专利名称：一种生产抗生素的方法
技术领域：
本发明涉及已知抗生素的新生产方法，特别是从富伦菌素生产脱氧富伦菌素以及从中间体脱氧富伦菌素生产富伦菌素B的方法。
生物合成具有抗生素活性的富伦菌素，即下式化合物 首次报道于Antimicrob.Ag.Ann.1960.77-88(1961)。将从土壤中分离的弗氏链霉菌在搅拌和通气条件下进行培养，生成了富伦菌素。
此后报道了可用多种试剂还原富伦菌素，化学转化为脱氧富伦菌素，即下式化合物 [参见J.A.C.S.88，4109(1966)；J.A.C.S.99，1325(1968)；及美国专利说明书3,452,051]。
生物合成脱氧富伦菌素首次报道于美国专利说明书4，199，514及J.Antibiot.31，959-965(1978)。这些文献公开了在通气和需氧条件下发酵含有玫瑰暗黄链霉菌菌株AM—3867(FERM—P No.4359和ATCC No.31476)的培养基。发酵后的培养基中含有富伦菌素、脱氧富伦菌素及另一种抗生素，具有下式的富伦菌素B 发酵结束后，将培养液分离为菌细胞和滤液。可用常规方法处理链霉菌属微生物发酵产生的发酵液的滤液，如改变pH或温度(参见Belter等人的Bioseparations-Downstream processing forBiotechnology，J.Wiley & Sons，New York 1988，pp.17，25，99和105)。但是，现有方法是公开于美国专利说明书4，199，514和J.Antibiot.31，959-965(1978)的发酵结束后再分离和回收抗生素，以致富伦菌素B的回收率低于50％。
从本质上来讲，本发明目的在于提供一种生产脱氧富伦菌素，如需要，随后生产富伦菌素B的方法，此方法包括下列步骤在需氧条件下将一培养基(营养培养基)发酵以产生富伦菌素，此培养基中含有能产生富伦菌素的微生物。然后，在同一培养基(含有微生物)中在厌氧条件下使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素。如需要，在随后的回收和纯化步骤中再将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B。
令人惊奇地发现，发酵生成富伦菌素后，在无氧气存在(厌氧条件)下和在先前所用的微生物(细菌)细胞存在下在同一培养基中使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素，与原先获得的富伦菌素B相比，可使其最终产率提高。另外，此方法节省了处理时间、原料和设备，并简化了回收步骤。特别是，可以用生产富伦菌素的同一发酵设备将富伦菌素转化为脱氧富伦菌素。
因此，本发明涉及一种生产脱氧富伦菌素和，如需要，生产富伦菌素B的方法，此方法的特征是a)，在需氧条件下将含有能生成富伦菌素的微生物的培养基发酵以产生富伦菌素，然后b)，在同一培养基中在厌氧条件下使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素，并且如需要，c)，在随后的回收和纯化步骤中再将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B。
在本发明中，可使用任何能产生化合物富伦菌素的微生物。优选将玫瑰暗黄链霉菌进行诱变处理获得的玫瑰暗黄链霉菌突变菌株。美国专利说明书4,199,514非常具体地公开了一种优选突变菌株，玫瑰暗黄链霉菌AM—3867。最优选的突变菌株是1994年7月15日保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国马里兰)的玫瑰暗黄链霉菌突变菌株，ATCC No.55598，。可用于本发明的其他微生物包括弗氏链霉菌[Antimicrob.Ag.Ann.1960，77-80(1961)，ATCC No.10745]和保藏在ATCC(其编号为No.19921)的玫瑰暗黄链霉菌突变菌株。
