专利名称：Cc型趋化因子样蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的CC型趋化因子样蛋白质、编码该蛋白质的DNA、含有该DNA的载体，含有该载体的转化体。此外，本发明涉及上述新型蛋白质的应用以及含有该蛋白质的医药组合物的应用，如作为抗炎剂、免疫应答调节剂、与炎症和/或与免疫相关疾病的诊断药。本发明还涉及该蛋白质的单克隆抗体和产生该抗体的杂交瘤。
背景技术：
由物理、化学、或生物学因素而引起的各种外源性或内源性组织损伤、侵袭、接触抗原等诱导强有力的炎症反应和免疫反应。虽然这些反应是重要的机体防御反应，但有时又成为急性或慢性疾病的原因。当诱发炎症反应和免疫反应的原因物质接触组织的时候，中性粒细胞、粒细胞、淋巴细胞或巨噬细胞等炎症性细胞或免疫活性细胞首先吸附到血管内皮，并向血管外迁移，然后聚集在侵袭或损伤组织及存在抗原的组织，这就引起了炎症反应和免疫反应。作为诱导这样序列细胞迁移反应的物质，有一组趋化作用的细胞因子，即所谓的趋化因子。趋化因子是一组能诱导迁移反应(趋化反应)的细胞因子，目前已报道的至少有18种趋化因子。已知，由于这些趋化因子的氨基酸序列存在相似性，其结构彼此密切相关。
根据通常保存的4个半胱氨酸残基中最初两个的排列顺序，可将趋化因子大致分为两型α或CXC型(2个半胱氨酸由1个氨基酸间隔开)和β或CC型(2个半胱氨酸相邻)。已知人类的CXC型趋化因子包括IL-8、β-TG、PF-4、MGSA/GRO、ENA-78、NAP-2、GCP-1、GCP-2、IP-10等，它们主要诱导中性粒细胞的活化和迁移。已知人类的CC型趋化因子有MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、I-309等，它们主要诱导单核/巨噬细胞的活化和迁移。而且CC型趋化因子也能诱导T细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞的活化和迁移(J.J.Oppenheim等，免疫学年刊9617-648，1991；M.Baggiolini & C.A.Dahinden，今日免疫15127-133，1994)。此外，最近报道趋化因子SCM-1不属于上述2种趋化因子类型中的任何一种，推测为γ型或C型(T.Yoshida等，FEBS Letters 360155-159，1995)。
如上所述，由于趋化因子与生物体的防御反应密切相关，所以新型趋化因子的鉴定和其活性的阐明不仅大大有利于分析与趋化因子相关的免疫应答，而且大大利于开发相关症状和疾病的治疗、预防和诊断方法。人源的趋化因子有益于实现该目的，而进行必要的动物实验时，有必要应用人之外的动物，优选小鼠来源的趋化因子。因此人们希望获得新型的人源趋化因子，以及相应的小鼠来源的趋化因子。但是，与多数微量即具有活性的生理活性物质相同，得到新型趋化因子并不容易。
本发明人们考虑到趋化因子是结构上具有相似性的分泌蛋白质，想通过信号序列捕获法获得趋化因子，为此进行了许多研究。
即用独创的信号序列捕获载体(Yoshida等，FEBS Letters 360155-159，1995)从用丝裂原刺激的正常人外周血单核细胞分离大量的编码分泌型蛋白质和I型膜蛋白质的cDNA片段，将其碱基序列与已知的数据库相比较，找到有可能编码CC型趋化因子特征序列的cDNA片段。然后用该cDNA片段分离全长cDNA，测定碱基序列并进行鉴定。就象这样，本发明人们最后成功地获得编码具有信号序列、分离信号序列后属于成熟型CC型趋化因子的分泌型蛋白质的DNA。
将该新型的DNA插入到适当的表达载体中，然后将表达载体转化到合适的宿主细胞，培养转化体，该转化体就能产生对HUT78细胞显示细胞迁移活性的CC型人趋化因子样蛋白质。然后，用这人源的编码趋化因子样蛋白质的DNA，最终在转化体的表达中成功获得相应小鼠的基因组DNA和cDNA。新型人源的编码CC型趋化因子样蛋白质的DNA的碱基序列及其推定的氨基酸序列如序列号1所示，小鼠来源的编码CC型趋化因子样蛋白质的DNA的碱基序列及其推定的氨基酸序列如序列号2所示。发明公开本发明具有以下特征1)在免疫刺激物的存在下从外周血单核细胞诱导表达；2)在缺乏刺激时主要从胸腺表达而不是从脾；和3)提供蛋白质，它具有CC型趋化因子特征的2个相邻半胱氨酸残基。
本发明的新型CC型趋化因子样蛋白质，是在免疫学刺激的存在下从外周血单核细胞表达的，但在植物血凝素(PHA)及体液免疫的诱导下能更好地表达。尤其是在GM-CSF、IL-3和IL-4等与体液免疫诱导相关的细胞因子的存在下，从单核细胞表达最好。但是具有这样的特征不用TNP-α、IPN-γ等细胞免疫诱导的细胞因子或LPS等进行诱导。
本发明的新型蛋白质，其组成性表达器官为胸腺、并且在对免疫学刺激的应答中诱导产生，基于这些特性，本发明人将该蛋白质命名为“TARC”[Thymus and Activation-Regulated Chemokine(胸腺和活化调节的趋化因子)]。因此，本说明书中，称这种新型蛋白质为TARC或TARC蛋白质，编码它的DNA称为TARC DNA。“TARC”包括人源和小鼠来源的TARC，但在必要的时候，称人源的TARC为人TARC或hTARC，称小鼠来源的TARC为小鼠TARC或mTARC。另外，编码这些蛋白质的DNA分别称为人TARC DNA、hTARC DNA、小鼠TARC DNA、mTARC DNA。但是，有时将人TARC和编码它的DNA简单称作TARC及TARC DNA。另外，本说明书中与TARC相关的，编码它的DNA或基因术语有可能交换使用。而DNA可以是合成的或天然的DNA。
另外，由于编码本发明TARC的DNA的公开，该领域的技术人员可用该技术领域熟知的方法，通过，1个或多个氨基酸的替换、插入或缺失等容易地获得具有与有上述氨基酸序列的TARC基本上同等功能或活性的TARC变异体。因此，如上得到的变异体也包含在本发明的TARC之内。
因此本发明还提供CC型趋化因子样蛋白质，它具有序列号1中氨基酸残基24～94的氨基酸序列，或者提供其变异体，该变异体具有该序列中氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，并具有与人CC型趋化因子样蛋白质基本上的向等的功能或活性。
另外本发明还提供具有序列号1的氨基酸残基中1～94氨基酸序列的人CC型趋化因子样蛋白质或其变异体，该变异体具有该序列中氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该人CC型趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性。
本发明还提供具有序列号2的氨基酸残基24～93氨基酸序列的小鼠CC型趋化因子样蛋白质或其变异体，该变异体具有该序列中氨基酸残或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该小鼠CC型趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性。
此外，本发明还提供具有序列号2的氨基酸残基1～93氨基酸序列的小鼠CC型趋化因子样蛋白质或其变异体，该变异体具有该序列中氨基酸残或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该小鼠CC型趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性。本说明书中，TARC的“变异体”与具有说明书中氨基酸序列的TARC基本上的同等的功能或活性，具有化学或生化学的改变，或者含有天然或非天然的氨基酸。附图简述
图1表示人TARC的cDNA的碱基序列和推定的氨基酸序列。
图2表示本发明的人TARC蛋白质与已知的7种人CC型趋化因子的氨基酸序列进行比较的结果。
图3中A是用PHA刺激正常人外周血单核细胞后的时间以及用Northern印迹分析hTARC mRNA表达的结果的照片，B为用Northern印迹分析各种组织中hTARC mRNA表达的结果的照片。
图4是重组载体pVL-TARC的基因图谱。
图5中A表示昆虫细胞中产生的人TARC的最终纯品从Cosmosil5C4-300柱(Nacalai Tesque)的洗脱带，B为表明SDS-PAGE结果的电泳照片。
图6为表达载体pGEMEX-TARC的基因图。
图7是表明大肠杆菌中表达的人TARC纯化的各阶段进行的SDS-PAGE的结果的电泳照片。
图8是小鼠TARC的cDNA的碱基序列和推定的氨基酸序列图。
图9是重组载体pVL-mTARC的基因图。
图10中A为昆虫细胞中产生的小鼠TARC的最终纯品从Cosmosil5C4-300柱(Nacalai Tesque)的洗脱带，B为表明SDS-PAGE结果的电泳的照片。
图11是将昆虫细胞中产生的纯化的小鼠TARC皮下注射到Balb/C小鼠，24h小时后观察其组织的形态学，其中用苏木精-伊红组织染色来观察细胞的浸润像。
图12是只将PBS注射到Balb/C小鼠皮下，24h后通过苏木精-伊红染色观察细胞浸润像时的组织形态的照片。
图13是表明125I标记的TARC与各种细胞进行特异性结合结果的棒图。
图15中，A表示125I标记的TARC浓度固定，非标记的TARC浓度变化的情况下，与Jurkat细胞进行特异性结合量的变化图，B表示125I标记的TARC浓度一定的时候，不存在非标记的趋化因子或在200nm其它趋化因子或TARC存在下，与Jurkat细胞结合的125I标记的TARC结合量图。
图16表示125I标记的TARC的浓度固定，非标记的其它趋化因子或TARC的浓度变化的情况下，与红细胞进行特异性结合量的变化。
图17是图16中所示的结果的散点(Scatchard)图。
图18表示TARC的浓度对HUT78细胞迁移活性的影响。
图19表示TARC的浓度对粒细胞迁移活性的影响。
图20表明TARC的浓度对单核细胞迁移活性的影响。
图21表明在PHA、抗CD3抗体和LPS的刺激下正常人外周血单核细胞TARC表达随时间的变化图。
图22表示在各种细胞因子[IL-1α(R&D)、IL-2(Sionogi制药公司)、IL-3(Genzyme)、IL-4(PeproTech)、IL-7(PeproTech)、IL-10(Genzyme)、GM-CSF(Genzyme)、TNF-α(PeproTech)、IFN-γ(Sionogi制药公司)、M-CSF及PHA(R &D)]的刺激下，正常人外周血单核细胞TARC的表达量。
图23表示细胞因子的浓度与正常人外周血单核细胞TARC表达量的关系。
图24表示PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4对从正常人外周血单核细胞分离的CD14阳性单核细胞和CD14阴性淋巴细胞诱导TARC表达的效果。
图25是在PHA(GIBCO-BRL)、LPS(L4391、Sigma)、IL-4(PeproTech)、IL-3(Genzyme)或GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血单核细胞，用Northern印迹分析TARC mRNA表达的结果。
图26中A表示在细胞因子(IL-4、IL-3或GM-CSF)的刺激下从正常人外周血单核细胞分泌的TARC对T细胞株HUT78的迁移活性，图26中B表示只有在抗TARC抗体的情况下对HUT78的迁移活性才能消失。
图27表示细胞因子IFN-γ和IL-10对细胞因子刺激下正常人外周血单核细胞TARC表达的抑制作用。
图28是表达TARC和SEAP融合蛋白的重组载体pDREF-TARC-SEAP(His)的基因图。
图29表示将TARC-SEAP的浓度固定在1nM，非标记的TARC浓度变化的情况下，表达CCR4的293/EBNA-1细胞与TARC-SEAP进行特异性结合的结合量的变化。
图30表示将TARC-SEAP的浓度固定在1nM时，各TARC在内的各种非标记人趋化因子为200nM时，对表达CCR4的293/EBNA-1细胞与TARC-SEAP结合的抑制作用。
图31表示TARC、RANTES及MIP-1α的浓度对表达CCR4的293/EBNA-1细胞迁移活性的影响。实施发明的最佳方案对本发明的TARC进行各种研究，结果表明TARC具有如下所述与已知的CC型趋化因子不同的特性，是一种新型的蛋白质。
(1)人TARC在基因水平上是由94个氨基酸组成的蛋白质，从结构上分析推测在23和24位的丙氨酸间切开信号序列后是一由71个氨基酸组成的分子量约8kDa的碱性的成熟蛋白。
(2)成熟型TARC显示出与CC型趋化因子明显的同源性，尤其是全部保持CC型趋化因子保持的4个半胱氨酸(参照图2)。
(3)与已知的CC型趋化因子的同源性达30％，对RANTES最高达29％。
(4)与已知的CC型趋化因子不同，几乎只在胸腺组织中组成性表达。
(5)在免疫学刺激下，在外周血单核细胞中(PMBC)表达。
(6)在PMBC中的表达具有以下特征，如1)非特异的植物血凝素比T细胞特异的抗CD3抗体具有更强的刺激作用，而对普通趋化因子的表达具有诱导活性的LPS不能诱导表达。
