专利名称：治疗骨缺陷疾病的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及用于抑制不希望的脊椎骨损失、治疗不希望的骨损失或需要骨生长的疾病、治疗骨折、和治疗软骨疾病的组合物和方法。更具体地，本发明涉及通过高检出筛选测定来鉴别的特殊种类化合物的应用。
背景技术：
骨骼不是静态的组织。它始终受到复杂过程中分解和重新合成的影响，其中该过程由生成新骨的成骨细胞和破坏骨骼的破骨细胞介导。这些细胞的活性受大量的细胞因子和生长因子调节，它们中的许多已被鉴定并被克隆。Mundy已描述了关于这些因子的现有知识(Mundy，G.R.“临床矫形外科学”Clin Orthop32424-28，1996；Mundy，G.R.J Bone Miner Res8S505-10，1993)。
尽管可获得影响骨分解和吸收的因子的许多信息，但是刺激新骨生成的生长因子的信息非常有限。研究者已对这些活性来源进行了研究，并发现骨组织本身是可刺激骨细胞生长的因子的储藏库。因此，从屠宰场获得的牛骨组织抽提物不仅含有维持骨骼结构完整的结构蛋白，而且还有可刺激骨细胞增殖的具生物活性的骨生长因子。这些生长因子有转化生长因子β、肝素结合生长因子(酸式和碱式成纤维细胞生长因子)、胰岛素样生长因子(胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子II)和最近描述的称为骨形态发生蛋白(BMP)的蛋白家族。所有这些生长因子对其它类型的细胞以及骨细胞有作用。
BMP是扩展的转化生长因子β超家族中的新因子。它们首先由Wozney J等人(“科学”Science(1999)2421528-34)在早期表述脱矿质骨抽提物的生物活性的描述(Urist M.“科学”Science(1965)150893-99)后用基因克隆技术来鉴别的。重组BMP2和BMP4在局部注射入小鼠皮下组织后可诱导新的骨生成(Wozney J.“分子再生进展”Molec Reprod Dev(1992)32160-67)。这些因子由普通的成骨细胞在它们分化时表达，并表现出可刺激成骨细胞分化、体外骨结节形成和体内骨形成(Harris S.等人，J.Bone Miner Res(1994)9855-63)。后一特性暗示其在治疗导致骨损失疾病中作为治疗试剂的潜在用途。
引起骨生成的细胞是成骨细胞。当成骨细胞从前体分化成成熟的形成骨的细胞时，它们将表达并分泌许多种酶和骨基质的结构蛋白，它们包括1类胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)和碱性磷酸酶(Stein G.等人，“现代细胞生物学观点”Curr Opin Cell Biol(1990)21018-27；Harris S.等人(1994)，同上)。它们也合成许多储藏在骨基质中的生长调节肽，被推定引起正常骨形成。这些生长调节肽包括BMP(Harris S.等人(1994)，同上)。在胎鼠颅盖成骨细胞的原代培养研究中，在矿质化骨结节形成前培养的细胞前表达出BMP1、2、3、4和6(Harris S.等人(1994)，同上)。同碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白一样，当培养的成骨细胞增殖分化时它们表达出BMP。
尽管BMP是体内和体外骨形成有效的刺激物，但它们不能有利地用作促进骨愈合的治疗试剂。已鉴定在许多组织中有骨形态发生蛋白的受体，且BMP本身在各种组织中以特异性的时间和空间方式表达。这表明BMP对于骨以外的其它许多组织有作用，这潜在地限制了它们在全身给药时作为治疗试剂的应用。而且，由于它们是肽类，因此它们必须注射给药。这些缺点给BMP作为治疗试剂的发展带来了极大的限制。
有一种多血症疾病，其特征是需要加强骨的形成。最明显的情况可能是骨折，它需要刺激骨生长来加速并完成骨的修复。促进骨形成的试剂也可用于脸部整形过程。其它骨缺陷疾病包括骨分节疾病(bone segmental defect)、牙周病、骨转移疾病(metastatic bone disease)、骨质溶解疾病和连接组织需要修复的疾病如有缺陷或损伤的软骨愈合或再生。它对骨质疏松慢性病的效果也非常显著，这些骨质疏松慢性病包括与年龄有关的骨质疏松症和与绝经后激素状态有关的骨质疏松症。其它需要骨生长的疾病包括原发性和非先天性甲状腺机能亢进、废用性骨质疏松症、与糖尿病有关的骨质疏松症和与糖皮质激素有关的骨质疏松症。此外，或者，本发明的化合物可调节正常或畸变细胞或组织的新陈代谢、增殖和/或分化。
目前还没有令人满意的药学方法来控制这些疾病。骨折仍然是用石膏夹、支架、固定装置及其它严格的机械方式。而且，绝经后骨质疏松症引起的骨衰退可用雌激素或双磷酸酯来降低或防止。
美国专利5,280,040公开的一类化合物是3，4-二芳基苯并二氢吡喃。这些化合物可认为是2，3，4三苯基丁醇的衍生物，其中1位上的羟基与丁醇4位上取代的苯基基团的正位形成了醚。该3，4-二芳基苯并二氢吡喃的芳香成分或其连接基团中不含氮原子。较佳的化合物中间型苯并二氢吡喃(centchroman)只在其一个苯基取代基上有一个氮原子取代基。这些化合物公开在，040专利中来用作治疗骨质疏松症。
本发明公开了用于抑制或治疗骨缺陷疾病的化合物，而它的其它用途对该领域技术人员根据这里的描述是明显的。
发明公开本发明提供一种可以作为普通药物来给药并有促进骨生长新陈代谢作用的化合物。本发明的化合物可通过测定它们激活与这些因子有关的控制元件的能力来鉴别。因此，本发明涉及刺激骨骼(骨)组织生长的方法和组合物，该方法和组合物中用化合物作为活性组分，其中化合物中的两个芳香系统间是连接的，并且相隔间距为约1.5至15埃。这样连接的系统(包括连接它们的连接物)可包括至少一个氮原子而不是环取代基。
因此，本发明所用的化合物可描述为有化学式Ar1-连接物-Ar2，其中Ar1和Ar2分别是独立的芳香系统，且化学式的连接物部分使Ar1和Ar2隔开约1.5-15埃。Ar1、Ar2和连接物还可用不干扰的取代基来取代。在有用的化合物中，Ar1、Ar2和/或连接物中可以至少有一个氮原子，其不取决于其上的任何取代基。较佳地，本发明的化合物还可含有至少一个附加的不取决于任何取代基的选自N、S和O的杂原子。
本发明的其它化合物包括特定的有电荷分离的五元环。
因此，本发明涉及用所述的化合物治疗骨疾病的方法和有该应用的药物组合物。
附图简述
图1表示化合物剂量应答曲线，命名为59-0008。
图2和3表示本发明典型的化合物和它们在体外测试中获得的结果。
本发明实施方式美国申请号No.08/458,434(1995年6月2日提交)中描述了可刺激与BMP启动子(内源产生的骨形态发生因子的替代品)相连的报道基因表达的化合物的快速检出率筛选测试方法，其所有内容在这里参考结合。该测定方法也在Ghosh-Choudhery，N.等人(“内分泌学”Endocrinology(1996)137331-39)的小鼠无限增殖成骨细胞(从表达转基因的鼠中获得，转基因包括驱动T抗原表达的BMP2启动子)研究的部分中有所描述。在该研究中，无限增殖的细胞用含有萤光素酶报道基因(报道基因由鼠的BMP2启动子(2736/114bp)驱动)的质粒稳定转染，并与重组的人BMP2在剂量上对应。
简单地说，测定所用的细胞是用构建物永久或瞬时转化的，构建物中骨形态发生蛋白，特别是BMP2或BMP4的启动子与报道基因，典型的是萤光素酶的基因连接。然后评价这些转化的细胞产生报道基因产物的能力；激活BMP启动子的化合物将驱动报道蛋白的产生，而报道蛋白是很容易测定的。使超过40000种化合物接受这种快速筛选技术，只有很小的百分比诱导出的萤光素酶产物大于由赋形剂(vechile)产生的5倍。激活BMP启动子的化合物有一些非活性化合物所没有的共同结构特征。活性化合物(“激活BMP启动子的化合物”或“活性化合物”)可用来促进骨或软骨生长，从而可用于治疗需要骨或软骨生长的脊椎动物。