可按任何常规方法进行微生物的制备和富伦菌素的实际发酵。例如，微生物可冻干贮存或用5％乳糖和10％甘油在液氮中保存。冻干贮存的可融化并用无菌去离子水再水化。将培养物连续稀释并涂布在琼脂斜面和/或平面上，以便在培养箱中生长并生产孢子。将孢子从斜面或平面上刮下来，接种到锥形烧瓶中的种子培养基里，或冷冻于5％乳糖和10％甘油中用作以后接种。种子培养基中含有，例如，淀粉、葡萄糖、Bacto胰蛋白胨、酵母浸膏和碳酸钙。将接种后的种子培养基进行培养后，例如在旋转振荡器中培养，将生长的微生物再接种到营养培养基中进行发酵。根据本发明，在生产富伦菌素的第一步骤(a)中典型的营养培养基中含有玉米油、糊精、玉米浸膏、蔗糖糖蜜、豆粉、甲酸钠或柠檬酸钠、酵母浸膏、硫酸镁、磷酸二氢钠、碳酸钙和一种消沫剂例如聚丙二醇单丁基醚。
发酵温度通常约为25℃至34℃。经过适宜时间后，判定富伦菌素的滴度(浓度)已经达到了它的最高值，即富伦菌素的产率不再随时间的延长增加，则发酵结束。可以用，例如，高效液相色谱法(HPLC)，测定富伦菌素的滴度。通常发酵时间约为160至240小时。
发酵培养基中形成并富集了富伦菌素和少量脱氧富伦菌素。随后对发酵液进行厌氧处理[步骤b]促进富伦菌素在原处转化为脱氧富伦菌素。此处理优选包括在富伦菌素的滴度达到或几乎达到其最大值时向发酵液中通入氮气以除去氧气。当发酵液中除去氧气时，其pH应约为7.0～9.0，优选约7.5～8.4，最优选约为7.9。如需要，可加入适量菌细胞可生理接受的酸调节pH至约7.9，优选磷酸。然后，将发酵液在厌氧条件下放置约2～8小时，具体时间决定于培养基的组成和富伦菌素的浓度。转化完全后(通常用HPLC法测定)加入适量的任何一种碱调节发酵液的pH至约为10～11.5，优选氢氧化钠或氢氧化氨，再于厌氧条件下放置0.5～1小时。此pH调节是为了消除细胞的活性。厌氧处理期间发酵液的温度不是一个苛刻的参数，只要此温度不致高到破坏了微生物，通常所用的温度范围约为15℃～27℃。在此范围的上限区时效果最好。
优选的转化和回收富伦菌素B的方法示于
图1的流程图中(其中标出了优选的溶剂)。
转化完全后(优选用HPLC法测定)，从发酵液中分离并搜集所得的脱氧富伦菌素。优选加入适量的任何一种酸调节发酵液的pH至约为2～5.5，优选用硫酸或盐酸(1)，然后在pH3与约为其体积0.5～2倍的低级烷基乙酸酯，优选乙酸乙酯溶剂混合(2)。将所有发酵液和溶剂的混合物离心，得到上层溶剂相，优选乙酸乙酯(3)。比重大的下层相中包括提取过的发酵液、细胞和固形物，将下层相分出并弃去。然后将保留的溶剂提取液浓缩，得到脱氧富伦菌素的浓缩液，约为15～20g/L(4)。
为了除去杂质，可在转化为富伦菌素B之前进一步处理所收集的脱氧富伦菌素。优选将上述溶剂的浓缩液用约为其体积0.3～1倍的去离子水洗涤(5)。调节pH至约为5.5～6.3，优选加入适量的氢氧化铵作为碱，将溶剂浓缩液/水混合物混合约0.25～0.75小时，放置，使两相分离(6)。分离上层的溶剂浓缩液，加入适量的任何一种酸调节其pH至约为2.8～3.5，优选用硫酸或盐酸(7)。将溶剂浓缩液层与约为其体积0.12～0.17倍的去离子水混合以便于调节pH(8)。将含有脱氧富伦菌素的溶剂浓缩层与水层分离(9)，将水洗过的溶剂提取浓缩液进一步浓缩，至形成油状膏体或不再产生馏分为止(10)。