2)生理浓度的细胞因子(GM-CSF，IL-3，IL-4)能诱导表达。
3)能诱导已知趋化因子表达的TNF-α、IFN-γ不能诱导表达。
4)PHA、GM-CSF、IL-3和IL-4也可诱导TARC mRNA的表达。
5)GM-CSF、IL-3、IL-4只刺激单核细胞的分泌，而PHA、PHA/PMA只刺激淋巴细胞的分泌，PHA刺激诱导表达在加入PMA后显著受抑制。
6)未刺激和LPS刺激的人外周血单核细胞几乎不表达TARC的mRNA，而GM-CSF、IL-3的刺激下能诱导400倍的表达，IL-4、PHA的刺激下约诱导40倍的表达。
7)小鼠TARC有与人TARC同样的特征，在基因水平上是由93个氨基酸组成的蛋白质，从结构上分析，推测在23位和24位的丙氨酸间切开信号序列后，是一种成熟蛋白，是由70个氨基酸组成，分子量约为8kDa的碱性蛋白质。
8)人TARC与小鼠TARC的同源性高达64.4％。
9)具有白细胞浸润作用(趋化因子样活性)。
10)TARC的受体在某些T细胞(Jurkat、Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102)、外周血淋巴细胞、活性外周血T细胞上表达。
11)细胞上的TARC受体不依赖于其它趋化因子的受体，与TARC的结合不被其它趋化因子所抑制。
12)红细胞上趋化因子受体中的1个与DARC特异性结合。
13)在IL-3及GM-CSF的刺激下，正常人外周血单核细胞的培养液能引起HUT78细胞强烈的迁移，而未经刺激或IL-4刺激下的培养液不引起迁移。另外，经GM-CSF处理的培养上清对HUT78细胞的迁移性经豚鼠抗TARC抗体处理后几乎消失。
14)抑制IL-4诱导的体液免疫的IFN-γ，普遍抑制免疫应答的IL-10能抑制GM-CSF、IL-3、IL-4刺激下诱导的外周血单核细胞TARC的表达。
15)据报道，MIP-1α、RANTES、MCP-I的受体与CCR4(C.A.Power等，生化杂志，Vol.270，NO.33，19495-19500，1995)特异性结合(该文献中报道用非洲爪蟾卵细胞表达的CCR4进行实验)。
16)对表达CCR4的293/FBNA-1细胞具有迁移活性。
以上表明本发明的TARC属于CC型趋化因子，是一种新型的细胞因子。另外，TARC在免疫学刺激下诱导产生，并且只在胸腺内组成型表达，在外周中，在某些细胞因子(GM-CSF、IL-3或IL-4)的刺激下从外周血的单核细胞表达。
因此推测TARC与未成熟的T细胞向胸腺组织迁移和胸腺组织中T细胞的分化成熟相关。此外，在免疫刺激下诱导外周单核细胞产生这一事实表明TARC在炎症和免疫反应中起重要作用。TARC在生物体内的炎症反应和免疫反应中能诱导白细胞的迁移和活性，并且对胸腺T细胞的分化成熟起到重要作用，因此我们认为它是医学上的重要蛋白质。
上述TARC的表达与已知的CC型趋化因子有显著不同，这表明TARC具有特异的生理学功能。例如，非特异性植物血凝素(PHA)比T细胞特异的抗CD3抗体具有更强的刺激作用，这表明TARC应该在T细胞分泌的细胞因子的刺激下从外周血单核细胞(PMBC)表达，而不是T细胞直接分泌。LPS能诱导大多数已知趋化因子表达，而对单核细胞不能诱导TARC的表达，这一点也表明了上面的情况。
具体而言，TARC的表达在各种细胞因子的诱导下产生，尤其是在GM-CSF、IL-3和IL-4的作用下能更强的诱导表达。这些细胞因子中前二者与免疫系统维持自身恒定相关，IL-4与变态反应等体液免疫的诱导相关，由此可推测，TARC在诱导体液免疫的状态下发挥功能。再者能诱导已知趋化因子表达的TNF-α、IFN-γ不能诱导TARC表达，这提示TARC在与其它趋化因子不同的状态下表达，发挥作用。但是，这些事实不能否定除正常人末梢单核细胞外，淋巴细胞也表达TARC的可能性。
另外发现，当PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯)与PHA一起使用时，能更好地诱导大多数趋化因子的表达，而作用于TARC时，表达减少。这表明TARC的表达在与IL-4的表达相同的控制下进行。这支持TARC与Il-4同样与体液免疫相关这一推测。
另外，GM-CSF、IL-3刺激正常人外周血单核细胞所得培养液与重组TARC同样对HUT78细胞显示细胞迁移活性。GM-CSF刺激所得培养液的迁移活性被抗TARC抗体所中和。这表明与重组TARC同样，正常人外周血单核细胞分泌的TARC也对表达TARC特异受体的细胞具有细胞迁移活性。
如上所述，与其它趋化因子不同TARC的表达是在诱导体液免疫的时候诱导外周血单核细胞表达。IL-4诱导体液免疫，IFN-γ则抑制，相反，IFN-γ诱导细胞免疫，而IL-4则抑制。另外IL-10抑制整体免疫。GM-CSF、IL-3和IL-4诱导正常人外周血单核细胞表达TARC能被IFN-γ、IL-10所抑制。这表明TARC在诱导免疫反应的情况下表达，且在诱导体液免疫反应的状态下表达，相反在细胞免疫的状态下其表达受到抑制。由此我们认为TARC尤其在变态反应、特异性变态反应。哮喘等体液免疫的状态下表达，发挥作用。
本发明TARC功能的阐释，有利于阐明胸腺功能、T细胞的分化和成熟、炎症反应和免疫反应的机制等，由此有利于提供诱导或抑制炎症反应或免疫反应的新手段。另外，本发明的编码TARC的基因(DNA)和抗-TARC抗体，有利于分析TARC基因的突变及其mRNA、蛋白质的表达状态，为揭示血液系统和免疫系统疾病的病因和诊断提供新手段，由此有利于开发诊断和治疗这些疾病的新方法。
另外，将编码本发明TARC的基因(DNA插入到适当的载体，以体外导入培养细胞，或者直接体内施用，可有利于开发基因治疗，如对TARC基因异常引起的遗传性疾病，各种癌症及艾滋病等致死性感染性疾病。
除此之外，预计通过测定TARC的血液浓度可诊断过敏反应。特异性变态反应、哮喘等。另外，估计通过抑制TARC的表达和活性，可治疗或预防过敏反应，特异性变态反应、哮喘等，通过诱导TARC的表达和活化可诱导体液免疫抑制细胞免疫。
因此，本发明还提供包含本发明TARC或其变异体在内的医药组合物。本发明的医药组合物包括预防药、治疗药和诊断药，其施用量和施用途径可通过常规方法，根据使用目的、施用对象的病情等适当决定。再者，由于本发明的TARC蛋白质本来是生物体内的活性物质，所以不难理解产生该蛋白质活性的量，即本发明医药组合物中使用范围内的剂量不会出现急性中毒问题。
为了各种不同的目的，TARC和含有其活性部分的片段，针对该TARC及其片段的单克隆(单抗)或多克隆抗体、与TARC特异性结合的受体等均有用。
因此本发明还提供TARC特异的单克隆抗体及生产单抗的杂交瘤。如后面实施例所述，可用该领域确立的已知方法制备这种抗体和杂交瘤。
鉴于本发明TARC蛋白质的作用，若能检测该蛋白质的激动剂或拮抗剂将有利于TARC相关疾病或异常状态的治疗、预防或诊断。如本发明中所公开的，利用TARC蛋白质定量法、受体特异性等来筛选这些物质。
因此，本发明还提供筛选TARC蛋白质激动剂或拮抗剂的方法，它包括将推测含有该激动剂或拮抗剂的样品与分泌该蛋白质的细胞及诱导该蛋白质分泌的细胞因子混合，测定该蛋白质的分泌量。
例如参照后面实施例中所示的蛋白定量法对TARC蛋白质进行定量。
另外，上面方法中所用的细胞因子包括，如GM-CSF、IL-3和IL-4，分泌TARC的细胞，如外周血单核细胞。
此外，本发明提供筛选TARC蛋白质激动剂或拮抗剂的反应，它包括将推测含有该激动剂或拮抗剂的样品与该蛋白质特异的受体进行反应，测定其结合活性和/或反应性。
上面方法中应用的受体，如可用CCR4，可用后面实施例中所述的方法测定结合活性或反应性。
下面将说明本发明TARC的制造和鉴定方法。如无特别指示以下的描述只是举例说明，可适当应用本领域的技术人员所熟知的技术进行基因重组、转化宿主细胞、用转化体生产重组蛋白质，分离纯化表达的蛋白质以及分析法和免疫学方法等。I.编码TARC蛋白质的DNA序列的确定含编码本发明TARC蛋白质的DNA的DNA片段，比如，可从植物血凝素(PHA)刺激的正常人外周血单核细胞(PBMC)来源的cDNA文库获得。
(1)探针的制备用以下方法制备从cDNA文库筛选编码TARC蛋白质的基因用的探针。
由于TARC为分泌型蛋白质，所以其mRNA 5′端是编码信号序列的区域。因此，首先用quickprep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从PHA刺激的PBMC抽提poly(A)+RNA。用作随机引物(GIBCO-BRL)可从该mRNA制备单链DNA，3′端结合有Oligo(dC)锚。
接着用Oligo(dG)引物合成双链DNA，用超声波裂解，用T4聚合酶修复。将该物质与Uni-amp衔接子(Clontech)结合，进行琼脂糖电泳，之后抽提富含5′侧序列的300～600bp的片段。将所得片段插入到信号序列捕获载体pDREF-CD4ST(Yoshida等，FEBS Letters360155-159，1995)。该载体是含有EB病毒(EBV)复制起点的穿梭载体，在EBNA-1蛋白质的存在下能进行自我复制。另外具有的特征是在强EF-1α启动子的下游插入缺乏信号序列，编码人CD4的DNA，当编码信号序列的未知cDNA片段正好插入到两者间框架时，转染的Raji细胞表达CD4。
用插入了上述片段的载体pDREF-CD4ST转染Raji细胞，通过分选集中CD4阳性的Raji细胞，从中回收质粒。然后再次将单个质粒导入Raji细胞，通过证实CD4的表达，最后分离插入的cDNA片段，可能编码信号序列的质粒。测定插入到这些质粒中的cDNA的碱基序列，与已有的数据库相比较，以选择编码CC型趋化因子特征序列的cDNA片段。所得cDNA有可能编码所期望的新型蛋白质，用32P标记它，用作筛选PHA刺激的人PBMC来源的cDNA文库的探针，以获得全长cDNA。
cDNA文库可按照常规方法进行构建，如按照以下方法。用quickprep micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从PHA刺激的人PBMC抽提poly(A)+RNA，用寡核苷(dT)作引物，通过逆转录酶从poly(A)+RNA合成cDNA，然后插入到，如pSPORTl载体(GIBCO-BRL)。用上述部分得到的探针，用本领域技术人员熟知的任何一种方法，如重组噬菌体斑的杂交和重组大肠杆菌的克隆杂交等筛选文库。
然后测定所得重组质粒插入cDNA的碱基序列。如用下面的方法进行测序。首先，用该片段内存在的限制性酶部位切割插入片段，然后将各cDNA片段亚克隆到适当的测序载体，如pBluescript(Stratagene)。然后测定克隆片段的碱基序列，如用Sanger法(F.Sanger美国国家科学院院刊，745463-5467，1977)。II.重组型TARC蛋白质的表达将编码本发明TARC蛋白质的DNA整合到表达载体中，将所得表达载体导入适合的宿主细胞，如细菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞中，得到转化体。
适合本发明TARC DNA表达的表达载体的实例为，宿主细胞为细菌时用pRSET、pGEMEX和pKK233-2，宿主细胞为酵母时用pYES2，昆虫细胞用pVL1393，动物细胞用pEF-BOS，pSRα和pDR2等，但并不局限于此。
在大肠杆菌等原核微生物的情况下，在强启动子(例如T7启动子)的控制下，TARC DNA可作为前体蛋白质表达，前体蛋白质包括原核微生物分泌的蛋白质的天然前体物质来源的信号序列(如信号肽OMPa)和成熟型TARC蛋白质。
用酵母时，可作为这样的前体蛋白质进行表达，它包括酵母分泌的蛋白质的天然前体物质来源的序列(如外激素α的前原序列(prepro-Sequence))和成熟型TARC蛋白质。
用动物细胞的时候，可将TARC蛋白质插入到适当表达载体强启动子如，EF-1α启动子的下游，与有效的选择标记(如二氢叶酸还原酶)一起导入动物细胞(如CHO dhfr-细胞)，选择有耐药(这时用氨甲蝶呤)性的细胞，这样可建立有高表达能力的细胞株。
用人细胞的时候，将TARC蛋白质基因整合到病毒或逆转录病毒，用重组病毒感染人细胞。在适合TARC表达的条件下培养所得转化体，转化体可产生TARC蛋白质。另外，成熟型TARC蛋白质可用众所周知的方法全部合成，如用固相法和有必要重视两个二硫键结合的存在。
因此，本发明包括上述基因工程的TARC或化学合成的TARC。III.抗TARC抗体的制备如上所述，本发明TARC特异的抗体有利于阐明与TARC相关的生理学现象，有利于与TARC活性相关异常和疾病的治疗、预防或诊断。因此，本发明还提供TARC蛋白质特异的抗体。
针对蛋白质的抗体(多克隆和单克隆)的制备方法在该技术领域是众所周知的。
例如，根据序列号1或2中所示TARC氨基酸序列的一部分，可用常规的肽合成仪合成的肽，或表达TARC的载体转化的细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞等产生的TARC蛋白质通过常规的蛋白质化学方法进行纯化后，用这些肽作抗原，免疫小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等动物，从它们的血清制备多克隆抗TARC抗体。