激活BMP启动子的化合物可通过其它各种测定特异性和毒性的测定法来检测。例如非BMP启动子或应答元件可与报道基因连接并被插入合适的宿主细胞。细胞毒性可通过肉眼或显微镜检查含有BMP启动子-受体基因和/或非-BMP启动子-受体基因的细胞来测定。或者，可监测细胞的核酸和/或蛋白质合成。对于体内测定，可取出组织并进行肉眼或显微镜检测，测定还可与染料或染色剂结合来实现组织学测定。在评价体内测定结果时，也可用常规药用化学/动物模型技术来测定测试化合物的生物分布。
如这里所用的，“抑制”和“治疗”是可互换的术语。术语包括延迟骨缺陷症状和/或减少这些将要发生的症状的严重程度。术语还包括改善已存在的骨或软骨缺陷症状、防止附加的症状、改善或防止症状潜在的新陈代谢起因、防止或逆转骨吸收和/或促进骨的生长。因此，术语表示的是对有软骨、骨或骨骼缺陷或有发生这种缺陷可能的脊椎动物的有利的结果。
“骨缺陷”是指骨形成和骨吸收之比的不平衡，即如果不修饰，则接受者的骨不如希望的那样多，或不如希望的那样完整和连贯。骨缺陷也可由骨折、外科手术或牙科或牙周疾病引起。“软骨缺陷”是指软骨受损、软骨比希望的少、或软骨不如希望的那样完整和连贯。
本发明的化合物的代表性应用包括骨缺陷和损失(发生在封闭性、开放性和不连合骨折中)的修复；在封闭性和开放性骨折减少中的预防应用；在整形外科中促进骨的愈合；刺激骨向内生长入不牢固的假补关节和牙科移植物；提高绝经前妇女的峰骨重量；生长缺陷的治疗；牙周疾病和缺陷的治疗和其它牙科修复过程；提高脱位骨质疏松症中的骨形成；治疗其它骨骼疾病，如与年龄有关的骨质疏松症、绝经后的骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症或废用性骨质疏松症和关节炎。本发明的化合物也可用于先天性、外伤诱导或外科骨切除(例如用于癌症治疗)、以及整容外科的修复。而且，本发明的化合物可用来抑制或治疗软骨缺陷或疾病，并可用于伤口愈合或组织修复。
用本发明的有某些结构和功能特征的化合物给药来治疗脊椎动物中骨或软骨缺陷或缺损。本发明的组合物可进行全身或局部给药。对于全身给药，这里的化合物可根据常规方法来制剂成非肠道(如静脉内、皮下、肌肉间、腹膜内、鼻内或转皮肤(transdermal))或肠道(如口服或直肠内)输递。静脉给药可以在延长期内进行一系列的注射或连续灌输。注射给药或其它途径的分散间隔给药(discretelyspaced sdministration)可间隔进行，从一周一次至每天二至三次。或者，这里公开的化合物可以循环方式给药(用公开的化合物给药；然后不给药；然后再用公开的化合物给药等)。持续治疗直至获得所需的效果。通常，药物制剂包括本发明的化合物与药物上可接受的赋形剂的组合，如盐水、缓冲的盐水、5％水中的葡萄糖、含有痕量金属的硼酸盐缓冲生理盐水等。制剂还包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白(防止蛋白质在管表面的损失)、润滑剂、填充剂、稳定剂等。配制方法是该领域熟知的，并在本文公开，例如“雷明顿药物科学”中(Remington′s Paharmaceutical Sciences，Gennaro编辑，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990)公开的方法，其完整地在此作为参考。本发明所用的药物组合物可以是无菌无热原液体溶液或悬浮液、包覆的胶囊、栓剂、冻干粉末、转皮肤膏片(transdermal patch)或其它该领域熟知的形式。局部给药可以是注射在受伤或缺陷部位、或在部位上插入或附着固体赋形剂、或直接表面使用一种粘性液体等。对于局部给药，输递载体最好能为生长的骨或软骨提供基质，更佳地是赋形剂可被主体吸收而无负效应。
本发明化合物向受伤部位的输递可通过使用控制释放的组合物来增强，如那些在待公开美国专利申请号No.07/871,246(相应的WIPO公开号为WO 93/20859，其完全结合实施于本发明中)中所公开的组合物。这类薄膜可特别用作假补装置和外科移植物。薄膜可以包在例如外科螺钉、杆、针、平板等物体的外表面上。这类可移植的装置通常用于矫正外科。薄膜也可用于包覆骨填充物质，如羟基磷灰石块、脱矿质的骨基质填充剂、胶原基质等。这里描述的薄膜或装置通常施用于骨折处。施用通常是用标准的外科步骤移植入骨中或附着在表面上。
除了上述提及的共聚物和载体，生物可降解的薄膜和基质还可包括其它活性或惰性组分。特别感兴趣的是促进组织生长或浸润的试剂，如生长因子。用于该目的的典型的生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、甲状旁腺素(PTH)、白血病抑制因子(LIF)和胰岛素样生长因子(IGF)等。促进骨生长的试剂，如骨形态发生蛋白(美国专利No.4,761,471；PCT公开号WO 90/11366)、成骨素(Sampath等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)847109-13)和NaF(Tencer等人，J.Biomed.Mat.Res.(1989)23571-89)也是较佳的。生物可降解的薄膜或基质包括硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸、聚酐、骨或表皮胶原、纯蛋白、胞外基质组分等及其组合。这些生物可降解的材料可与非生物可降解材料合用，以提供所需的机械、整容或组织或基质界面性质。
本发明的化合物的其它输递方法包括用ALZET渗透微型泵(Alza Corp.，PaloAlto，CA)；Wang等人公开的持续释放基质材料(PCT公开号WO 90/11366)；Bao等人公开的带电荷葡聚糖珠(PCT公开号WO 92/03125)；以胶原为基础的输递系统，例如Ksander等人公开的(Ann.Surg.(1990)211(3)288-94)；甲基纤维素凝胶系统，如Beck等人公开的(J.Bone Min.Res.(1991)6(11)1257-65)；和藻酸盐为基础的系统，如Edelman等人公开的(Biomaterials(1991)12619-26)等。其它该领域熟知的持续骨内局部输递的方法包括可被包埋的多孔包覆金属假体和有药物组合物施加在其中的固体塑料棒。
本发明的化合物也可与抑制骨吸收的试剂合用。用于该目的的较佳的抗吸收试剂如雌激素、双磷酸酯和降钙素。更具体地，这里公开的化合物可在足以矫正骨缺陷疾病的期间(如几个月至几年)内给药。骨缺陷疾病一旦被矫正，可用抗吸收化合物对脊椎动物给药以维持骨的矫正。或者，这里公开的化合物可用抗吸收化合物以循环方式来给药(用公开的化合物给药，然后是抗吸收试剂，然后再用公开的化合物给药等)。
除了制剂外，也可用如下面描述的常规制备物。
水性悬浮液可含有与药学上可接受的赋形剂混合的活性组分，赋形剂包括悬浮剂如甲基纤维素和润湿剂如卵磷脂、溶血卵磷脂或长链脂肪醇。所述水性悬浮液也可含有工业标准的防腐剂、着色剂、调味剂和增甜剂。
用于表面和局部施用的制剂包括药学上合适赋形剂形式的烟雾喷洒剂、洗液、凝胶和软膏，赋形剂可包括低碳脂肪醇、聚乙二醇如甘油、聚氧乙烯、脂肪酸的酯、油和脂肪以及硅氧烷。制剂还可包括抗氧化剂如抗坏血酸或生育酚，和防腐剂如对羟基苯甲酸酯。
非肠道制剂包括特别无菌或杀菌的产物。可注射组合物可含有活性化合物和任何熟知的可注射载体。它们可含有用于调节渗透压的盐。
