mastercycler ep realplex实时突光定量PCR仪进行定量PCR反应，按照 TAKARA 公司 SYBR? Premix Ex Taq2(^L 的反应体系包括 10 μ? 2 X SYBR PremixEx-Taq buffer,正反引物各0.5μ?,补水到20μ?ο qRT-PCR反应条件:95°C预变性5min ；95°C 15s，60°C 15 s，72°C 30s，40个循环。相对表达量采用2_ΛΛ et (Livak)法计算。其中AACt= (CTgene - CTactin)处理-(CTgene - CTactin)对照。结果显示在抗病品种粤油 92(YY92)上，该基因表达表现先上调后恢复的情况，接种后24h后该基因表达上调2.5倍左右；而在感病品种新会小粒(XH)中，AhRRS5基因的表达量在接种青枯菌后整体表现上调的趋势，接种后24h该基因相对表达量上调最大，达到3.75倍，随着接种时间的推移，该基因的相对表达量略有减少的趋势。
[0020]【实施例5】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定
采取根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，把分别带有质粒P35S::AhRRS5-0E超表达载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种翠碧一号(CB-1),用100mg/L卡那霉素(Kan)筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500 mg/L头孢霉素(Cef )来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25 °C ±2°C，光照每天14h白天/1h黑夜。共培养培养基:MS培养基+0.1mg/L NAA (a-萘乙酸)+ lmg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤)，诱导筛选培养基:MS培养基+0.1mg/L NAA+lmg/L 6-BA+ 100 mg/L kan +500mg/L Cef，生根培养基:MS 培养基 +50mg/L Kan+500mg/L Cef。NAA, 6-BA, kan 和 Cef 购自 Sigma 公司。
[0021 ] 根据35S启动子和必胤基因序列设计一对弓丨物引物35S-F (5’ -TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3 ’)和 AMffSS-R (5 ’ -TCTATACCCACTAGGTCAGTGTTC-3 ’ )，CTAB 法提取转基因与非转基因烟草DNA，以两种转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，利用设计的35S-F 和 AhRRS5~R 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为:10 X buffer 2.Ομ?，dNTP 1.5μ1，35S-F0.AhRRS,5~R 0.5μ1, Taq 酶 0.?μ?, ddH20 14.4μ1，模板 DNA 1.Ομ?，总体积为 20μ1。反应程序为:94 0C 5 min — (94 O 30 s — 58°C 30 s — 72 °C 60 s) 40 cycles — 72 °C1min — hold at 4。。。
[0022]【实施例6】超表达转基因烟草的青枯病抗性鉴定
将获得的转基因烟草TO代抗病株系进行套袋自交收获Tl代转基因种子，利用Τ2代转基因种子进行转基因烟草表型分析与功能鉴定。将Τ2代转基因株系的种子以及野生型成熟种子分别种子无菌水浸泡24h，75%酒精30s，10%过氧化氢lOmin，无菌水清洗5_6次，播种MS培养上,十五天后,移栽于育苗盘,一个月后选取大小一致的苗移栽于小花盆中培养9周后，对烟草种子进行青枯菌叶脉注射接种处理，处理15后，况超表达烟草植株相对于野生型对照表现出对病原菌侵染的明显抗性，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡。相同试验至少重复三次以上，均有同一趋势结果。结果发现，况转基因烟草对青枯病菌明显强于野生型对照(图4)，说明参与了植物对青枯病菌的抗性作用。
【权利要求】
1.一种花生NBS-LRR基因，命名为况5.5基因，该基因含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的花生NBS-LRR基因，其特征在于:所述的况基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含如权利要求1所述花生NBS-LRR基因的超表达载体。
4.一种如权利3要求所述超表达载体的构建方法，其特征在于:酶切连接替换植物表达载体pBI121-GUSA中的⑶S基因，构建CaMV 35S启动子驱动基因的植物表达载体pBI121-AhRRS5-0E。
5.一种如权利要求1所述的花生NBS-LRR基因或权利要求3所述的超表达载体在烟草等植物抗青枯病基因工程中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK104480117SQ201410741491
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】庄伟建, 张冲, 陈华, 邓烨, 蔡铁城 申请人:福建农林大学