另外，从免疫小鼠和大鼠的脾脏或淋巴结获取细胞，与骨髓瘤细胞融合，按照Kohler和Milstein的方法[自然，256，495-497(1975)]或其改良的方法Ueda等方法[美国国家科学院院刊，79，4386-4390(1982)]制备杂交瘤，之后可从该杂交瘤生产抗TARC的单克隆抗体(单抗)制备单克隆抗体的步骤如下所示。
(a)用TARC蛋白质免疫小鼠；(b)摘除免疫小鼠的脾脏并分离脾细胞；(c)在融合促进剂的存在下(如聚乙二醇)，用上述的Kohler等的方法将分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；(d)培养在未融合的骨髓瘤细胞不能生长的选择培养基中所得到的杂交瘤；(e)用ELISA法或免疫电印迹技术选择能生产所期望抗体的杂交瘤细胞，并用有限稀释法进行克隆；(f)培养生产TARC单克隆抗体的杂交瘤细胞，并从培养物中分离单克隆抗体。(IV)TARC mRNA及TARC蛋白质的检测本发明TARC mRNA及TARC蛋白质的存在，可分别用常规的特异性mRNA检测法和蛋白质检测法进行检测。
例如可用反义RNA和cDNA作探针，通过Northern印迹分析法和原位杂交法检测mRNA。另外，在逆转录酶将mRNA转换为cDNA后，通过与合适的引物结合，用聚合酶链式反应(以下称作PCR)也可进行检测。
蛋白质的存在可用上述(III)得到的TARC特异性抗体，通过免疫沉淀法和Western印迹法进行证实。V.TARC蛋白质的免疫测定例如可用放射性同位素、过氧化酶或碱性磷酸酶等酶，或荧光色素等标记一定量的TARC，加入未标记浓度已知的TARC和血清中的抗TARC多克隆抗体或单克隆抗体进行抗原抗体竞争反应。适当变化非标记抗原的浓度后，用适宜的方法分离与抗体结合了的标记抗原和未与抗体结合的标记抗原，测定与抗体结合的标记抗原的放射活性、酶活性或荧光强度。随着非标记抗原量的增加，与抗体结合的标记抗原的量减少。这种关系可画成一标准曲线。此外，可将识别TARC蛋白质上不同表位的2种单抗中的一种固定，用上述任何一种方法标记另一种抗体，用标记抗体检测与固定抗体结合了的TARC，并定量，即也可用夹心法。
然后将上述反应系统中浓度已知的非标记抗原替换为含未知量抗原的样品，反应后，获得放射活性、酶活性或荧光强度，与标准曲线进行比较就可知样品中抗原的量即TARC蛋白质的量，因此可提供监测炎症反应和免疫反应或T细胞分化成熟的新方法。VI.TARC蛋白质趋化因子活性的证实本发明TARC蛋白质的趋化活性可这样证实，如在体外，在由介入了孔径恒定的滤器而分隔开的培养容器的一侧加入TARC，在另一侧加入目的细胞，一定时间后比较TARC存在时通过滤器孔移动到对侧的细胞数与随机移动的细胞数。另外，在体内可这样证实，动物皮下施用纯化的TARC蛋白，用组织学方法检测细胞的浸润和募集。
通过以下实施例来说明本发明。实施例1 分离编码人TARC的DNA1.人TARC cDNA的克隆(1)用植物血凝素刺激的人外周血单核细胞制备cDNA文库用GIBCO-BRL的cDNA合成系统和cDNA克隆系统，按照文献(J.Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室，纽约(1989))已有的常规方法，如下用植物血凝素(PHA)刺激的人外周血单核细胞制备cDNA文库。
首先，用quickprep Micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从PHA刺激的正常人外周血单核细胞抽提Poly(A)+RNA。用试剂盒中给予的细胞溶解液溶解PHA刺激了72小时，2×107即人外周血单核细胞。然后，加入Oligo-dT树脂，混合3分钟，在Poly(A)+RNA与Oligo-dT树脂结合之后，用TOMY离心机MRX-150(TOMY精工)12000转离心，1分钟。用高盐浓度的洗液洗涤所得沉淀物，3次，用低盐浓度的洗液洗5次，洗净后洗脱液洗脱。在洗脱液中加入0.1倍量3M醋酸钠和2倍的乙醇，-80℃冷却1小时，用TOMY离心机MRX-150(TOMY精工)在12000转离心5分钟，将沉淀的poly(A)+RNA溶解到无菌蒸馏水中。测定260nm处的吸光度，计算回收的poly(A)+RNA的量。从PHA刺激的人外周血单核细胞获得10μg的poly(A)+RNA。
然后以纯化的poly(A)+RNA为模板，按下面的方法合成cDNA。首先，以4μg poly(A)+RNA为模板，在反应缓冲液中(50mm Tris-HCl、pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，500μMdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，50μg/ml Not I引物-衔接子(GIBCO-BRL)，和2万U/m1逆转录酶SUPER SCRIPT II RT)，37℃反应1小时，合成单链DNA。NotI引物-衔接子的序列如序列表的序列号3所示。以该单链DNA为模板，在反应缓冲液(25mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM DTT，0.15mMβ-NAD+，250μm dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，65U/ml DNA连接酶，250U/ml DNA聚合酶和13U/ml Rnase H)中，16℃反应2小时，合成cDNA。然后，加入DNA聚合酶，终浓度达65U/ml，再在16℃反应5分钟，形成双链。将该双链DNA在反应缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％PEG8000，200μg/ml Sal I衔接子(GIBCO-BRL)，100U/ml T4 DNA聚合酶)中，16℃反应16个小时，以与SalI衔接子接合。SalI衔接子是序列表中序号4和5中所示DNA退火了的双链DNA。将所得cDNA插入到pSPORTl载体的NotI和SalI位点的中间，制成cDNA文库。(2)信号序列捕获用cDNA文库的制备用GIBCO-BRL的cDNA合成系统、5′RACE系统和cDNA克隆系统，参照文献(J.Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室，纽约(1989))中的常规方法，从PHA刺激的人外周血单核细胞制备mRNA 5′末端近区富集的cDNA，用以制备信号序列捕获文库。
首先，用从PHA刺激的人外周血单核细胞获得的poly(A)+RNA作模板，按以下的方法合成mRNA 5′末端近区富集的cDNA，以5mgpoly(A)+RNA作模板，用逆转录酶SUPER SCRIPT II RT(GIBCO-BRL)，在反应缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，10mM DTT，500μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，150μg随机引物(GIBCO-BRL)，2万U/ml逆转录酶SUPER SCRIPTIl RT)中，37℃反应1小时，合成单链DNA。向该反应液中加入6NNaOH，终浓度为0.4N，再在65℃反应30分钟，在模板poly(A)+RNA水解后，加入6N醋酸，终浓度为0.4N去中和混合物。然后加入等量的Tris-HCl、pH8.0饱和的酚/氯仿混合液(1∶1)，搅拌后用TOMY离心机MRX-150在12000转离心5分钟。取出其水层，加入0.2倍的3M醋酸钠、2倍乙醇，-80℃冷却1小时后，再用TOMY离心机MRX-150(TOMY精工)在12000转离心5分钟，用灭菌蒸馏水溶解沉淀物。将该单链DNA在反应缓冲液(20mM Tris-HCl、pH8.4，50mMKCl，1.5mM MgCl2，200μM dCTP，400U/ml末端脱氧核苷酸转移酶)中，37℃反应10分钟，在3′端结合上Oligo-dC层。再在70℃处理5分钟，使末端脱氧核苷酸转移酶失活。将结合有Oligo-dC层的单链DNA在反应缓冲液(25mM Tris-HCl、pH7.5，100mM KCl，5mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4、1.2mM DTT，0.15mM β-NAD+，250μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，500μg锚式引物(序列表中序号6)，65U/ml DNA连.接酶，250U/ml DNA聚合酶I和BU/ml RNASEH)中，16℃反应2小时，合成双链DNA。锚式引物用DNA合成仪(Cyclone Plus DNA synthesiser，Miligen/Biosearch)合成。合成时用Miligen/Biosearch的β-连接的β-氰乙基磷酰亚胺试剂。合成后用2ml氨水(28％，Nacalai Tesque)从柱中洗脱合成的核苷酸，之后在60℃处理5小时，脱去保护基。在脱去了保护基的核苷酸中加入10倍的正丁醇，用TOMY离心机(TOMY精工)在3000转离心10分钟，回收沉淀。将回收的核苷酸溶解到无菌水中，测定260nm处的吸光度，确定含量。
用冰冷却双链DNA，用TOMY超声波破碎仪UD-201(TOMY-精工)以最大输出量部分降解150秒钟，加入T4 DNA聚合酶，终浓度达65U/ml，在160℃反应5分钟后，在反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％PEG 8000，200μg/mlUNI-Amp衔接子，1000U/ml T4 DNA聚合酶)中，再在16℃反应16小时，与UNI-Amp衔接子结合(Clontech)。UNI-Amp衔接子是序列表中序号7和8中所示DNA的退火产物。将所得到的部分降解的双链DNA作模板，在反应缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.1％明胶，200μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，400nM UAP引物(GIBCO-BRL)，400nM UNI-Amp引物(Clontech)，100U/ml Am pliTaq DNA聚合酶I)中进行PCR反应。UAP引物和UNI-Amp引物的序列分别如序列表中序号9和10所示。用购自宝酒的Ampli Taq试剂盒在DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmor)下进行PCR。反应如下进行94℃预处理3′后，94℃45″、58℃45″、72℃2′重复30个循环，最后在72℃处理3分钟。
将这样制备的在mRNA 5′末端近区富集的cDNA插入到单独制备的pDREF-CD4ST载体(Yoshida等，FEBS Letters 360155-159，1995)SaII和XbaI位点的中间，制备信号序列捕获文库。按照如下的方法，将信号序列捕获文库导入人B细胞株Raji，通过鉴定细胞表面表达cD4的克隆，选择保持信号序列的片段。(3)信号序列捕获将上面(2)中制备的来源于PHA刺激的人外周血单核细胞，由mRNA 5′末端近区浓缩的cDNA构成的信号序列捕获cDNA文库10μg，悬浮到500μl PBS中，用电穿孔法导入1×107个Raji细胞中。用BioRad的Gene Pluser在250V电压、500μF静电容量下进行电穿孔。在潮霉素(200μg/ml)存在的条件下将导入了cDNA文库的Raji细胞培养1周，通过选择有耐药性的细胞而获得。将具有耐药性的细胞与小鼠抗人CD4抗体(OKT4，从ATCC获得)在4℃反应30分钟，洗净后再与磁珠标记的羊抗小鼠IgG抗体(Dynabeads、Dynal)在4℃反应30分钟。用磁性分选器分离磁珠标记的、细胞表面表达CD4的细胞。磁性分选进行3次，最终得到45％的细胞在细胞表面表达CD4的细胞团。
用Magic Minipreps DNA纯化系统(Promega)从细胞团回收质粒DNA，再次导入大肠杆菌DH10B。将大肠杆菌接种到LB-氨苄青霉素-琼脂板上(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂，50μg/ml氨苄青霉素/1ml蒸馏水)，37℃培养一晚上。用MagicMinipreps DNA纯化系统(Promega)从培养液中纯化质粒DNA，再次通过电穿孔法导入到悬浮于500μl PBS中的1×107个Raji细胞中。将这些Raji细胞与小鼠的抗CD4抗体(OKT4，ATCC)在4℃反应30分钟，洗净后再与FITC标记的兔抗小鼠IgG(Fab′)2抗体(购自Dako)在4℃反应30分钟。用Fac Star Plus(Becton-Dickinson)鉴定FITC标记的表达CD4的细胞。检查100个大肠杆菌的克隆，最后得到42个克隆在细胞表示诱导CD4表达。