然后，将脱氧富伦菌素经下列回收纯化步骤转化成富伦菌素B加热脱氧富伦菌素至温度不超过约45℃，优选在比大气压力约高0.35～0.70kg/cm2的压力下进行(大气压力本身约为1.033kg/cm2)。将油状膏体浓缩物用约为其体积12～18倍的低级链烷醇，如甲醇或乙醇，优选甲醇提取(具体用量决定于所得发酵液中渣油的含量)，直至链烷醇提取液中脱氧富伦菌素的浓度约为7～12g/L(11)。收集上层链烷醇相(12)，加入适量的氢氧化铵调节pH至约6.0～6.2，混合约0.2～0.5小时(13)。然后将链烷醇提取液加热(反应)约9～16小时，温度约为36℃～45℃，气压约为5～10psig[以磅每平方英寸计，超出常压(空气)14.7psi的压力]，将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B(14)。5—10psig约等同于0.35—0.7kg/cm2。加入适量的任何一种酸调节链烷醇提取液的pH至约2.8～3.4，使反应停止，优选硫酸或盐酸(15)。
然后将富伦菌素B结晶。将链烷醇(优选甲醇)提取液浓缩至富伦菌素B的浓度约为45～60g/L(16)。将所得的浓缩浆液在0℃～4℃冷却约16～24小时，过滤浆液，将所得的湿滤饼用等体积冷的(例如在温度约为1—15℃范围内，优选约为4℃)低级链烷醇(优选甲醇)洗涤，pH约为2，然后干燥(17)。将干燥的富伦菌素B在约为其体积10倍的低级(特别是C5-10)烷烃(优选正己烷)中再形成浆液，约10—15分钟后过滤浆液，将所得滤饼干燥(18)。可将链烷醇母液浓缩，二次回收其中的富伦菌素B。
另一种转化和回收富伦菌素B的方法示于图2的流程图中(其中标出了优选的溶剂)。
此种将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B的方法省去了前述方法中的水洗步骤和链烷醇(优选甲醇)提取步骤。此方法包括下列步骤将脱氧富伦菌素浓度约为15～20g/L的低级烷基乙酸酯(优选乙酸乙酯)提取浓缩液进一步浓缩至形成油状膏体或不再产生馏分为止(5’)。将油状膏体浓缩物与约为其体积1～3倍的低级烷烃(优选正己烷)混合0.25～0.5小时以溶解此油状物(6’)。将脱氧富伦菌素的烷烃浆液过滤，将滤饼用约为其体积2～3倍的低级(特别是C5-10)烷烃(优选正己烷)洗涤，然后干燥(7’)将此固体再次溶解于低级烷基(优选乙基)乙酸酯中，使脱氧富伦菌素浓度约为30～50g/L(8’)。加入适量氢氧化铵调节此溶液的pH至约为5.9～6.8(9’)。然后将低级烷基乙酸酯溶液加热(反应)约16～36小时，温度约为36℃～45℃，气压约为5～10psig，将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素(B(10’)。将溶液中转化的富伦菌素B浓缩成不含溶剂的富伦菌素B浆液(11’)。此浆液与约为其体积1～2倍的低级烷烃(优选正己烷)混合(12’)，然后过滤，将所得滤饼干燥(13’)。
在任一种方法中，优选将干燥的滤饼再结晶，如图3的流程图中所示(其中标出了优选的溶剂)。
在室温下将干燥的滤饼溶于低级烷基(优选乙基)乙酸酯中，浓度约为70～100g/L。将溶液过滤，在氮气及真空条件下浓缩滤液，温度范围经为25—40℃，优选约35℃，直至富伦菌素B的浓度为约275—350g/L。在已滤过的氮气中将浓缩液冷却，在低温条件下过滤浆液，温度范围约为1—15℃，优选约为4℃。将滤饼用冷(例如上述温度范围，优选4℃)25/75(v/v％)～50/50(v/v％)低级烷基乙酸酯/低级烷烃溶液洗涤，然后用低级烷烃洗涤。优选的溶剂混合物是乙酸乙酯/正己烷，最优选50/50v/v％此种混合物，随后所用的低级烷烃优选是正己烷。然后将富伦菌素B晶体干燥。