如果需要，成骨试剂可与通过任何报道的方法制得的脂质体结合使用，以用来治疗各种病原性疾病。本发明的组合物可用上述化合物与脂质体结合使用以使这些化合物直接到达巨噬细胞、单核细胞及其它吸收脂质体组合物的细胞、组织和器官上。本发明与脂质体结合使用的化合物可用于非肠道给药，以使得较低剂量的化合物有效。也可与配体结合使用以进一步提出脂质体的特异性。
脂质体制备的合适常规方法包括(但不局限于)，Bangham A.D.等人公开的方法(J Mol Biol(1965)23238-252)，Olson F.等人公开的方法(Biochim BiophysActa(1979)5579-23)，Szoka，F.等人公开的方法(Proc Natl Acad Sci USA(1978)754194-4198)，Mayhew，E.等人公开的方法((1984)775169175)，Kim，S.等人公开的方法(Biochim Biophys Acta(1983)728339348)，和Mayer等人公开的方法(Biochim Biophys Acta(1986)858161-168)。
脂质体可从本发明的与任何常规的合成或天然磷脂脂质体材料组合使用的化合物中制得，磷脂脂质体包括来自天然来源如蛋、植物或动物来源的磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇。也可用合成的磷脂，它们包括(但不局限于)二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱和相应的合成的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。胆甾醇或其它甾醇、半琥珀酸胆甾醇酯、糖酯、脑苷酯、脂肪酸、神经节苷脂、鞘脂类、1，-2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油酰基)丙基-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)，以及其它阳离子类脂可与脂质体结合使用，这是该领域熟知的。脂质体中所用的磷脂和添加剂的相对量可根据需要而不同。磷脂较佳的范围是约60至90摩尔百分比；胆甾醇、半琥珀酸胆甾醇酯、脂肪酸或阳离子类脂所用的量在0至50摩尔百分比内。结合入脂质体的类脂层的本发明化合物的量可根据类脂浓度而不同，其范围在约0.01至约50摩尔百分比内。
通过常规方法可使约20至30％的溶液中的化合物被留在脂质体中；因此，约有70至80％的活性化合物被浪费。相反，当化合物与脂质体结合使用时，所有的化合物结合入脂质体中，因此基本上没有活性化合物被浪费。
上述制剂中的脂质体还可与单克隆抗体或其它靶目标的特异性配体结合以使对其靶目标更具特异性。例如，可将BMP受体的单克隆抗体通过用Leserman，L等人的方法(Nature(1980)288602-604)与结合入脂质体的磷脂酰乙醇胺(PE)连接来结合入脂质体。
本发明公开的化合物也被考虑用于兽医用途。这些应用包括抑制或治疗家养动物、家畜和仔细喂养的马中的骨或软骨缺陷或损伤。这里描述的化合物也可修饰靶组织或器官环境，以将骨形成细胞吸引至需要这些细胞的环境。
本发明的化合物也可用于刺激骨形成细胞或其前体的生长，或诱导体外或来自体内的骨形成细胞前体的分化。如这里所用的，术语“前体细胞”指将要分化但通常不表达标记的或不象成熟的完全分化细胞那样起作用的细胞。如这里所用的，术语“间充质细胞”或“间充质干细胞”指可以分裂多次的多能祖细胞，它的后代可产生骨组织(包括软骨、骨、腱、韧带、骨髓基质和连接组织)(见A.CaplanJ.Orthop.Res.(1991)9641-50)。如这里所用的，术语“成骨细胞”包括成骨细胞和成骨细胞前体细胞。更具体地，公开的化合物可用于刺激含有脊髓间充质细胞的种群，从而使该细胞种群中的成骨细胞增加。在较佳的方法中，可在用公开的化合物刺激前或之后将造血细胞从细胞种群中除去。通过这种方法可扩增成骨细胞。扩增的成骨细胞可输(或重新输)入需要它的脊椎动物中。例如，可使接受者自身的来自体内的间充质干细胞受本发明化合物作用，获得的成骨细胞可输入或直接进入接受者体内的目标部位，成骨细胞就可进一步增生和/或分化而不需免疫注射。或者，受公开的化合物作用的细胞种群可以是无限增殖的人胎儿成骨细胞。如果将这种细胞输入或移植入脊椎动物中，就可有利地“免疫保护”这些非自身的细胞，或免疫抑制(最好局部)受体以增强移植和骨或软骨修复。
在本发明中，化合物的“有效量”是指产生统计学上显著效果的量。例如，治疗的“有效量”指含有这里的活性化合物的组合物的所需的量，以显著提高骨折修复的临床愈合速度；逆转骨质疏松症中的骨损失；逆转软骨缺陷或疾病；防止或延迟骨质疏松症的发生；刺激和/或增加不结合骨折处和成骨脱位处的骨形成；提高和/或促进骨生长入假体中；和修复牙齿疾病。该有效量可用常规的优化技术来确定，并与治疗具体情况、患者的疾病、给药方式、制剂、医者的判断、以及其它对该领域技术人员是明显的因素有关。以证明在治疗组和对照组的骨质量中本发明化合物的所需的剂量(例如在需要骨形成提高的骨生长中)统计学上有显著不同。这一骨质量中的区别例如是在治疗组中骨质量多增加5-20％。其它临床测定愈合有显著提高的方法包括，例如测试破坏强度和应力、破坏强度和扭转、4点弯曲、骨内活组织检查中提高的连接性和其它该领域技术人员熟知的生物机械测试。治疗组的常用指导方法是从对感兴趣的动物疾病模型进行实验来获得的。
本发明的化合物的剂量将根据需要治疗的严重程度、给药化合物的活性、接受者的大体健康状况和其它该领域技术人员熟知的因素而不同。通常，对典型的人来说，化合物以每天口服剂量为约0.1mg/kg-1000mg/kg进行给药，更佳的为1mg/kg至约200mg/kg。非肠道的剂量约为口服剂量的20-100％。
筛选测定本发明方法所用的化合物的成骨活性可用体外筛选技术来鉴定，例如上述的对与骨形态发生蛋白有关的启动子连接的报道基因的转录的评价，或用如下的测定方法新生小鼠颅盖测定技术(体外)该测定法与Gowen M.& Mundy G.(J Immunol(1986)1362478-82)所述的测定方法相同。简单地说，在生长四天后，用显微解剖沿前后向骨缝剖开，取出ICR瑞士白鼠的前骨和顶骨。使骨在含0.02％(或更低浓度)β-甲基环糊精(β-methylcyclodextrin)的BGJb培养基(Irvine scientific，santa Ana，CA)中在37℃5％CO2和95％空气的增湿气氛中培育96小时，其中培养基也含有测试物或对照物。
此后，从培育基质中取出骨，并在10％缓冲甲醛中固定24-48小时，在14％EDTA中脱钙1周，用分级醇处理，并包埋在石蜡中。制得3μm的颅盖切片。选择典型的切片来对骨形成和骨吸收进行组织形态测定评价。在切片200μm中测定骨的变化。成骨细胞和破骨细胞可通过其各自明显的形态来鉴定。
可用其它辅助测定方法作为对照来测定测试化合物的非BMP启动子介导的效果。例如，促有丝分裂的活性可通过用血清反应元件(SRE)作为启动子并用萤光素酶报道基因的筛选测定法来测定。更具体地，这些筛选方法可检测SRE介导途径如蛋白质激酶C途径中的信号。例如，成骨细胞激活物SRE-萤光素酶筛选和胰岛素模拟SRE-萤光素酶筛选可用于该目的。同样，也可测定待测试化合物刺激cAMP反应元件(CRE)-介导的途径。例如，用PTH和降钙素(两种骨活性试剂)的受体转染的细胞可用于CRE-萤光素酶筛选来检测cAMP提高的水平。因此，BMP启动子对测试化合物的特异性可通过这些辅助测定来测得。