根据Sanger法，用Pharmacia公司的Autoread Sequence试剂盒和A.L.F.II自动测序仪检测这些克隆的碱基序列。所得克隆序列与已有的数据库相比较，结果发现克隆98在推测的信号序列断裂位点9氨基酸的下游有2个连续的半胱氨酸，是一种细胞迁移性趋化因子，具有结构上与CC型趋化因子相一致的特征。(4)人TARC全长cDNA的克隆为了获得克隆98的全长cDNA，用多引物DNA标记系统(Amersham Japan)以32P标记207bp克隆98的cDNA片断，用它作探针，通过菌落杂交法筛选(1)中制备的PHA刺激的人外周血单核细胞的cDNA文库。菌落杂交法参照文献(J.Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室，纽约，(1989)).中已有的方法进行。
将含有人PHA活化的外周血单核细胞cDNA文库的大肠杆菌DH10B接种到LB-氨苄青霉素-琼脂板中(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂，50μg/ml氨苄青霉素/ml蒸馏水)，37℃培养一晚上。将平皿中生长的大肠杆菌菌落转移到尼龙膜上(Hybond-N+，Amersham Japan)，然后用SDS处理(10％SDS)，碱变性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)，洗涤(2×SSC)。用32P标记的菌落98作探针与尼龙膜进行杂交。用6×SSC(1×SSC0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)、50％甲酰胺、0.5％SDS、5倍的Denhardt’s溶液，100μg/ml鲑鱼精子作杂交溶液，在42℃杂交一晚上。用2×SSC，0.1％SDS缓冲液在室温下洗膜10分钟，用0.2×SSC、0.1％SDS缓冲液在60℃洗30分钟，洗2次，之后用X光胶片(Kodak)感光，显影，鉴定与探针进行反应的菌落，最终得到一个cDNA克隆(CloneD3A)。根据Sager法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自动测序仪测定插入到克隆D3A中的cDNA的序列，再进行下面的各种检测，结果证实，该cDNA是编码目的新型CC型趋化因子样蛋白质(TARC)的。II.人TARC的结构的确定(1)分析hTARC cDNA的碱基序列及其编码的氨基酸序列根据Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自动测序仪检测上面I.(4)中得到的克隆D3A的碱基序列。cDNA克隆D3A的碱基序列和内部不包括翻译终止密码子的开放读框的氨基酸序列如图1所示。
如图1所示，它表明插入到克隆D3A中的基因含有由94个氨基酸组成的开放阅读框，N末端有以信号肽为特征的、强疏水性氨基酸序列。这94个氨基酸形成的蛋白质的分子量为10,507。另外，根据计算，推定的信号肽切断位点在Ala-23和Ala-24间，如图1中的垂直棒所示。从该切断位点到9氨基酸下游有CC型趋化因子特征的两个连续的半胱氨酸。
此外，推测信号肽切断后，由71个氨基酸组成的推定成熟型蛋白质是分泌型蛋白质。由这71个氨基酸组成的推定的成熟型分泌型蛋白质的分子量计算为8,083，通过计算，等电点为9.7。(2)与CC型趋化因子在序列上的相似性应用FASTA和Clustal V程序，将hTARC的氨基酸序列与已知的CC型趋化因子的氨基酸序列进行比较。结果如图2所示。图2中，包括hTARC在内的所有CC型趋化因子中保存的氨基酸用粗线围着的阴影表示，而大多数的趋化因子保存的氨基酸只用阴影表示。另外，hTARC与其它CC型趋化因子的同源程度用％在右侧表示。
图2表明hTARC的成熟型分泌蛋白质的氨基酸序列属于CC型趋化因子，与RNATES、MIP-Ia、MIP-Ib、I-309、MCP-1、MCP-2、MCP-3的同源性分别为29％、26％、28％、24％、24％、24％、28％。另外还表明在所有CC型趋化因子中保存的4个半胱氨酸，在hTARC中也保存着。以上结果暗示，所得氨基酸序列是新型的人CC型趋化因子的。III.用Northern印迹分析法分析hTARC mRNA的表达从各种人组织分离poly(A)+RNA 2μg，经过琼脂糖凝胶电泳，转移到尼龙膜上(多组织印迹)，从Clonetech公司购入该产品。另外，用PHA刺激人外周血单核细胞，0、4、24和72小时后，用quickprepmicro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从中抽提poly(A)+RNA。将分离的poly(A)+RNA 1μg进行琼脂糖凝胶电泳，胶中含0.66M甲醛，转移到尼龙膜上(Hybond-N+)(Amersham Japan)。用多引物DNA标记系统(Amersham Japan)以32P标记的hTARC cDNA克隆D3A的SmaI-Pst I片段作探针与这些膜进行杂交。杂交溶液是5×SSPE(1×SSPE为0.18M NaCl，0.01M磷酸钠、pH7.5，1mM EDTA)、50％甲酰胺、2％SDS、10×Denhardt’s溶液，100μg/ml鲑鱼精子DNA，在42℃杂交一晚。洗膜用2×SSC、0.1％SDS缓冲液，在室温洗10分钟，用0.2×SSC、0.1％在60℃洗30分钟，洗2次，之后用X光胶片(Kodak)感光，显影，进行分析。PHA刺激后的时间及TARCmRNA的表达结果如图3A所示，在各种人组织中TARC mRNA的表达如图38所示。
图3B中可看出，hTARC的mRNA在胸腺中大量表达，在肺、大肠和小肠中较少表达，而在其它组织中几乎检测不到。
这些结果提示，hTARC与其它的CC型趋化因子不同，只在胸腺组织中组成型表达，在免疫学刺激下可诱导其产生。实施例2重组人TARC在蚕细胞中的表达(1)构建在蚕细胞中表达hTARC DNA用的重组载体pVL-TARC用EcoRI和NotI同时消化实施例1中的克隆D3A，可得到0.5kb的DNA片段，该片段两端有EcoRI和NotI位点，包括从翻译起始密码子到翻译终止密码子长度的hTARC序列。将该DNA片段插入到制备重组型杆状病毒时应用的pVL1393(Invitrogen)的EcoRI位点和NotI位点之间，可得到重组载体PVL-TARC。该重组载体pVL-TARC的基因图如图4所示。(2)转化体的培养接着将重组载体pVL-TARC与具有致死性缺失、线性的AcNPVDNA同时导入sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒，用有限稀释法纯化所得的重组杆状病毒，在M.O.I.＝0.1时再感染sf9昆虫细胞，得到种病毒。在M.O.I.＝10-20时用种病毒感染Tn5B-4昆虫细胞(Invitrogen)(每150cm2培养瓶1.2×107个)，在无血清的EX-CELL 400培养基(JRHBiosciences)(每150cm2培养瓶30ml)上，27℃培养2天。(3)产物的分离和纯化回收培养上清，通过0.22μm的滤膜。向滤液中加入1/10体积的500mM MES(pH6.5)，过A缓冲液(50mM MES(pH6.5)/100mMNaCl)平衡了的1ml Resouce-S 柱(Pharmacia)。用A缓冲液冲洗含有hTARC蛋白质的柱子，然后用A缓冲液和B缓冲液(50mM MES(pH6.5)/100mM NaCl)配制的NaCl盐浓度梯度液进行洗脱。用SDS-PAGE和银染色鉴定含hTARC蛋白质的级分。SDS-PAGE的结果如图5B所示。图5B中F和H分别是FPLC级分(终了一步前的一纯化步)和HPLC级分的结果。
在含hTARC蛋白质的级分中加入终浓度为0.1％的TFA，上A缓冲液(0.1％TFA)平衡过的Cosmosil 5CA 300柱(Nacalai Tesque)，用缓冲液A和缓冲液B(0.1％TFA，60％乙腈)配成的乙腈梯度液进行洗脱。hTARC蛋白质的洗脱带如图5A所示。收集含hTARC蛋白质的级分，在真空干燥中挥发乙腈，对不含内毒素的PBS进行透析，得到纯化的终产品。用BCA试剂盒(Pierce)，以BSA作对照来测定蛋白质的浓度。从300ml培养上清中获得300μg纯化的hTARC蛋白质，表达量良好。用鲎裂解物测定(QCL-1000，Bio Whitaker)对混入的内毒素进行定量，在4pg/μg以下。用氨基酸测序仪(岛津)检测纯化hTARC蛋白质N末端的氨基酸序列，为ARGTNVGRE。如图5所示，该氨基酸序列与71个氨基酸组成的成熟分泌型蛋白质N末端的氨基酸序列一致，而71个氨基酸是从碱基序列上切断预测的信号肽后形成的。实施例3重组人TARC在大肠杆菌中的表达(1)构建在大肠杆菌中表达hTARC DNA用的载体-pGEMEX-TARC以实施例1中的克隆D3A作模板，通过PCR可获得0.2kb的DNA片段，该片段两端有NdeI和NotI位点，含有成熟型hTARC的序列，从起始密码子到终止密码子。PCR中所用的2个核苷酸序列如序列表中序号11和12所示。用购自宝酒的AmpliTaq kit，在DNA ThermalCycler(Perkin-Elmer)上进行PCR。反应以克隆D3A的DNA作模板，在反应缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.1％明胶，200μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，400μM引物和100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)进行。反应这样进行94℃预处理3分钟后，在94℃45′、55℃45″、72℃1′进行15个循环，最后在72℃处理3分钟。用NdlI和NotI同时消化反应生成物，插入到pGEMEXI(Promega)的NdeI位点和NotI位点之间，得到表达载体pGEMEX-TARC。该载体的基因图如图6所示。(2)转化体的培养用导入了表达载体pGEMEX-TARC的大肠杆菌BL21表达末端有甲硫氨酸的成熟型TARC蛋白质。大肠杆菌BL21的培养在添加了1mMIPTG的LB培养基上进行，在37℃培养3小时。(3)产物的分离、纯化将大肠杆菌悬浮到Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，1mM 2-ME，50mM NaCl，0.2mM PMSF)中，冻融5次。接着加入终浓度为10μg/ml的DNaseI、10mM的MgCl2，室温放置10分钟。在4℃、10000转、15分钟离心，用洗液(0.5％ Triton X-100，10mMEDTA)洗涤沉淀的hTARC蛋白质，洗3次，可得到部分纯化的重组型hTARC蛋白质。表示hTARC纯化的SDS-PAGE电泳结果如图7所示。图7中，S是离心后上清的结果，W1、W2、W3是用洗液洗涤离心所得沉淀物分别洗1、2、3次时的洗脱物的结果，P是含hTARC的洗净后的沉淀物的结果。实施例4分离编码小鼠TARC的DNAI.小鼠TARC基因组DNA的克隆为了获得小鼠TARC的基因组DNA，用实施例1中人TARC cDNA克隆D3A的SmaI-PstI片段作探针，用多引物DNA标记系统(Amersham Japan)以32P标记，通过斑点杂交法筛选Balb/C小鼠来源的基因组DNA文库(Clontech)。斑点杂交法按照文献(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室，纽约、(1989))的方法进行。
将Balb/C小鼠基因组DNA文库的噬菌体液和大肠杆菌LE392接种到LB平皿(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂/1L蒸馏水)，30℃培养一晚上。将平皿上生长的噬菌斑转移到尼龙膜(Hybond-N+，Amershan Japan)上，SDS处理(10％SDS)、碱变性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)、随后进行洗涤(2×SSC)。以32P标记的hTARC的cDNA克隆D3A的SnaI-PstI片段作探针，与尼龙膜进行杂交。杂交溶液为5×SSPE(1×SSPE包括0.18M NaCl，0.01M磷酸钠，pH7.5，1mM EDTA)，30％甲酰胺，2％SDS，10×Denhart’s溶液，100μg/ml鲑鱼精子DNA，在42℃杂交一晚上。洗膜用2×SSC、0.1％SDS在室温洗10分钟，2×SSC、0.1％SDS在60℃洗30分钟洗2次，之后X光胶片(Kakak)感光，显影，鉴定与探针进行反应的斑点。最后得到8个基因组克隆。