下列实施例说明了本发明。
实施例各种富伦菌素的测定在本发明方法的下列实施例中，用下述HPLC法分析富伦菌素、脱氧富伦菌素和富伦菌素B。所用的Hewlett Packard(HP)HPLC系统中包括HP1050系列多波长检测器、泵系统和HP3396系列II积分仪，用Waters HPLC柱Nova-PakRC18(3.9×150mm)，并带有预柱C18 Guard-PAKS。在室温(20～25℃)使用柱子，操作压力为每平方英寸1,800磅(psi)/126.5kg/cm2。流动相溶液是60％的2％乙酸溶液和40％乙腈(v/v)的混合液，经0.2微米滤膜过滤并用氦气脱气。
将发酵液试样用酸化甲醇(1∶500HCl∶甲醇)稀释10倍，注入HPLC柱前用0.45微米滤膜过滤。对于回收和纯化步骤中取出的试样，用HPLC分析之前，加适量甲醇稀释。将样品备置于2ml小瓶中，盖上瓶帽并以350微升/分钟的牵伸速度自动注入HPLC柱，进样体积为20微升，流速为1.2ml/min，检测器波长为276nm。用纯化的富伦菌素制备校正曲线。富伦菌素、脱氧富伦菌素和富伦菌素B的保留时间分别为5.7、8.1和11.6分钟，检测器反映因子(g/L样品浓度/峰面积)分别为3.40×10E-8、8.47×10E-9和9.28×10E-9。
实施例1用于发酵的微生物是玫瑰暗黄链霉菌突变菌株，保存于美国典型培养物保藏中心，(美国，马里兰)，ATCC No.55598。量取5ml用5％乳糖和10％甘油冷冻于-70℃的贮存孢子等分试样，融化，连续稀释并涂布在琼脂平面培养基上，培养基中含有0.5g/L醇母浸膏(Amberex1003，Red StarR，Universal Foods)，0.5g/L天冬酰胺(Sigma)，39g/L土豆葡糖琼脂培养基(Difco)和10g/L琼脂(Difco)，溶于去离子水，在27℃培养箱中放置7天，使孢子生长。用5g/L无菌琼脂溶液将孢子从平面上刮下来。将108个孢子接种于含1L种子培养基的6L锥形烧瓶中。种子培养基中含有1.5g酵母浸膏(Amberex1003，Red StarR，Universal Foods)，5gBacto胰蛋白胨(Difco)，10g葡萄糖，20g玉米淀粉(EclipseRN，Staley)和4g碳酸钙(Whittaker Clark Daniel)，溶于去离子水。将烧瓶在27℃旋转振荡器中保温48小时，转速为每分钟220转(rpm)。将0.8L生长在种子培养基中的微生物接种到40L的发酵培养基中。将60L种子发酵液接种到发酵液工作体积为1325L的2000L发酵罐中。初始发酵培养基(1325L)中，每升含有50g玉米油(Welch，Holme and Clark)，20g糊精(Sigma type IV)，15g玉米浸膏(Roquette)，10g蔗糖糖蜜(Mid-Eastern)，7.5g甲酸钠(Fisher)，3g玉米浸膏(Amberex1003)，4g七水硫酸镁(Fish-er)，0.44g七水磷酸二氢钠(Fisher)，4g碳酸钙(Pfizer)和0.3ml消沫剂(Union Carbide，UCONRLB—625，聚丙二醇单丁酯)。
发酵27℃进行，背压为5psig，搅拌速度控制在160～280rpm，通气量控制在336～672min，以保持溶解氧高于30％。不用控制发酵液的pH值，测定pH值为6.5～8.4。
发酵结束后(186小时，1325L，pH8.2，富伦菌素3.8g/L，脱氧富伦菌素0.1g/L)，停止向发酵罐中通氧气，并通入氮气排除其中的氧，发酵罐搅拌速度从280rpm降至100rpm。