体内测定化合物对小鼠颅盖骨生长的影响采用4-6周龄的重13-26gm的雄性ICR瑞士白鼠，每组有4-5只。颅盖骨生长测定法如PCT申请号WO 95/24211中所述那样进行，其在这里作参考引证。简单地说，将测试化合物或合适的对照赋形剂注射入正常小鼠的右颅盖的皮下组织内。典型地，对照赋形剂是化合物可在其中增溶的赋形剂，它是含有5％DMSO的PBS或含有吐温(2μl/10ml)的PBS。在第14天杀死动物并对骨生长进行组织形态测定。将用于定量测定的骨样品与邻近的组织分离，并在10％缓冲甲醛中固定24-48小时，在14％EDTA中脱钙1-3周，用分级醇处理并用石蜡包埋。制得3至5μm的颅盖切片，并选择典型的切片来对骨形成和骨吸收的效果进行组织形态测定。切片通过用附着转写器来直接将显微图象描绘到数字化板上来测定。在200μm切片中，颅盖的注射和非注射侧的4个1×1mm邻近区域测定骨的变化。新的骨通过其编织结构的特征被鉴定，而破骨细胞和成骨细胞通过其各自形态被鉴定。用组织形态测定软件(Osteo Measure，Osteometrix，Inc.，Atlanta)来处理数字仪的输入以测定细胞计数和测定区域或周围。
其它的体内测定方法主要的化合物可通过体内剂量测定法来进一步在完整动物体内测试。原型剂量可通过皮下、腹膜内或口服给药来实现，并可通过注射、持续释放或其它输递技术来进行。测试化合物的给药时间可以不同(例如28天和35天是合适的)。典型的体内皮下剂量测定法如下进行在典型的研究中，将70只三个月龄的雌性Sprague-Dawley鼠重量均分为7组，每组有10只。其中包括动物在研究开始杀死的基线对照组；只用赋形剂给药的对照组；用PBS来治疗的对照组；和用已知的可促进骨生长的化合物(非蛋白质或蛋白质)来给药的阳性对照组。对其余三组用三种剂量水平的测试化合物来给药。
简单地说，测试化合物、阳性对照化合物、PBS或只含赋形剂进行皮下注射35天，每天一次。所有动物用钙黄绿素在杀死9天和2天前注射(两次钙黄绿素的注射在指定日内给药)。测定每周的体重。在35天的周期最后，对动物称重，并通过眼眶(orbital)或心脏刺穿来放血。测定血钙、磷酸盐、骨钙蛋白和CBC。取出腿骨(股骨和胫骨)和腰脊椎，清除粘附的软组织，并储藏在70％乙醇中用外周定量计算计X线断层照相术(peripheral quantitative computedtomography)(pQCTFerretti，J.Bone(1995)17353S-64S)、双能量X-射线吸附测定法(DEXA；Laval-Jeantet A.等人，Calcif Tissue Intl(1995)5614-18；J.Casez等人，Bone and Mineral(1994)2661-68)和/或组织形态测定法进行评价。从而可评价测试化合物对骨重塑的效果。
主要的化合物也可在急性卵巢切除动物(防止模型)中用体内剂量测定法测定。这些测定法也包括雌激素治疗组作为对照。典型的皮下剂量测定法如下进行在典型的研究中，将80只三个月龄的雌性Sprague-Dawley鼠重量均分为8组，每组有10只动物。它们包括动物在研究开始后立即杀死的基线对照组；三个对照组(假性卵巢切除(sham OVX)+只含赋形剂；卵巢切除(OVX)+只含赋形剂；PBS处理的OVX)；和用已知的促进骨生长的化合物给药的对照OVX组。对其余三组OVX动物用三种剂量水平的测试化合物来给药。
由于卵巢切除(OVX)诱导多食症，因此在35天研究中所有的OVX动物与假性OVX动物配对喂养。简单地说，测试化合物、阳性对照化合物、PBS或只含赋形剂采用皮下给药35天，每天一次。或者，测试化合物可配制人可移植的药丸中使药丸移植35天，或口服给药如胃管饲法。所有动物(包括假性OVX/赋形剂和OVX/赋形剂组)用钙黄绿素在杀死9天和2天前进行腹膜内注射(两次钙黄绿素的注射在指定日给药，以保证新生成的骨有合适的标记)。测定每周的体重。在35天周期的最后，如上所述来处理动物的血液和组织。
主要的化合物也可在慢性OVX动物(治疗模型)中测试。典型的用于治疗卵巢切除动物中已存在的骨损失的操作(可用来评价合成代谢试剂的效果)如下进行。简单地说，使80至100只六个月龄的雌性Spraugue-Dawley鼠在时间0点时接受假性外科(假性OVX)或卵巢切除(OVX)，将10只鼠杀死作为基线对照。记录在实验期间每周的体重。在去除骨约6周后(42天)，随机选择杀死10只假性OVX和10只OVX鼠作为缺失期的对照。在剩余的动物中，用10只假性OVX和10只OVX作为安慰剂治疗的对照。剩余的OVX动物用3至5剂量的测试药物在5周期间(35天)内进行治疗。以用这种病理模型已知的合成代谢试剂如PTH(Kimmel等人，Endocrinology(1993)1321577-84)治疗的OVX组作为阳性对照。为测定对骨形成的效果，可用下列步骤。切除并收集股骨、胫骨和腰脊椎1至4。靠近的左右胫骨用于pQCT测定、海绵状骨矿物密度(BMD)(测定比重)、和组织学测定，而对每一胫骨的中部进行皮层BMD或组织学测定。制得股骨并在生物机械测试前用pQCT扫描中部。对于腰脊椎(LV)，处理获得LV2来进行BMD测定(也可进行pQCT)；制得LV3以进行不脱钙骨组织检查；制得LV4以进行机械测试。
本发明所用化合物的特征本发明所用的所有化合物含有两个芳香族系统，即Ar1和Ar2，它们间由距离为1.5-15埃的连接物隔开，并可含有至少一个氮原子。Ar1和Ar2表示的系统可含有不干扰取代基。在这里Ar1表示的芳香系统和Ar2表示的芳香系统上的不干扰取代基在化学式中分别用Ra和Rb表示；然而，认为将一个Ar命名为Ar1而另一个命名为Ar2是任意的。为便于引用，每一个均分别命名；然而，很明显下述的连接物(除非是回文顺序的)可以相反的原子顺序存在于化合物中。通常，不干扰取代基有很多种。不干扰本发明化合物对接受治疗者的骨有有益效果的取代基包括烷基(1-6个碳，较佳为低碳烷基1-4个碳)(包括直链或支链形式)、链烯基(1-6个碳，较佳为1-4个碳)、炔基(1-6个碳，较佳为1-4个碳)，所有这些可以是直链或支链并还可含有取代基；卤素，包括F、Cl、Br和I；甲硅烷氧基、OR、SR、NR2、OOCR、COOR、NCOR、NCOOR和苯甲酰基、CF3、OCF3、SCF3、N(CF3)2、CN、SO、SO2R和SO3R，其中R是烷基(1-6个碳)或H。当两个Ra或两个Rb取代基在芳香系统中处于相邻位置时，它们可形成环。而且，取代基中可包括环，其含有足够的碳原子和杂原子以提供这一可能性。
较佳的非干扰取代基包括有1-6个碳的烃基基团，其包括饱和的或不饱和的、直链或支链烃基和含有环系统的烃基基团；卤代基团、烷氧基、羟基、氨基、单烷基-和二烷基氨基，其中烷基基团是1-6个碳、CN、CF3和COOR。
尽管根据芳香系统中的可行位置Ra和Rb取代基典型地为0-4或0-5，但是较佳的例子中Ra的数目为0、1或2，Rb为0、1或2。
连接基团L可以是共价键或任何至少二价的覆盖约1.5至约15埃的线性距离的基团，包括那些含有环类的满足这一空间需求的基团。有用的连接物通过这里的定义可通常分为三类(1)挠性(flexible)非共轭连接物，(2)挠性共轭连接物和(3)受限(constraine)连接物。连接物较佳的选择将根据Ar1和Ar2的选择来确定。并不是以下确定的所有的连接物均适合与所有的Ar1和Ar2组合。
如这里所确定的，挠性非共轭连接物是那些只连接Ar1的一个位置和Ar2的一个位置的键，并在Ar1和Ar2间只提供单价键或单链。链可含有支链，但链上不含π键(除在支链上外)或环部分。链上的连接原子本身可围绕单价键自由旋转，因此连接物的自由度大于两个。特别有用的挠性非共轭连接物除共价键外还包括下列化学式-NR-、-CR2-、-S-或-O-，其中R是H或烷基(1-6个碳)，更佳的R是H或低碳烷基(1-4个碳)，最佳为H。同样佳的下列化学式-NRCO-、-CONR-、-CR2S-、-SCR2-、-OCR2-、-CR2O-、-NRNR-、-CR2CR2-、-NRSO2-、-SO2NR-、-CR2CO-、-COCR2-和-NR-NR-CO-CR2-及其互补体-CR2-CO-NR-NR-，包括它的等排物。同样佳的是下列化学式-NR(CR2)2NR-、-O(CR2)2O-和-S(CR2)2S-，包括它们的等排物。这一组中的连接物的最优选择将根据Ar1和Ar2确定。