根据Sanger法，用Pharmacia公司的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自动测序仪测定其中1个克隆(Clone #3)的4234个碱基序列。可以看到有3个区域与人TARC有高度同源性。推测这3个区域为外显子，连结的碱基序列有一个由93个氨基酸组成的开读框，与人TARC具有高同源性，可达64.4％，因此可以判断该DNA是小鼠TARC的基因组DNA。II.小鼠TARC cDNA的克隆(1)由PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞制备cDNA文库由PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞制备cDNA文库，可参照文献(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室，纽约(1989))，应用GIBCO-BRL的cDNA合成系统和cDNA克隆系统，按下面的方法进行。
首先，用quickprep micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)从PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞抽提poly(A)+RNA。用给予的细胞裂解液裂解PHA24小时刺激的Balb/C小鼠脾细胞2×107个。接着加入oligo-dT树脂，混和3分钟，poly(A)+RNA结合树脂后，用TOMY离心机MRX-150(TOMY-精工)在12000转离心1分钟。用高盐浓度洗液洗所得沉淀物3次，用低盐浓度洗液洗5次，之后用洗脱液洗脱。在洗脱液中加入0.1倍量3M醋酸钠和2倍的乙醇，-80℃冷却1小时，用TOMY离心机MRX-150(TOMY精工)在12000转离心5分钟，将沉淀的poly(A)+RNA溶解到无菌蒸馏水中。测定260nm处的吸光度，计算回收的poly(A)+RNA的量。从PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞获得10μg的poly(A)+RNA。
然后以纯化的poly(A)+RNA为模板，按下面的方法合成cDNA。首先，以4μg poly(A)+RNA为模板，用逆转录酶SUPER SCRIPT II RT(GIBCO-BRL)在反应缓冲液中(50mM Tris-HCl、pH8.3，75mMKCl，3mM MgCl2，1OmM DTT，500μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，50μg/ml Not I引物-衔接子(GIBCO-BRL)，和2万U/ml逆转录酶SUPER SCRIPT II RT)，37℃反应1小时，合成单链DNA。Not I引物-启动子的序列如序列表的序列号3所示。以该单链DNA为模板，在反应缓冲液(25mM Tris-HCl、pH7.5，100nM KCl，5mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM DTT，0.15mM β-NAD+，250μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，65U/ml DNA连接酶，250U/ml DNA，聚合酶和13U/ml Rnase H)中，16℃反应2小时，合成cDNA。然后，加入DNA聚合酶，终浓度达65U/ml，再在16℃反应5分钟，形成双链。将该双链DNA在反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％ PEG 8000，200μg/ml EcoRI衔接子(GIBCO-BRL)，100U/ml T4 DNA聚合酶)中，16℃反应16个小时，以与SalI衔接子接合。EcoRI衔接子是序列表中序号13和14中所示DNA退火了的双链DNA。将所得cDNA插入到λExcell载体的NotI和EcoRI位点的中间，制成cDNA文库。(2)探针的制备以上面(1)中制备的由PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞而来的cDNA文库作模板，在反应缓冲液中(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl2，0.1％明胶，200μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，400nM mG98外显子上游引物，400nM mG98外显子下游引物，100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)中进行聚合酶链式反应。mG98外显子上游引物和mG98外显子下游引物是在上面1中所得小鼠基因组DNA的基础上设计的。这些引物的序列分别在序列表的序列号15和16中表示。mG98外显子上游引物和mG98外显子下游引物用DNA合成仪(Cyclone Plus DNA Synthesizer，Miligen/Biosearch)合成。合成时用Miligen/Biosearch公司的β-联接的β-氰乙基磷酰亚胺试剂进行。合成后用2ml氨水(28％，Nacalai Tesque)从柱中洗脱合成的核苷酸，之后在60℃处理5小时，脱去保护基。在脱去保护基的核苷酸中加入10倍的正丁醇，用TOMY离心机(TOMY精工)在3000转离心10分钟，回收沉淀。将回收的核苷酸溶解到无菌水中，测定260nm处的吸光度，确定含量。
用购自宝酒造的Ampli Taq试剂盒在DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmor)下进行PCR。反应如下进行94℃预处理3′后，94℃45″、60℃45″、72℃1′重复40个循环，最后在72℃处理3分钟。所得321bp的DNA片段用作探针以获取小鼠TARC的全长cDNA。(3)小鼠TARC全长cDNA的克隆为了获得小鼠TARC的全长cDNA，用多引物DNA标记系统(Amersham Japan)以32P标记上面(2)中得到的321bp的cDNA片断，用它作探针，通过菌落杂交法筛选(1)中制备的PHA刺激的Balb/C小鼠脾细胞的cDNA文库。菌落杂交法参照文献(J.Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室，纽约，(1989))。中己有的方法进行。
将PHA刺激Balb/C小鼠脾细胞而来的cDNA文库的噬菌体液和大肠杆菌LE392接种到LB平皿(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，15g琼脂/1L蒸馏水)，30℃培养一晚上。将平皿上全长的噬菌斑转移到尼龙膜上(Hybond-N+，Amersham Japan)，然后用SDS处理(10％SDS)，碱变性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)，洗涤(2×SSC)。用32P标记的321bp的DNA片段作探针与尼龙膜进行杂交。用5×SSPE(1×SSPE0.18M NaCl，0.01M磷酸钠、pH7.5，1mM EDTA)、50％甲酰胺、2％SDS、10倍的Denhardt’s溶液，100μg/ml鲑鱼精子作杂交溶液，在42℃杂交一晚上。用2×SSC，0.1％SDS缓冲液在室温下洗膜10分钟，用0.2×SSC、0.1％SDS 缓冲液在60℃洗30分钟，洗2次，之后用X光胶片(Kodak)感光，显影，鉴定与探针进行反应的菌落，最终得到一个cDNA克隆(Clone#1)。根据Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自动测序仪测定插入到克隆#1中的cDNA的序列，再进行下面的各种检测，结果证实，该cDNA是编码目的新型CC型趋化因子样蛋白质(mTARC)的。II.小鼠TARC的结构的确定(1)分析mTARC cDNA的碱基序列及其编码的氨基酸序列(根据Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自动测序仪检测上面I.(4)中得到的克隆D3A的碱基序列。)上面II(3)中得到的小鼠cDNA克隆#1的碱基序列和内部不包括翻译终止密码子的开读框的氨基酸序列如图8所示。
如图8所示，它表明插入到克隆#1中的基因含有由93个氨基酸组成的开读框，N末端有以信号肽为特征的、强疏水性氨基酸序列。这93个氨基酸形成的蛋白质的分子量为10,466。另外，根据计算，推定的信号肽切断位点在Ala-23和Ala-24间，如图8中的垂直棒所示。从该切断位点到9氨基酸下游有CC型趋化因子特征的两个连续的半胱氨酸。
此外，推测信号肽切断后，由70个氨基酸组成的推定成熟型蛋白质是分泌型蛋白质。由这70个氨基酸组成的推定的成熟型分泌型蛋白质的分子量计算为7916，通过计算，等电点为10.2。(2)与人TARC的相似性可以证明成熟型分泌小鼠TARC蛋白质的氨基酸序列与人TARC有65％的同源性。另外证明小鼠TARC开放阅读框的碱基序列与人TARC有70％的同源性。证明在所有CC型趋化因子中保存的4个半胱氨酸在小鼠TARC中也保存着。这些结果暗示小鼠TARC是人TARC的小鼠同源基因和蛋白质。实施例5重组小鼠TARC在蚕细胞中的表达(1)构建在蚕细胞中表达hTARC DNA用的重组载体pVL-mTARC用EcoRI和NotI同时消化Clone#1，可得到0.5kb的DNA片段，该片段两端有EcoRI和NotI位点，包括从翻译起始密码子到翻译终止密码子长度的mTARC序列。将该DNA片段插入到制备重组型杆状病毒时应用的pVL1393(Invitrogen)的EcoRI位点和NotI位点之间，可得到重组载体pVL-mTARC。该重组载体pVL-TARC的基因图如图9所示。(2)转化体的培养接着将重组载体pVL-mTARC与具有致死性缺失、线性的AcNPVDNA同时导入sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒，用有限稀释法纯化所得的重组杆状病毒，在M.O.I.＝0.1时再感染sf9昆虫细胞，得到种病毒。在M.O.I.＝10-20时用种病毒感染Tn5B-4昆虫细胞(Invitrogen)(每150cm2培养瓶1.2×107个)，在无血清的EX-CELL 400培养基(JRHBiosciences)(每150cm2培养瓶30ml)上，27℃培养2天。(3)产物的分离和纯化回收培养上清，通过0.22μm的滤膜。向滤液中加入1/10体积的500mM MES(pH6.5)，过A缓冲液(50mM MES(pH6.5)/100mMNaCl)平衡了的1ml Resouce-S柱(Pharmacia)。用A缓冲液冲洗给含有mTARC蛋白质的柱子，然后用A缓冲液和B缓冲液(50mM MES(pH6.5)/100mM NaCl)配制的NaCl盐浓度梯度液进行洗脱。用SDS-PAGE和银染色鉴定含mTARC蛋白质的级分。SDS-PAGE的结果如图10B所示。图10B中F和H分别是FPLC级分(终了一步前的一个纯化步骤)和HPLC级分的结果。
在含mTARC蛋白质的级分中加入终浓度为0.1％的TFA，上A缓冲液(0.1％TFA)平衡过的Cosmosil 5CA 300柱(Nacalai Tesque)，用缓冲液A和缓冲液B(0.1％TFA，60％乙腈)配成的乙腈梯度液进行洗脱。mTARC蛋白质的洗脱带如图10A所示。收集含mTARC蛋白质的级分，在真空干燥中挥发乙腈，对不含内毒素的PBS进行透析，得到纯化的终产品。用BCA试剂盒(Pierce)，以BSA作对照来测定蛋白质的浓度。从300ml培养上清中获得168μg纯化的mTARC蛋白质，表达量良好。用鲎裂解物测定(QCL-1000，Bio Whitaker)对混入的内毒素进行定量，在2pg/μg以下。用氨基酸测序仪(岛津)检测纯化hTARC蛋白质N末端的氨基酸序列，为ARATNVGRE**LDYF。如图10所示，该氨基酸序列与70个氨基酸组成的成熟分泌型蛋白质N末端的氨基酸序列一致，而70个氨基酸是从碱基序列上切断预测的信号肽后形成的。实施例6由小鼠TARC诱导白细胞浸润在小鼠皮下施用实施例5中的小鼠TARC诱导白细胞浸润。
将纯化的小鼠TARC蛋白质在Balb/C小鼠背部皮内施用，通过检查有无白细胞浸润来证实mTARC的趋化因子样活性。具体地讲，将小鼠TARC的纯品50ng溶解到不含内毒素的PBS中，达50μl，在Balb/C小鼠的背部皮内施用。用50μl不含内毒素的PBS作阴性对照。施用后4、24小时后，脱颈椎处死小鼠，切下施用部位的皮肤，用10％甲醛固定。其后，用石蜡包埋固定的皮肤，用切片机制备5μm厚的切片，用苏木精-伊红染色。图11为mTARC的结果，图12为对照的结果。图11和12中，A为施用24小时后显微镜照片的100倍，B为400倍。如图11A和B所示，施用了小鼠TARC的皮下组织中，在施用TARC 24小时后可看到淋巴细胞和单核细胞的浸润。而如图12A和12B中所显示的只施用PBS则看不到这种变化。实施例7检测表达TARC受体的细胞用碘标记的人TARC检测表达TARC受体的细胞。用125I标记Bolton-Hunter试剂(Amersham Japan)以125I标记实施例2中在昆虫细胞表达的纯化的人TARC蛋白质。用Bio-Gel96(Bio-Rad)过滤125I标记的hTARC，求得比活性为81.6μCi/μg。用标记的hTARC进行与各种细胞的结合试验。