用冷水将发酵液的温度从27℃降至10℃，放置7小时，使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素。向转化后的发酵液(1325L，pH7.7，富伦菌素0.2g/L，脱氧富伦菌素2.9g/L)中加入12.9L 50％氢氧化钠水溶液，调节pH至11.5，在氮气条件下混匀30分钟。然后加入14L浓硫酸调节发酵液的pH至2.5，立即用乙酸乙酯(1325L)萃取30分钟。
将所有发酵液和乙酸乙酯提取混合物用Westfalia盘型分离器(SA—7—06—076型)离心，流速为280L/h。将分离出的乙酸乙酯提取液(轻相，1298L，pH2.7，富伦菌素0.12g/L，脱氧富伦菌素2.91g/L)用转膜蒸发仪浓缩，温度为50℃，真空度为28”(绝对压力为1.9英寸/48.3mm汞柱)，进料流速为52L/h。将乙酸乙酯提取浓缩液(190L，pH3.0，脱氧富伦菌素19.5g/L，富伦菌素0.83g/L)用93L去离子水洗涤，用浓氢氧化铵调节pH至6.1，混匀30分钟。用相分离法分离洗过的乙酸乙酯浓缩液，与32L去离子水混合，用浓盐酸调节pH至3。
将水洗并分离出的乙酸乙酯提取浓缩液层(224L，pH3，脱氧富伦菌素16.3g/L)用旋转蒸发仪(50L，容量30L，Buchi Ro-tavapor Model 185 Ex，EVP-454)进一步浓缩成油状膏体，温度为40℃，真空度为28”。用430L甲醇提取油状膏体(28L)。分离上层甲醇提取相(426L，pH3.2，脱氧富伦菌素8.28g/L)，用1M氢氧化铵调节pH至6.1。将调过pH的甲醇提取液在10psig压力下于38℃加热(反应)12小时，使脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B。用1M盐酸调节甲醇提取液的pH至3.0，使反应停止。
将停止反应的甲醇提取液(426L，富伦菌素B 7.35g/L，脱氧富伦菌素0.2g/L)用转膜蒸发仪浓缩，温度为45℃，真空度为28”，进料流速为20L/h。将浓缩的甲醇提出液浆液(66L，富伦菌素B 46.4g/L)于0℃放冷过夜，使富伦菌素B结晶，过滤(Whatman No.1滤器)。用冷的酸化甲醇(pH2)洗涤富伦菌素B湿滤饼，于30℃真空干燥过夜(真空度为25”，等同于绝对压力4.9英寸/124.5mm汞柱)。将干燥的富伦菌素B固体粗品在正己烷(37L)中再形成浆液，以除去油，过滤。将正己烷洗过的固体再真空干燥，得到3060g富伦菌素B，纯度为90％。
为进一步纯化纯度为90％的富伦菌素B，将固体富伦菌素B溶于乙酸乙酯中，浓度为80g/L。过滤(Whatman No.1滤器)富伦菌素B的乙酸乙酯溶液，并在氮气条件下及真空度为25”、温度为35℃的条件下，在结晶器中浓缩至富伦菌素B的浓度为300g/L，程序降温冷却浓缩液，速率为每小时降温2.1℃，16小时后降至0℃。过滤富伦菌素B结晶，用冷(4℃)55/50(v/v)％乙酸乙酯和正己烷洗涤，真空干燥，得到2640g富伦菌素B，纯度为98.5％。
实施例2按实施例1所述的方法制备玫瑰暗黄链霉菌种子接种物，进行菌丝体发酵，在发酵液中将富伦菌素转化为脱氧富伦菌素，用乙酸乙酯提取全部发酵液，离心并浓缩乙酸乙酯提取液。在旋转蒸发仪中进一步浓缩乙酸乙酯提取浓缩液(26L，脱氧富伦菌素19.8g/L，富伦菌素1.4g/L)，温度为40℃，真空度为28”(绝对压力为1.9英寸/48.3mm汞柱)，蒸去残留的乙酸乙酯至呈油状膏体。向油状膏体中(12L，脱氧富伦菌素42g/L)加入18L正己烷，充分混匀0.5小时使油状物溶解。用Whatman滤纸在25”真空度(绝对压力4.9英寸/124.5mm汞柱)下过滤脱富伦菌素己烷浆液。将脱氧富伦菌素粗品滤饼(816g，纯度56％)用3L正己烷洗涤，于30℃真空(25”)干燥箱中过夜干燥。过滤后的混合液和己烷洗涤液(32L，脱氧富伦菌素1.4g/L)可浓缩并再回收。