挠性共轭连接物是那些只使Ar1的一个位置与Ar2的一个位置连接的连接物，但是有至少一个双键或三键和/或一个或多个环系统，因此只有两个自由度。挠性共轭连接物可形成连接Ar1和Ar2的完全共轭的π键连接系统，因此提供了Ar1和Ar2的共平面。有用的挠性共轭连接物的例子包括-RC＝CR-、-N＝N-、-C≡C-、-RC＝N-、-N＝CR-、-NR-N＝CR-、-NR-NR-CO-CR＝CR-等，其中R是H或烷基(1-6个碳)，更佳的R是H或低碳烷基(1-4个碳)，最佳为H。
受限连接物是那些与Ar1或Ar2或两者有不止一个连接的连接物，因此通常其只有一个自由度。受限连接物通常形成融合的Ar1和/或Ar2的5或6元环，其中Ar1或Ar2的合适位置至少有一个取代基来与连接物形成第二个共价键，例如当Ar2是有活性的邻位取代基的苯基基团或在邻位直接与连接物起衍生作用时。(尽管芳香族在这些情况下宜称为亚苯基或亚萘基，但在这里术语“苯基”或“萘基”是用来包括这些物质的单价和二价形态。)特别有用的受限连接物的例子包括
等，其中X是O、N、S或CR，Y是CR2或C＝O。
本发明所用的许多化合物是商业上可获得的，它们可用该领域熟知的方法来合成。那些本发明中所用的新的化合物同样也能用该领域常规方法来获得。
在本发明的一类化合物中，Ar1是含有六元杂环的取代或不取代的芳香体系，本发明所用的化合物有化学式
其中Ra是非干扰的取代基；m是0-4间的整数；每一虚线表示任意的π键；每个Z分别为N、NR、O、S、CR或CR2，其中每个R分别是H或烷基(1-6个碳)；X是O、S、SO或SO2；L是挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的6元芳环。
一个具体较佳的例子是化学式
其中R1选自N＝NAr、NR6COAr、CONR6Ar、CH2OAr、CH2NR6Ar，其中Ar是六元(非)取代的芳环。该芳环上允许的取代基包括卤素、任意被六元芳族取代的直链或支链低碳烷基、链烯基、炔基，环烷基或环链烯基环、羟基、甲硅烷氧基、酰氧基、直链或支链低碳烷氧基、苯甲酰基、羰烷氧基、氮原子处任意被低碳烷基或苯基取代的氨基甲酰基、或羧基，其中R6选自氢、或直链或支链低碳烷基；R2和R5分别选自H、羟基、甲硅烷氧基、酰氧基、卤代基、氰基、直链或支链低碳烷基、或直链或支链低碳烷氧基；R3和R4分别选自H、卤素、任意被六元芳族取代的直链或支链低碳烷基、链烯基、炔基，环烷基或环链烯基环、羟基、甲硅烷氧基、酰氧基、直链或支链低碳烷氧基、苯甲酰基、羰烷氧基、氮原子处任意被低碳烷基或苯基取代的氨基甲酰基、或羧基；X和Y是当X和Y单键连接时分别是NR8和N，或当X和Y双键连接时分别是CR9和CR10，其中R8是H或低碳烷基；R9和R10分别选自H、卤代基和低碳烷基；Z选自O、S、SO和SO2；或其盐。有上述一般结构I的化合物可通过多种方法来制备，如a)在空气中在热乙酸中处理有一般结构II的硫代酰肼或相应的硫代腙，
或b)使有一般结构III的化合物与溴反应，
或c)在质子溶剂中加热有一般结构IV的化合物，
或d)使有一般结构V或VI的化合物和氢化钠反应，
或e)使有一般结构VII的化合物与碱反应，
或f)使有一般结构VIII的吡喃鎓与合适的亲核试剂反应，
其中R2、R3、R4、R5如上所确定，R选自Ar、NHAr、NHNHAr、COAr、羰烷氧基、烷氧基、NR6COAr、CH2OAr和CH2NR6Ar，其中Ar和R6如上确定，而且，还可通过去保护、偶联、加成、取代或消去使R、R2、R3、R6、R5的任何一个或多个基团转变成新的R、R2、R3、R4、R5；或通过硫氧化生成亚砜或砜；和如果需要，可使有一般结构I的化合物转变为它的盐或使其不含它的盐。
实施例在空气下使二苯基硫腙在回流的乙酸中加热30至90分钟以生成苯并硫代二氮烯1。
有一般结构I的特别典型的化合物包括3-苯偶氮基-1H-4，1，2-苯并硫代二氮烯2-苯偶氮基-2H-苯并吡喃适用于本发明方法的另一类化合物有化学式
其中Ra是非干扰的取代基；n是0-5间的整数；L是不含氮的挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的苯基或取代或非取代的萘基。
这类化合物中特别佳的化合物有化学式
其中R35选自H、羟基、烷氧基、酰氧基和甲硅烷基氧基；R36是Ar或COAr，其中Ar是(非)取代的苯基，其中可允许的取代基选自H、羟基、(非)取代的烷氧基、酰氧基、甲硅烷氧基、(非)取代烷基、(非)取代链烯基、或(非)取代炔基、羧基、羰烷氧基、氮原子被低碳烷基和芳基任意取代的氨基甲酰基；R37选自H、羟基、烷氧基、卤代基、酰氧基和甲硅烷氧基；R38选自H、羟基、烷氧基、酰氧基、甲硅烷氧基、(非)取代烷氧基、酰氧基、甲硅烷氧基、(非)取代烷基、(非)取代链烯基和(非)取代炔基，或其盐。
有一般结构XXXV的化合物可通过用合适的有一般结构XXXVII的醛在碱性或酸性条件下与有一般结构XXXVI的苯乙酮反应来制得，
或通过用有一般结构XXXIX的酰基卤在合适的催化剂如三氯化铝存在下与有一般结构XXXVIII的合适的炔反应来制得，
或通过有一般结构XXXIX的酰基卤与(E)-1，2-双(三-正-丁基甲锡烷基(stanyl))乙烯，或与有一般结构XL的乙烯基锡烷(vinylstanane)在合适的催化剂如钯催化剂存在下反应来制得，
或通过用强碱来处理有一般结构XLI的苯乙酮来制得，
其中R35、R36、R37和R38如上确定，并且还可通过去保护、偶联、加成、取代或消去使R35、R36、R37和R38的任何一个或多个基团转变成新的R35、R36、R37和R38；并且如果需要，可使有一般结构XXXV的化合物转变为它的盐或使其不含它的盐。有一般结构XXXV的特别典型的化合物包括2，4-二甲氧基-2’-羟基查耳酮1-(2-羟基苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-1，3-丙二酮1，4-二氧-1，4-二苯基丁-2-烯。还有一类用于本发明的化合物，它们有化学式
其中Ra是非干扰的取代基；n是0至5间的整数；L是受限连接物；和Ar2是取代的或非取代苯基或取代的或非取代萘基。这一类中特别佳的化合物是如下的化学式IX、XIV
其中R11和R12分别选自H、羟基、C1-6烷氧基、乙酰氧基和C1-12(非)取代烷基；R13、R14和R17分别选自H、羟基、C1-6直链或支链烷氧基和乙酰氧基；R15选自羟基、(非)取代C1-12烷氧基、C1-12烷基、(非)取代链烯基和乙酰氧基；R16选自H、羟基、(非)取代低碳烷氧基、乙酸基、(非)取代烷基和(非)取代链烯基；其中R11、R12可形成5-7元的(非)取代碳环或杂环；其中R15、R16可形成5-7元的(非)取代碳环或杂环；X1是羰基或CH2；以及虚线可以是双键，其中上述取代基团上允许的取代基包括低碳烷基、低碳烷氧基、羟基、甲硅烷氧基、卤代基、羧基和芳基，其前提条件是
如果X1是羰基和如果R15是羟基，如果R11、R12或R13中只有一个是羟基，则R14、R16和R17中至少有一个必须不是H；或如果R15是烷氧基，且如果R11、R12、R13同时为H、则R17可以不是H或羟基；或如果R15是(非)取代烷氧基，且如果R11、R12、R13同时只包括H或H和一个或两个烷氧基，且R17是H，则R14必须不是H、Me或羟基甲基；或如果R15是羟基或烷氧基，且如果R11、R12、R13同时只包括H或H和一个或两个烷氧基，或H和仅仅一个或两个烷基，且R17是C1-4烷基，则R14和R16中的至少一个不是H；或如果R15是羟基且如果R11、R12、R13、R14和R16均为H，则R17必须非H也非羟基；或如果R15是异丙氧基，且如果R11、R12和R13则同时均只包括H、或H和一个或两个羟基，则R14、R16、R17中的至少一个必须不为H；或如果R15是1，5二(低碳)烷基C5-10烷基，则R11、R12、R13、R14、R16和R17中的至少一个必须不为H；或其盐。