用结合缓冲液(PRMI 1640、20mM HEPES(pH7.4)、1％BSA、0.02％NaN3)洗涤1×106～8×106个被检测细胞，之后悬浮到100μl的结合缓冲液中。向该细胞悬液中加入100μl的结合缓冲液，使加入的125I标记的hTARC终浓度为0.66nM，室温结合1小时。结合反应完成后将反应液重铺到300μl的邻苯二甲酸二丁基酯橄榄油(4∶1)溶液上，通过离心分离与细胞结合了的125I标记的TARC和未结合的125I标记的TARC，然后用γ计数仪测定与细胞结合的125I标记的TARC的放射量。从不存在非标记TARC的情况下结合的125I标记TARC的值减去200nM非标记hTARC存在下非特异结合的125I标记TARC的值，可得到与人TARC细胞的特异性结合。图13是每106个不同种类的细胞125I标记TARC的特异结合。
图13表明，在一部分T细胞株(Jurkat，Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102)、外周血淋巴细胞、活化的外周血T细胞中可看到相当特异的结合。在其它T细胞株(Molt4、HPB-ALL、TCL-Kan、TLOml)单核细胞株(U937、THPl)、或红细胞株(K562)、外周血单核细胞中很难看到特异性结合。在B细胞株(Raji)、胎儿肾脏来源的细胞株(293E)、外周血颗粒细胞中几乎看不到特异性结合。
以上结果显示，TARC受体可在某种T细胞上大量表达。实施例8 TARC与受体的结合特性用T细胞株Jurkat更详细地分析TARC受体。(1)结合常数和受体数为了求出结合常数和受体数，检测能达到结合平衡的条件，结果证明125I标记的人TARC与Jurkat细胞的特异结合在15℃、1小时达到平衡。因此通过125I标记TARC浓度的变化，检测与4×106个Jurkat细胞特异结合量的变化。特异性结合量可用不存在非标记TARC的条件下结合的125I标记TARC的值减去存在1μM非标记TARC的条件下非特异结合的125I标记TARC的值来求出。其结果如图14A所示，125I标记的TARC与Jurkat细胞的特异结合用饱和曲线描绘。用Scatehard分析的结果如图14B所示。Jurkat细胞上与125I标记TARC的特异性结合位点是1种，根据计算，结合常数为2.1nM，每个细胞的结合数为603。
接着，将125I标记TARC的浓度固定在2nM，通过变化非标记TARC的浓度来检测与4×106个Jurkat细胞特异性结合量的变化。特异性结合量可通过各种浓度非标记TARC存在的条件下结合的125I标记TARC的值减去1μM非标记TARC存在的条件下非特异结合的125I标记TARC的值而求出，非标记TARC不存在的条件下特异性结合量以100％计算。结果如图15A所示。Scatchard分析的结果为Jurkat细胞上125I标记TARC的特异性结合位点是1种，根据计算，结合常数为2.1nM，每1个细胞的结合数为948。(2)其它CC型趋化因子的结合抑制检查TARC与Jurkat细胞的结合是否与其它的趋化因子间存在竞争。125I标记hTARC的浓度为0.66nM，不存在非标记趋化因子的条件下或存在200nM IL-8、RANTES、MCP-1、MCP-1α、(全部购自PreproTech)或TARC的情况下在室温下与4×106个Jurkat细胞结合1小时。结果如图15B所示。可以看到，125I标记TARC的结合只在非标记TARC存在的情况下受到竞争抑制，而其它的趋化因子不抑制结合。因此，这些表明Jurkat细胞上的TARC受体与其它趋化因子的受体不同，是一种独立的受体。(3)与红细胞上受体的结合活性。
已知红细胞上存在各种趋化因子可结合的受体-Dutty抗原/趋化因子受体(Duffy Antigen/receptor for chemokine(DARC))。固定125I标记TARC的浓度为0.66nM，变化非标记的其它趋化因子IL-8、RANTES、MCP-1、MCP-1α或TARC的浓度，检测与108个红细胞特异结合量的变化。特异结合量可用存在各种浓度非标记趋化因子的条件下结合的125I标记TARC值减去存在1μM非标记TARC的情况下非特异结合的125I标记TARC值求出，不存在非标记TARC的情况下特异的结合量以100％计算。结果如图16所示。可以看到125I标记TARC的结合受到非标记TARC、IL-8、RANTES、MCP-1等竞争抑制，而MCP-1α几乎不发生竞争抑制。Scatchard分析的结果如图17所示。红细胞上125I标记TARC的特异性结合位点为1种，根据计算，结合常数为17nM。TARC的结合常数及竞争抑制模式与其它的趋化因子如IL-8的DARC的结合常数及竞争抑制模式相同，由此表明TARC与红细胞上的DARC结合。实施例9TARC的免疫测定(1)制备谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和TARC的融合蛋白用表达该融合蛋白的载体pGEX-TARC制备谷胱甘肽-S-转移(GST)和TARC的融合蛋白。
以实施例1中克隆D3A作模板，通过PCR可获得一个0.2kb的DNA片段，该片段两端有BamHI和NotI位点，含有成熟型TARC从起始密码子到终止密码子的序列。PCR中所用的两个寡核苷酸序列如序列表中序列号17和18中表示。用购自宝酒的AmpliTaq kit，在DNA ThermalCycler(Perkin-Elmer)上进行PCR。反应中以克隆D3A的DNA作模板，在反应缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM NaCl，1.5mMMgCl2，0.1％明胶，200μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，400μM引物，和100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)中进行。反应这样进行94℃预处理3分钟，在94℃45″、55℃45″、72℃1′为1循环重复进行15个循环，最后在72℃处理3′。用BamHI和NotI同时消化反应生成物，插入到pGEX4T-3(pharmacia)的Bam HI位点和NotI位点之间，得到表达载体pGEX-TARC。
用导入了表达载体pGEX-TARC的大肠杆菌表达氨基酸末端添加了GST的成熟型TARC蛋白质。在加入了终浓度为0.1mM IPTG、含0.2％葡萄糖的2×YT培养基中，37℃培养大肠杆菌JM109 4小时。随后将大肠杆菌悬浮到STE缓冲液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mMEDTA，100mM NaCl，1mM PMSF，100μg/ml溶菌酶)，冰上放置15分钟。接着加入终浓度为5mM的DTT、1.4％的N-月桂酰肌氨酸钠，在冰上冷却，用TOMY超声波破碎仪UD-210(TOMY-精工)以最大功率处理300秒。以10,000转、5分钟，4℃的条件离心，在上清中加入终浓度为2.5％的TritonX-100，之后加入谷胱甘肽Sepharose 4B树脂，4℃进行一晚上结合反应。用PBS冲洗与GST-TARC融合蛋白结合的树脂，洗5次，然后加入与树脂等体积的含1％SDS的PBS，在100℃处理5分钟，释放GST-TARC融合蛋白。在所得GST-TARC融合蛋白质溶液中加入9倍体积的PBS，用作抗原。(2)抗TARC抗体的制备使用豚鼠，将100μg的GST-TARC融合蛋白质与等体积的完全弗氏佐剂混合，然后施用到豚鼠皮下来制备抗体。每2周进行一次增强免疫，将100μg GST-TARC融合蛋白质与等体积的完全弗氏佐剂混合，之后皮下施用。共免疫3次，收集血清。(3)抗TARC抗体的纯化和标记用以下方法制备生物素化的抗TARC抗体。向Affi-Gel 15树脂(BioRad)中加入3倍体积的纯化GST-TARC融合蛋白质或GST蛋白质溶液，4℃放置一晚上。除去蛋白质溶液后，向树脂中加入封闭液(10mM乙醇胺、pH8.0)，4℃放置1小时。用20倍体积的PBS冲洗树脂，然后加入结合缓冲液(20mM Tris-HCl、pH7.2，0.5MNaCl)。在所得血清中加入等体积的饱和硫铵，4℃放置1晚后，在12000转，20分钟、4℃的条件下离心。向所得沉淀物中加入PBS溶解，对结合缓冲液进行透析，首先置于GST蛋白质结合树脂中，室温放置2小时，除去抗GST的抗体。所得流过溶液置于GST-TARC融合蛋白质结合树脂中，4℃放置1晚上，用20倍体积的结合缓冲液洗涤树脂，用0.1M甘氨酸洗脱抗TARC的抗体。向该抗体溶液中加入1MTris-HCl、pH9.5、对0.1M NaHCO3进行透析，加入NHS-LC-Biotin(Pierce)，4℃放置2.5小时。将该生物素化的抗体对50mM Tris-HCl、pH7.5进行透析，然后用PBS透析。
固相抗TARC抗体的纯化如下进行。向抗血清中加入终浓度为100mM的Tris-HCl、pH8.0，上Hitrap-protein柱，用柱子10倍体积的100mM Tris-HCl、pH8.0洗柱，接着用10倍体积的100mM Tris-HCl、pH8.0洗柱。用0.1M甘氨酸洗脱结合的抗体，加入1M Tris-HCl、pH9.5后对PBS进行透析。II.TARC蛋白质的免疫测定TARC蛋白质的定量按以下所谓夹心法(三明治法)进行，用生物素化抗体确定与固相抗体结合的TARC的量。首先用50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液将待固定抗体溶解为10μg/ml，96孔板(Maxisorb，Nunc)每孔中加入50μl，4℃放置1晚。去除抗体溶液后，加入100μl含1mg/mlBSA的PBS，室温放置1小时，用含0.02％Tween-20的PBS洗1次。将Triton X-100以终浓度0.5％加到昆虫细胞中表达的浓度已知的纯化重组人TARC中或加到含有未知量抗原的试样中，然后每孔加入50μl，室温放置1小时，用Tx-PBS溶液(0.5％Triton X-100)洗3次，然后用Tx-PBS溶液将生物素化抗TARC抗体稀释1000倍，每孔加入50μl，室温放置30分钟。用Tx-PBS洗液洗3次后，用Tx-PBS溶液将过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白(Vector)稀释400倍，每孔加入50μl，室温放置30分钟。用Tx-PBS溶液洗3次，用PBS洗1次后，加入底物溶液(100mM NaOAc、pH5.5，1mM EDTA，6.72mg/ml，TMBZ，0.03％H2O2)100μl，进行显色反应。加入50μl 1N H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度。接着用浓度已知的重组人TARC作标准曲线，根据标准曲线可知道样品中TARC蛋白质的量。检测灵敏度为50pg/ml。实施例10 具有TARC诱导活性的物质(1)鉴定诱导TARC蛋白质的刺激将正常人外周血单核细胞加入到96孔板(Coaster)，每孔加入2.5×105个，不加刺激物质或将刺激物PHA(GIBCO-BRL)作100倍稀释，加入终浓度为10μg/ml的抗CD3抗体(OKT3)或LPS(L4391、Sigma)100ng/ml，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培养。培养6、12、24、36、48、72小时后回收培养液，用0.45μm的滤器过滤，用所得滤液进行TARC蛋白质的定量。结果如图21所示，如图21所示，TARC蛋白质在PHA、抗CD3抗体的刺激下时间依赖性的表达，在72小时时表达量直线增加。PHA刺激12小时、抗CD3抗体刺激24小时可检测出表达，PHA以16ng/ml、抗CD3抗体以2.5ng/ml刺激72小时可表达。LPS和不刺激时几乎检测不到表达。(2)能诱导TARC蛋白质的细胞因子的鉴定由于PHA比抗CD3抗体有更强的诱导TARC表达的作用，所以认为诱导与细胞因子相关。
将正常人外周血单核细胞加到96孔板(Coaster)，每孔加入2.5×105个细胞，不加细胞因子或加入下列细胞因子10ng/ml IL-1α(R&D)、100U/ml IL-2，(Sionogi制药公司)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、50ng/ml(PeproTech)、50ng/ml IL-7(PeproTech)、50ng/ml IL-10(Genzyme)、10ng/ml GM-CSF(Genzyme)、50ng/mlTNFα(Pepro Tech)、1000U/ml IFN-γ(Sionogi制药公司)、10ng/mlM-CSF(R&D)，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培养。培养48小时后回收培养液，用0.45μm滤器进行过滤，用所得溶液进行TARC蛋白质的定量。其结果如图22所示。如图22所示，GM-CSF、IL-3、IL-4能诱导TARC蛋白质表达，表达量分别为12、6、2ng/ml。