将过滤并干燥的脱氧富伦菌素粗品固体(816g，纯度56％)再溶于乙酸乙酯(10L)中，使脱氧富伦菌素的浓度为45g/L。用氢氧化铵调节脱氧富伦菌素乙酸乙酯溶液的pH至6.1。将溶液加热至45℃，搅拌并将乙酸乙酯回流。用压力为5～10psig的空气填充混合容器。反应过程中用氢氧化铵维持溶液的pH于5.9～6.1。24小时后脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B，转化率为92％。将转化的富伦菌素B乙酸乙酯溶液(9.5L，富伦菌素B43g/L)在旋转蒸发仪中浓缩，蒸去乙酸乙酯，温度为40℃，真空度为28”。将不含溶剂的粗品富伦菌素B固体浆液(1.2L)与2.4L正己烷混合，在25”真空度下用Whatman滤纸过滤，用正己烷洗涤，于30℃真空(25”)干燥箱中过夜。富伦菌素B固体(445g，纯度87％)可按实施例1中所述的重结晶方法进一步纯化。
权利要求
1.一种生产脱氧富伦菌素和，如需要，富伦菌素B的方法，此方法的特征是a)，在需氧条件下将含有能生成富伦菌素的微生物的培养基发醇以生产富伦菌素，然后b)，在同一培养基中在厌氧条件下使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素，并且如需要，c)，在随后的回收和纯化步骤中再将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B。
2.根据权利要求1的方法，其中的微生物是玫瑰暗黄链霉菌突变菌株。
3.根据权利要求1或2的方法，其中的微生物是保存于美国典型培养物保藏中心(ACTT)且其编号为No.55598的玫瑰暗黄链霉菌突变菌株(Streplomyces roseofulvus)。
4.根据权利要求1～3中任何一项的方法，其中b)步骤中包括当富伦菌素的滴度达到或几乎达到其最大值时向发酵液中通入氮气以除去氧气。
5.根据权利要求4的方法，其中b)步骤中进一步包括将发酵液在厌氧条件下放置约2～8小时，pH约为7.0～9.0。
6.根据权利要求5的方法，其中pH约为7.5～8.4。
7.根据权利要求4～6中任何一项的方法，其中转化完全后，加入适量的一种碱调节发酵液的pH至约为10～11.5，再于厌氧条件下放置0.5～1小时。
8.根据权利要求1～7中任何一项的方法，其中c)步骤中包括加热脱氧富伦菌素至温度最高约为45℃。
9.根据权利要求8的方法，其中加热是在压力约比大气压高0.35～0.70kg/cm2的条件下进行。
全文摘要
一种生产脱氧富伦菌素，可选择地，和富伦菌素B的方法，包括在需氧条件下将含有能生成富伦菌素的微生物的培养基发酵以生产富伦菌素，然后在同一培养基中在厌氧条件下使富伦菌素转化为脱氧富伦菌素，并且如需要可在随后的回收和纯化步骤中将脱氧富伦菌素转化为富伦菌素B。已知这三种富伦菌素的每一种都是有用的抗生素，特别是动物用药。
文档编号C07D311/92GK1129740SQ9511685
公开日1996年8月28日 申请日期1995年9月13日 优先权日1994年9月14日
发明者D·E·布劳克, T·E·赫曼, J·H·希, N·S·麦塔, V·R·拉 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司