有上述一般结构的化合物可通过有以下结构(X)的酮
在碱存在下与原甲酸烷基酯反应，或在吡啶存在下与乙基草酰氯反应然后水解和脱羧，或在碱金属存在下与甲酸烷基酯反应，或在磷酰氯存在下与N，N-二烷基甲酰胺反应，或在卤化氢存在下与氰化物反应，或通过有一般结构(XI)的2-羟基异类黄酮脱水；
或使有一般结构XII的化合物进行催化加氢，
或使有一般结构XIII的化合物与(PF6)2Rh(EtC5Me4)(C6H6)反应，化合物通过相应的乙酸苯酯与合适的苄基卤烷基化反应然后还原获得，
其中基团R11、R12、R13、R14、R15、R16和R17如上确定，然后R11、R12、R13、R14、R15、R16和R17中的任何一个或多个基团可任意地通过去保护、脱氢、加成、取代或消去，且如果需要，可通过有一般结构IX的化合物转变为它的盐或使其不含其盐来转变成新的R11、R12、R13、R14、R15、R16和R17。
实施例使1，3，5-三羟基苯与异戊炔基氯反应，然后催化加氢生成产物2。使化合物2与酰基氯3反应生成酮4。酮4在吡啶中0℃下用乙基草酰氯处理生成酯，酯在含有碳酸钠的水性丙酮中水解生成酸5。酸5在回流甲苯中加热时发生脱羧，生成化合物6，化合物在用2.3-二氯-5.6-二氰基-1，4-苯并醌处理后生成异类黄酮7。
有一般结构IX的特别典型的化合物包括鸢尾黄素、罗伯斯酮(robustone)、罗伯斯酮甲基醚、7，2′，4′-三羟基异类黄酮、6，2′，3′-三羟基-7，4′-二甲氧基异黄烷、8，4′-二甲氧基-7-羟基异类黄酮。
化合物XIV有结构
其中R18和R19分别选自H、羟基、(非)取代烷基、(非)取代烷氧基、COR21、羧基、羰烷氧基、OR22、氮原子处被低碳链烷基或苯基取代的氨基甲酰基、酰氧基、卤代基、氰基和叠氮基。
R20选自H、羟基、卤代基、低碳链烷基、酰氧基和甲硅烷氧基；其中R21选自烷基、链烯基、炔基、芳烷基、(非)取代苯基、(非)取代萘基、噻吩基、呋喃基和吡啶基；和R22由C3-6烃类组成；或其盐。
有一般结构XIV的化合物可通过有一般结构XV的内鎓盐与有一般结构XVI的酰基氯或有一般结构XVII的酸酐反应来制得
或通过有一般结构XVIII的酸与多磷酸、三氟乙酸酐或类似试剂反应来制得，
或通过有一般结构XIX的查耳酮与碱反应、或在与碱反应后与2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯并醌反应来制得。
其中基团R18、R19、R20如上所述，然后，R18、R19、R20中的任何一个或多个基团可任意地通过去保护、偶连、加成、取代或消去，且如果需要，可通过有一般结构XIV的化合物转变为它的盐或使其不含其盐来转变成新的R18、R19、R20基团。
有一般结构XIV的特别典型的化合物是5，4′-二甲基-7-乙酰类黄酮、7-苯甲酰基类黄酮、乙酸芹菜苷酯。有结构XX的化合物有化学式
其中R23、R24、R25、R26分别选自H、羟基、(非)取代烷氧基、甲硅烷氧基、(非)取代烷基、(非)取代链烯基、卤代基、羧基和酰氧基，其中R23和R24以及R25和R26可同时为5-7元(非)取代碳环或杂环，其中上述任意取代基上的取代基可包括低碳链烷基、羟基、甲硅烷氧基、酰氧基、卤代基、苯甲酰基、羧基、羰烷氧基和氮原子位被低碳链烷基、苯基、噻吩基、呋喃基或吡啶基任意取代的氨基甲酰基；Y1选自O、-OCH2CH2O-、-OCH2CH2S-、-OCH2CH2CH2O-、-SCH2CH2CH2S-和-SCH2CH2S-；X2选自CH2、O和S；其有下列前提条件如果X和Y是O，R24或R25有均为烷氧基、或为烷氧基和烷基(不考虑次序)，则R23和R26中的至少一个不为H。
或其盐类。
有一般结构XX的化合物可通过有一般结构XXI的酰胺与伯-丁基锂和四甲基乙二胺在THF中反应，然后用有一般结构XXII的苯甲醛加成和酸加成来制得。获得的有一般结构XXIII的内酯可通过催化加氢，或用酸中活化的锌处理，然后用三氟乙酸酐脱水，
或通过有一般结构XXIV的二芳基醚与硫酸、三氯化铝、三氟乙酸酐或类似试剂反应来还原，
其中R23、R24、R25、R26如上确定，而且，R23、R24、R25、R26中的任何一个或多个基团可任意地通过去保护、偶连、加成、取代或消去，且如果需要，可通过有一般结构XX的化合物转变为它的盐或使其不含它的盐来转变成新的R23、R24、R25、R26基团。
有一般结构XX的特别典型的化合物包括3-异丙氧基蒽酮。
本发明中另一类有用的基团有化学式
其中X3是NR27，X4是CR30，X5是O，X6是CR31，X7是O-；或X3是NR30，X4是CR27或N，X5是NR31，X6是CR28，X7是O-或S-；或X3是NR27，X4是CR30，X5是NR28，X6是CR31，X7是O-或S-；或X3是NR27，X4是CR28或N，X5是NR30，X6是CR29，X7是NR32；
或X3是NR30，X4是CR27或N，X5是NR28，X6是CR29，X7是NR32；或X3是NR27，X4是CR30，X5是S，X6是CR31，X7是NR32；或X3是NR30，X4是CR27，X5是S，X6是CR28，X7是NR32；或X3是S，X4是CR30，X5是NR27，X6是CR31，X7是O-或S-；或X3是S，X4是CR30，X5是NR27，X6是CR28，X7是NR32；或X3是S，X4是CR27，X5是NR30，X6是CR28，X7是NR32；或X3是S，X4是CR30，X5是S，X6是CR27，X7是NR32；或X3是S，X4是CR30，X5是S，X6是CR31，X7是O；或X3是NR30，X4是CR27或N，X5是NR31，X6是N，X7是O-或S-；或X3是NR27，X4是CR30，X5是NR28，X6是N，X7是NR32或CZ2Z3；或X3是NR27，X4是CR28或N，X5是NR30，X6是N，X7是NR32或CZ2Z3；或X3是NR30，X4是N，X5是S，X6是CR31，X7是O-；或X3是S，X4是CR27，X5是NR30，X6是N，X7是NR32；或X3是S，X4是CR30，X5是NR27，X6是N，X7是NR32；或X3是O或S，X4是N，X5是NR30，X6是N，X7是NR32；其中R27。R28和R29分别是直链或支链低碳烷基；R30和R31分别选自H、直链或支链(非)取代烷基、(非)取代芳香族，其中取代基可包括卤素、直链或支链低碳烷基、链烯基、被六元芳香族任意取代的炔基、环烷基、或链烯环、羟基、直链或支链烷氧基、苯甲酰基、羰烷氧基、氮原子位被低碳链烷基或苯基或羧基任意取代的氨基甲酰基；R32选自Ar、COAr、COR33，其中Ar是六元(非)取代芳环，其中环上的取代基可包括卤素、直链或支链低碳烷基、链烯基、被六元芳香族任意取代的炔基、环烷基、或链烯环、羟基、直链或支链烷氧基、苯甲酰基、羰烷氧基、氮原子位被低碳链烷基或苯基或羧基任意取代的氨基甲酰基；R33选自H和直链或支链烷基；Z2和Z3分别选自CN和CO2R34；R34选自H、直链或支链烷基和(非)取代芳香族；或其盐类。
有一般结构XXV的化合物可通过使有一般结构XXVI的化合物(其中X8是NR30或S，X9是CR30或N，X10是NR30或S，Z4是CO2H、CO2R30或CN)与酰基氯或酸酐反应，