同样检测GM-CSF、IL-3、IL-4的浓度依赖性。结果如图23所示。如图23所示，GM-CSF的ED50为0.7ng/ml，表达最大达3.3ng/ml，在更高的浓度下反而不诱导表达。描绘IL-3、IL-4的饱和曲线，ED50为0.5、0.8ng/ml。
以上结果显示，TARC的表达与TNF-α、IPN-γ诱导的大多数趋化因子的表达相比，极具有特征。实施例11 表达TARC蛋白质的细胞的鉴定(1)为了鉴定表达TARC的细胞，将正常人外周血单核细胞分为CD14阳性单核细胞和CD14阴性淋巴细胞，用PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4进行刺激。将浓度为2×107/ml的正常人外周血单核细胞悬浮到冰冷的分离缓冲液(5mM EDTA、1％FCS、PBS)中，加入1/450量的FITC标记的抗CD14抗体(Becton-Dickinson)，在冰上放置30分钟。用分离缓冲液洗涤，以107细胞/80ml的终浓度悬浮到分离缓冲液中，加入20μl含107细胞的磁珠标记的抗小鼠IgG抗体(Miltenyi-Biotec)，4℃放置15分钟。用分离缓冲液洗涤，悬浮到500μl分离缓冲液中，用NACS(Miltoyi-Biotec)分离CD14阳性单核细胞和CD14阴性淋巴细胞。在96孔板(Coaster的每孔中加入正常人外周血单核细胞和2.5×105个CD14阴性淋巴细胞、1.8×105个CD14阳性单核细胞，不进行刺激或加入刺激物100倍稀释的PHA(GIBCO-BRL)、100倍稀释的PHA(GIBCO-BRL)和50ng/mlPMA、50ng/ml IL-4(PeproTech)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、10gn/mlGM-CSF(Genzyme)，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培养。培养48小时后回收培养液，用0.45μM的滤器过滤，用所得滤液进行TARC蛋白质的定量。其结果如图24所示。如图24中的图所示，GM-CSF、IL-3、IL-4只刺激单核细胞分泌TARC。相反，PHA、PHA/PMA只刺激淋巴细胞表达，PHA的刺激诱导表达，在加入PMA后受到显著抑制。(2)用Northern印迹分析法分析TARC mRNA的表达不刺激或用100倍稀释了的PHA(GIBCO-BRL)、100ng/ml LPS(L4391、Sigma、10ng/ml IL-4(PeproTech)、10ng/ml IL-3(Genzyme)、4ng/ml GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血单核细胞，24小时后，用TRIZOL RNA纯化试剂盒(GIBCO-BRL)抽提RNA。将所得5μg RNA进行含0.66M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶电泳，转移到尼龙膜(Hybond-N+)(Amershan Japan)上。用多引物DNA标记系统(Amersham Japan)以32P标记TARC cDNA克隆B3A的SmaI-PstI片段，以它作探针与尼龙膜进行杂交。杂交溶液用QuickHyb液(Stratagene)、100μg/ml的鲑鱼精子DNA，在68℃杂交1.5小时。用2×SSC，0.1％SDS缓冲液室温洗膜10分钟，0.2×SSC、0.1％SDS缓冲液于55℃洗膜30分钟，洗2次，之后将X光胶片(Kodak)感光，显像分析。从图25的结果可以看出，没有刺激或在LPS刺激下人外周血单核细胞几乎不表达TARC的mRNA，但GM-CSF、IL-3的刺激约能诱导400倍的表达，IL-4、PHA的刺激约能诱导40倍的表达。
以上结果表明，GM-CSF、IL-3、IL-4刺激外周血单核细胞表达TARC，不是通过促进分泌颗粒释放蓄积的蛋白质，而是主要通过增加mRNA实现的。实施例12 来源于人PBMC的TARC对T细胞的迁移活性用以下方法检测细胞因子刺激下从正常人外周血单核细胞分泌的TARC对T细胞的迁移活性。
用48孔趋化性盒(chemotaxis chamber，Neuro Probe)测定细胞迁移活性。不刺激或用在50ng/ml IL-4(PeproTech)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、10ng/ml GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血单核细胞，36小时后回收培养液，用0.45μm的滤器过滤，用所得滤液测定细胞迁移活性。培养滤液加在下孔，而将悬浮在缓冲液(RPMI-1640、20nM Hepes(pH7.4)、1％BSA)中的4×105个T细胞株HUT78加到上孔。用IV型胶原溶液(5μg/ml水溶液)室温下包被1小时的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(孔径5μm，Neuro Probe)隔离上下孔。37℃培养2小时后，取下膜，用PBS冲洗上侧，固定，染色。
用放大800倍的显微镜，从每孔随机选择5个视野来测定迁移细胞的数目。结果如图26所示。如图26的图所示，IL-3和GM-CSF刺激的培养液能引起HUT78细胞很强的迁移，不刺激或IL-4刺激的培养液未引起迁移。
此外，当用10μg/ml豚鼠抗TARC抗体(TARC Ab)处理GM-CSF刺激的培养上清时，其对HUT78细胞的迁移活性几乎消失。
这些结果提示具有迁移活性的TARC是在细胞因子的刺激下从单核细胞分泌的。实施例13 细胞因子抑制TARC的表达由于与诱导体液免疫相关的Th2型细胞因子IL-4能诱导TARC的表达，因此研究了抑制Th2诱导的Th1型细胞因子IFN-γ、抑制全身免疫反应的细胞因子IL-10对TARC表达诱导的影响。将正常人外周血单核细胞加到96孔板(Coaster)，每孔加2.5×105个，加入细胞因子10ng/ml IL-4(PeproTech)、10ng/ml IL-3(Genzyme)、5ng/mlGM-CSF(Genzyme)，再在存在50ng/ml IL-10(Genzyme)或1000U/ml IFN-γ(Sionogi制药公司)的250μl RPMI-1640/10％FCS中培养。48小时后回收培养液，用0.45μm滤器过滤，用所得滤液进行TARC蛋白质的定量。结果如图27所示。如图27中的图所示，GM-USF、IL-3、IL-4的刺激能诱导外周血单核细胞表达TARC，这种作用被IFN-γ、IL-10所抑制。因此我们认为诱导体液免疫的刺激能诱导TARC的分泌，诱导细胞免疫的状态下抑制其分泌。实施例14 TARC对表达CCR4的293/EBNA-1细胞的结合活性用TARC与分泌的碱性磷酸酶(SEAP)-(组氨酸)6的融合蛋白探讨TARC与293/EBNA-1细胞表示表达的CCR4受体的结合活性。(1)制备融合蛋白质(TARC-SEAP)表达TARC与SEAP的融合蛋白的载体-PDREF-SEAP(His)6如图28所示。首先说明制备该载体的方法。以Clontech公司的质粒pSEAP-EnHancer作模板，用5′-XbaI-AP引物(序列号19)和3′-AP(His)6-NotI引物(序列号20)通过PCR扩增六个组氨酸联结的序列-(His)6部分的编码区域，用限制性酶XbaI和NotI裂解所得PCR产物，导入到pDREF-Hyg(Yoshida等，FEBS Letters 360155-159，1995)的XbaI和NotI位点之间，制备pDREF-SEAP(His)6。
接着，如图28所示，在pDREF-SEAP(His)6载体的SalI和XbaI位点之间插入TARC cDNA的ORF，制备载体-PDREF-TARC-SEAP(His)6，它能编码TARC与介入了5个氨基酸形成的接头(Ser-Arg-Ser-Ser-Gly)的SEAP-(His)6形成的融合蛋白。下面说明该载体的制作方法。
以编码TARC碱基序列的TARC cDNA作模板，用TY98F引物(序列号3)和TY98R引物(序列号4)进行PCR扩增，用限制性酶SalI和XbaI裂解所得PCR产物，之后导入到pDREF-SEAP(His)6的SalI和XbaI位点之间，制成pDREF-TARC-SEAP(His)6。通过lipofetamin(Gibco-BRL)将该载体导入293/EBNA-1细胞(Inviterogen)。培养3-4天后，回收培养上清，通过0.45μm孔径的滤器，加入20mM HEPES(pH7.4)和0.02％叠氮钠，4℃保存。(2)融合蛋白质的(TARC-SEAP)的测定用夹心型酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)分析所产生的融合蛋白(TARC-SEAP)。
即用单克隆型抗胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase)(anti-PLAP)(Medix Biotech)(2mg/ml，50mM Tris-HCl，pH9.5)铺盖96孔微量试验板(Maxsorb)(Nunc)，用牛血清白蛋白(BSA)(1mg/ml，磷酸缓冲盐溶液)封闭。用稀释液(含0.02％Tween-20的PBS)稀释样品，加到微量板中，室温反应1小时后，用稀释液洗涤，然后加入500倍稀释了的生物素化的兔抗PLAP抗体，反应1小时。再洗涤后，加入过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白(Vector)，反应30分钟。洗涤后用3.3′-5.5′-四甲基联苯胺检测结合的过氧化酶活性。用1N H2SO4终止反应，测定450nm的吸光度。
用化学发光法，使用Great EscApe Detection Kit(Clontech)测定碱性磷酸酶活性)，求出相对光单位(RLU)。用纯化PLAP(CosmoBio)制作AP标准曲线。当使用的SEAP和TARC-SEAP为1pmol时，分别为8.7×107RLU/s和1.2×108RLU/S。(3)制备表达CCR4的293/EBNA-1细胞以人胎盘基因组DNA(Clontech)作模板，用CKR4-XbaF引物(序列号23)和CKR4-XbaR引物(序列号24)通过PCR扩增编码CCR4的区域，用限制性酶XbaI裂解所得引物后，导入Pbluescript SK+(Stratagene)的XbaI位点。用SalI和NotI从所得质粒裂解编码CCR4的区域后，导入PDREF-Hyg(Yoshida等，FEBS Letters 360155-159，1995)的SaII和NotI位点之间，制备pDREF-CCR4。用Lipofectamine(Gibco-BRL)将该质粒导入293/EBNA-1细胞(Invitrogen)。在潮霉素(200μg/ml)存在的条件下培养导入了CCR4的293/EBNA-1细胞，培养1周，选择具有耐药性的细胞。(4)TARC-SEAP融合蛋白与表达CCR4的293/EBNA-1细胞的特异性结合。
将TARC-SEAP的浓度固定在1nM，变化非标记TARC的浓度，观测与表达CCR4的293/EBNA-1细胞的特异性结合量的变化。结合实验在含20mM HEPES(pH7.4)，1％BSA，0.02％叠氮化钠的RPMI-1640 200μl中进行。竞争性结合实验为向4×105个细胞中加入1nM的TARC-SEAP和各种浓度的非标记TARC，室温反应1小时，洗涤后，用含50μl 1％/Triton X-100的10nM Tris-HCl(pH8.0)溶解细胞，在65℃处理10分钟灭活细胞来源的磷酸酶，离心后，测定25μl上清中的AP活性。用1nM SEAP测定非特异性结合。用各种浓度的非标记TARC存在时结合的TARC-SEAP的值，减去非特异结合的SEAP的值求出的特异性结合量，非标记TARC不存在时的特异性结合量以100％计算。结果如图29所示。代表结合强度的50％抑制浓度为3nM，由此可知TARC与CCR4很强地结合。(5)其它趋化因子对TARC-SEAP融合蛋白与表达CCR4的293/EBNA-1细胞特异性结合的影响。
探讨TARC与表达CCR4的293/EBNA-1细胞的特异性结合是否与其它的趋化因子发生竞争。