或通过使有一般结构XXVII的化合物(其中X11是NR30或S，X12是N或CR30，X13是卤素、SMe或OEt)与胺、硫化物或烯醇(enolate)反应，
或通过使有一般结构XXVIII的化合物(其中X15是O或S)与异氰酸酯、异硫氰酸酯或二硫化碳反应，
或通过使有一般结构XXIX的化合物与氢氧化钠反应，
或通过使有一般结构XXX的化合物与甲苯磺酸烷基酯、甲苯磺酸芳基酯或烷基卤反应，
或通过有一般结构XXXI的化合物与芳基异氰化二氯、碳酰氯、二氯硫化碳或3，3-双(甲基硫)丙烯腈反应，
或通过有一般结构XXXII的化合物(其中X16是O、S或NH)与乙醇钠或HCl在酰基氯存在下，或与HCl在酸酐存在下反应，
或通过有一般结构XXXIII的化合物(其中X17是NH或S)与酰基氯、酸酐或HONO反应，
或通过使有一般结构XXXIV的化合物与乙酸铜(Cu(acac)2)反应来制得。
其中R22、R28、R29、R30、R31、R32、R33和R34如上确定，而且，R22、R28、R29、R30、R31、R32、R33和R34中的任何一个或多个基团可任意地通过去保护、偶连、加成、取代或消去，且如果需要，可通过有一般结构XXV的化合物转变为它的盐或使其不含它的盐来转变成新的R22、R28、R29、R30、R31、R32、R33和R34基团。
有一般结构XXV的特别典型的化合物包括3-(4-氯苯基)-1，2，3，4-噁三唑鎓-5-(4-氯苯基)脒1，3-二(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四吡咯鎓-5氧化物。
下列实施例只是用来描述而不是限制本发明。
实施例1根据McDonald，W.S.等在Chem.Comm.(1969)392-393；Irving，H.N.N.H.等在Anal.Chim Acta(1970)49261-266中所述的方法来合成化合物59-0008。简单地说，将10.0克双硫腙溶于100毫升EtOH和50毫升AcOH，并加热回流18小时。冷却后，首先用100毫升水，然后用50毫升1N的NaOH稀释。通过加入6N的NaOH将该物质中和到pH5.0。然后将此深紫色的混合物在旋转蒸发器上浓缩以除去有机物。一旦液体的紫色褪去，过滤并收集黑色沉淀。通过快速色谱层析(4.5×25.7cm；EtAc/Hep.(1∶4)；Rf0.22)然后用EtOH来重结晶进行纯化以得到2.15克(25％得率)的黑紫色结晶，熔点＝184-185℃。1H NMR(CDCl3)7.90(d的d，J1＝7.7，J2＝2.2，2H)，7.64(峰，1H)，7.49(m，3H)，7.02(m，1H)，6.91(m，2H)，6.55(d，J＝8.1，1H)。MS(EI)254(47，M+)，105(26)，77[100]，51(27)。HRMS(EI，M+)254.0626(计算值254.0626182)。C13H10N4S计算值C.61.40；H.3.96；N.22.03。测定值C.61.40；H.4.20；N.22.06。
实施例2高检出筛选用美国专利申请08/458,434(1995，6，2提交，这里并入本文供参考)的分析系统来试验数千个化合物。标准的阳性对照是下式的本发明化合物59-0008(也称为“OS8”)
更详细地说，Ghosh-Choudhury等在“内分泌学(Endocrinology)”(1996)137331-39(结合入本文供参考)中使用了2T3-BMP-2-LUC细胞，一种稳定的转化成骨细胞。细胞用α-MEM、带有1％青霉素/链霉素和1％谷酰胺的10％FCS(“平皿接种培养基”)培养，每周以1∶5分裂。为了试验，将细胞以5×103细胞(在50微升内)/孔的浓度再悬浮于含有4％FCS的平皿接种培养基并置于微量滴要板中，在37℃、5％CO2中培养24小时。为了引发试验，向每个孔中加入50微升试验化合物或2X浓度的DMSO作为对照，结果最终体积为100微升。最终的血清浓度为2％FCS，最终的DMSO浓度为1％。化合物59-0008(10μM)被用作阳性对照。
将处理过的细胞在37℃、5％CO2下培养24小时。除去培养基，细胞用PBS淋洗三次。除去过量的PBS后，向每个孔中加入25微升1X细胞培养物裂解反应剂(Promega #E153A)，至少培养10分钟。任选的是将平皿/样品在该点冷冻。向每个孔中加入50微升萤光素酶底物(Promega #E152A；10毫升Promega萤光素酶分析缓冲液/7毫升Promega萤光素酶分析底物)。在自动化96-孔发光计上测量发光度，以每个孔中萤光素酶活性(pg)表示，或以每毫克蛋白质中萤光素酶活性(pg)表示。
在该试验中，如图1所示，化合物59-0008(3-苯基偶氮-1H-4，1，2-苯并噻二嗪)显示了反应活性。约3-10μM浓度，较好的是约3μM，化合物59-0008的活性最大，其产生的反应是约175发光单位。因此，评估其它各种浓度的化合物，将这些结果与10μM的59-0008所得的结果(其值被标准化到100)比较。例如，图2和图3中活性大于10μM的59-0008的活性的任何试验化合物，其结果数值超过100。
如图2(39片)和图3(10片)所示，一些化合物被发现特别有效。
实施例3体内颅盖骨的生长数据根据前述方法(参见“对鼠科动物颅盖骨生长有影响的化合物的体内分析”同前)对59-0008化合物进行体内分析。与赋形剂对照相比，化合物59-0008诱发了新生颅盖骨宽度增加4-倍。
实施例4软骨形成活性与重组的人BMP-2的作用比较，就化合物59-008、59-0102和50-0197对软骨细胞分化的影响进行分析。简单地说，鼠克隆软骨形成细胞系，TMC-23，从含BMP-2基因控制区域驱动的SV-40大T-抗原的转基因鼠的软肋骨中分离和克隆得到，所述的转基因鼠的软肋骨按照Ghosh-Choudhury等人在“内分泌学(Endocrinology)”137331-39，1996中所述的方法产生。这些细胞在DMEM/10％FCS中培养，在汇合后7天，它们能表达T-抗原，也能产生聚集蛋白聚糖(pH1.0时染成甲苯胺蓝)和II-型胶原蛋白(免疫染色)。
为了测量碱性磷酸酯酶(ALP)的活性，使用LF Bonewald等人在Biol.Chem.(1992)2678943-49中所述的技术。简单地说，将TMC-23细胞以4×103细胞/孔接种在含10％FCS的DMEM的96-孔微滴定板上。接种后2天，汇合细胞，培养基用新鲜的含10％FCS和不同浓度的化合物或重组BMP-2的培养基替代。再经2天或5天培养后，平皿用PBS洗涤两次，然后加入裂解液(0.05％Triton X-100)(100微升/孔)。经三次在-70℃下30分钟冷冻-然后在37℃下熔融的循环(振摇30分钟)，细胞溶解。用在1.5M 2-氨基-2-甲基-丙醇缓冲液(pH10.3)(Sigma ALP试剂盒，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中的80微升5mM对-硝基苯酚磷酸盐对20微升细胞溶解物在37℃下分析10分钟。通过加入100微升0.5M NaOH来停止反应。将405nm处的光谱吸收与对-硝基苯酚标准物的比较以评估样品的ALP活性。细胞溶解物的蛋白质含量用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad，美国加利福尼亚)来测定。用这两个参数来计算比活性。
在第2天，与载体对照相比，化合物59-0008(10-9M)、59-0102(10-7M)和59-0197(10-9M)的ALP活性各自增加了约3-、2-和2.5-倍。100、50或10ng/ml的重组BMP2诱导ALP水平约是赋形剂对照的10-倍、4-倍或1.5-倍。
应当明白，虽然为了阐述的目的已经揭示了本发明的特定技术方案，但可作出许多改变而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明除了所附的权利要求书外，不为其它所限定。
权利要求
1.一种治疗脊椎动物疾病的方法，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，方法包括用有效量的有下式的化合物对需要这种治疗的脊椎动物给药
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-4间的整数；每一虚线表示任意的π建；每个Z分别为N、NR、O、S、CR或CR2，其中每个R分别是H或有1-6个碳的烷基；X是O、S、SO或SO2；L是挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的6元芳环。
2.根据权利要求1所述的方法，其中L是挠性共轭连接物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中L选自一个共价键、-N＝N-、-RC＝CR-、-RC＝N-、-N＝CR-、-NRCO-、-CONR-、-CR2O-和-CR2NR-，其中每个R分别是H或有1-6个碳的烷基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中Ar2是
其中Rb是不干扰的取代基，n是0至5间的一个整数。
5.根据权利要求4所述的方法，其中Ar2是非取代苯基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是59-0008。
7.一种用于治疗脊椎动物疾病的药物组合物，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，组合物包括药学上可接受的赋形剂和有效量的有下式的化合物
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-4间的整数；每一虚线表示任意的π建；每个Z分别为N、NR、O、S、CR或CR2，其中每个R分别是H或有1-6个碳的烷基；X是O、S、SO或SO2；L是挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的6元芳环。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中L是挠性共轭连接物。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中L选自一个共价键、-N＝N-、-RC＝CR-、-RC＝N-、-N＝CR-、-NRCO-、-CONR-、-CR2O-和-CR2NR-，其中每个R分别是H或有1-6个碳的烷基。
10.根据权利要求7所述的方法，其中Ar2是
其中Rb是不干扰的取代基，n是0至5间的一个整数。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中Ar2是非取代苯基。
12.根据权利要求7所述的组合物，其中所述化合物是59-0008。
13.一种治疗脊椎动物疾病的方法，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，方法包括用有效量的有下式的化合物对需要这种治疗的脊椎动物给药
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-5间的整数；L是不含氮原子的挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的苯基或取代的或非取代的萘基。
14.根据权利要求13所述的方法，其中Ra是-NR2-或-COOR，其中R是H或1-6个碳的烷基。
15.根据权利要求13所述的方法，其中Ar2是取代的或非取代的苯基。
16.根据权利要求13所述的方法，其中Ar1和Ar2是不同的。
17.一种用于治疗脊椎动物疾病的方法的药物组合物，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，组合物包括药学上可接受的赋形剂和有效量的有下式的化合物
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-5间的整数；L是不含氮原子的挠性连接物；和Ar2是取代的或非取代的苯基或取代的或非取代的萘基。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中Ra是-NR2-或-COOR，其中R是H或1-6个碳的烷基。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中Ar2是取代的或非取代的苯基。
20.根据权利要求17所述的组合物，其中Ar1和Ar2是不同的。
21.一种治疗脊椎动物疾病的方法，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，方法包括用有效量的有下式的化合物对需要这种治疗的脊椎动物给药
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-5间的整数；L是受限连接物；和Ar2是取代的或非取代的苯基或取代的或非取代的萘基。
22.根据权利要求21所述的方法，其中R1是-NR2或-COOR，其中R是H或1-6个碳的烷基。
23.根据权利要求21所述的方法，其中Ar2是取代的或非取代的苯基。
24.一种用于治疗脊椎动物疾病的药物组合物，疾病的特征是缺乏或需要骨生长替代和/或有不希望水平的骨吸收，组合物包括药学上可接受的赋形剂和有效量的有下式的化合物
其中Ra是不干扰的取代基；m是0-5间的整数；L是受限连接物；和Ar2是取代的或非取代的苯基或取代的或非取代的萘基。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中R1是-NR2或-COOR，其中R是H或1-6个碳的烷基。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中AR2是取代的或非取代的苯基。
27.根据权利要求1、13或21任一所述的方法，其中所述疾病是骨质疏松症、骨折或骨缺陷、原发性或非先天性甲状旁腺机能亢进、牙周病或缺损、骨转移疾病、溶骨性疾病、整形手术后的疾病、假补关节手术后的疾病或牙科移植后的疾病。
28.根据权利要求1、13或21任一所述的方法，还包括用一种或多种可促进骨生长或抑制骨吸收的试剂来对主体给药。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述试剂选自骨形态发生因子、抗吸收试剂、成骨因子、从软骨衍生获得的形态发生蛋白、生长激素和分化因子。
全文摘要
一种含有通过连接物共价连接的两个芳香系统的化合物,其可有效地治疗与骨缺陷有关的疾病,其中连接物含有一个或多个原子或定义为只包括一个共价键,其使芳香系统隔开1.5至15埃。化合物可单独或与附加的促进骨生长或抑制骨吸收的试剂组合来对脊椎动物主体给药。在给药前,可通过评价它们对报道基因转录的影响或在模型动物系统中刺激颅盖生长的能力来对它们进行筛选,其中报道基因与骨形态发生蛋白的启动子连接。
文档编号C07D285/16GK1201393SQ96197827
公开日1998年12月9日 申请日期1996年10月23日 优先权日1995年10月23日
发明者C·皮特里, M·W·奥姆, N·贝恩德, K·G·罗宾斯, S·M·哈里斯, M·孔托亚尼, L·H·赫而利, S·M·克尔温, G·R·芒迪 申请人:酶遗传学股份有限公司, 骨筛选股份有限公司, 得克萨斯州大学系统董事会