将TARC-SEAP的浓度固定在1nM，不存在非标记趋化因子或存在200nM MCP-1、PANTES、MIP-1α、MIP-1β(全部为PeproTech产品)、LARC或TARC的条件下，与4×105个表达CCR4的293/EBNA-1细胞结合，室温下结合1小时。结果如图30所示。可以看出TARC-SEAP的结合只被非标记TARC竞争抑制，而其它的趋化因子不抑制结合。该结果表明CCR4是一受体，它只与TARC进行强烈结合，而不与其它趋化因子进行强结合。实施例15 hTARC对表达CCR4的293/EBNA-1细胞的迁移活性应用48孔趋化性小室(chemotaxis chamber，Neuro Probe)测定人TARC对表达CCR4的293/EBNA-1细胞的迁移活性。参照实施例2，用缓冲液(RPMI-1640、20mM Hepes(pH7.4)、1％BSA)稀释昆虫细胞中表达的纯化重组人TARC，加入下孔，将1×105个表达CCR4的293/EBNA-1细胞加入上孔。用IV型胶原溶液(20μg/ml)37℃包被了4小时的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(孔径8μm，Neuro Probe)隔离上下孔。37℃培养4小时后，取出膜，用PBS洗涤上侧，固定、染色。
在放大400倍的显微镜下，每孔随机选择5个视野(HPF)测定迁移细胞数。结果如图31所示。如图31中图显示的，表达CCR4的293/EBNA-1细胞的迁移对TARC有浓度依赖性。纵轴上的四角箭头表示不加TARC的对照结果。而与TARC不同的其它趋化因子RANTES和MIP-1α对表达CCR4的293/EBNA-1细胞没有明显的迁移活性。
序列表序列号1序列长度582序列类型核酸链型双链拓扑学线性序列种类cDNA到mRNA来源生物名人序列特征表示特征的记号CDS位点53..334特征决定方法S序列CCCTGAGCAG AGGGACCTGC ACACAGAGAC TCCCTCCTGG GCTCCTGGCA CC ATG GCC58Met Ala1CCA CTG AAG ATG CTG GCC CTG GTC ACC CTC CTC CTG GGG GCT TCT CTG 106Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu5 10 15CAG CAC ATC CAC GCA GCT CGA GGG ACC AAT GTG GGC CGG GAG TGC TGC 154Gln His Ile His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys20 25 30CTG GAG TAC TTC AAG GGA GCC ATT CCC CTT AGA AAG CTG AAG ACG TGG 202Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp35 40 45 50TAC CAG ACA TCT GAG GAC TGC TCC AGG GAT GCC ATC GTT TTT GTA ACT 250Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr
55 60 65GTG CAG GGC AGG GCC ATC TGT TCG GAC CCC AAC AAC AAG AGA GTG AAG298Val Gln Gly Arg Ala Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys70 75 80AAT GCA GTT AAA TAC CTG CAA AGC CTT GAG AGG TCT TGA AG CCTCCTCACC 349Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser85 90CCAGACTCCT GACTGTCTCC CGGGACTACC TGGGACCTCC ACCGTTGGTG TTCACCGCCC 409CCACCCTGAG CGCCTGGGTC CAGGGGAGGC CTTCCAGGGA CGAAGAAGAG CCACAGTGAG 469GGAGATCCCA TCCCCTTGTC TGAACTGGAG CCATGGGCAC AAAGGGCCCA GATTAAAGTC 529TTTATCCTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 582序列号2序列长度558序列类型核酸链型双链拓扑学线性序列种类来源生物名人序列特征表示特征的记号CDS位点2..280特征决定方法S序列C ATG AGG TCA CTT CAG ATG CTG CTC CTG GCT GCT CTG CTT CTG GGG ACT49Met Arg Ser Leu Gln Met Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Gly Thr1 5 10 15TTT CTG CAG CAT GCC AGA GCT GCT CGA GCC ACC AAT GTA GGC CGA GAG 97Phe Leu Gln His Ala Arg Ala Ala Arg Ala Thr Asn Val Gly Arg Glu20 25 30TGC TGC CTG GAT TAC TTC AAA GGG GCC ATT CCT ATC AGG AAG TTG GTG 145Cys Cys Leu Asp Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Ile Arg Lys Leu Val35 40 45AGC TGG TAT AAG ACC TCA GTG GAG TGT TCC AGG GAT GCC ATC GTG TTT 193Ser Trp Tyr Lys Thr Ser Val Glu Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe50 55 60CTG ACT GTC CAG GGC AAG CTC ATC TGT GCA GAC CCC AAA GAC AAA CAT 241Leu Thr Val Gln Gly Lys Leu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Asp Lys His65 70 75 80GTG AAG AAG GCC ATC AGA TTG GTG AAA AAC CCA AGG CCG TGA CCTTCCCGC 292Val Lys Lys Ala Ile Arg Leu Val Lys Asn Pro Arg Pro85 90TGAGGCATTT GGAGACGCCA GGGCTGCTGT CCATGGTTTC AACATAAAGC GGCCTGTGAC 352CAGCAGAGCC CAAGAGCAGC CACAGAGCAG AAGTCCCTGT TCCCTTTTTT ATGGACTCTT 412ATGCACTACA GGCGAACACA AAAAAAAGCA ACGGAATAAA GCCTTCCTCC CTCAAAAAAA 472AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 532AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA558序列号3序列长度45序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列GATTAGTTCT AGATCGCGAC GCGGCCGCCC TTTTTTTTTT TTTTT45序列号4序列长度16序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列TCGACCCACG CGTCCG 16序列号5序列长度12序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGGACGCGTG GG12序列号6序列长度48序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CTACTACTAC TAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGGGGGG GGGGGGGG 48序列号7序列长度31序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATAGTCTAG A31序列号8序列长度35序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列5′P-CTCTAGACTA TCGATTCTGG AACCTTCAGA GGTTT-3′ 35序列号9序列长度32序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CTACTACTAC TAGGCCACGC GTCGACTAGT AC 32序列号10序列长度25序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATAG25序列号11序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCCATATGG CTCGAGGGAC CAATGTG 27序列号12序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAAGACCT CTCAAGGCT 29序列号13序列长度14序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列AATTCGGCAC GAGG14序列号14序列长度10序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列5′P-GGAGCACGGC-3′ 10序列号15序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CTCTGCTTCT GGGGACTTTT CTGC 24序列号16序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列GGTCACAGGC CGCTTTATGT TGAA 24序列号17序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCGGATCCG CTCGAGGGAC CAATGTG27序列号18序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAAGACCT CTCAAGGCT 29序列号19序列长度42序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCTCTAGAA GCTCCGGAAT CATCCCAGTT GAGGAGGAGA AC 42序列号20序列长度53序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAGTGATG GTGATGGTGA TGACCCGGGT GCGCGGCGTC GGT 53序列号21序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCGTCGACG GCACCATGGC CCCACTG27序列号22序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGCTCTAGAA GACCTCTCAA GGCTTTG27序列号23序列长度38序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列GCTCTAGAGC CACCATGAAC CCCACGGATA TAGCAGAT38序列号24序列长度32序列类型核酸链型单链拓扑学线性序列种类其它核酸合成的DNA序列CGTCTAGACT ACAGAGCATC ATGGAGATCA TG 3权利要求
1.具有下列特征的蛋白质1)在免疫学刺激存在时能从外周血单核细胞诱导表达，2)无刺激时主要在胸腺表达，且不在脾脏表达，且3)具有CC型趋化因子特征性的相邻的2个半胱氨酸残基。
2.权利要求1的蛋白质，其中免疫学刺激是植物血凝素或能诱导体液免疫的刺激。
3.权利要求2的蛋白质，其中能诱导体液免疫的刺激是以生理浓度存在的选自GM-CSF、IL-3和IL-4的细胞因子。
4.权利要求1的蛋白质，在诱导细胞免疫的条件下其表达受到抑制。
5.权利要求1的蛋白质，对外周血单核细胞不表现出任何迁移活性。
6.权利要求1的蛋白质，它对表达权利要求1的蛋白质特异受体的细胞具有迁移活性。
7.权利要求5的蛋白质，表达特异受体的细胞是表达CCR4的细胞。
8.权利要求7的蛋白质，其中表达CCR4的细胞选自外周血淋巴细胞和活化的外周血T细胞、Hut78和Hut102。
9.权利要求7的蛋白质，其中表达CCR4的细胞选自T细胞株，Jurkat、MT2和MT4。
10.一种具有序列号1中氨基酸残基24～94的氨基酸序列的人CC型趋化因子样蛋白质；或者含有前面序列中氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该人CC型趋化因子样蛋白质基本上等同的功能或活性的变异体。
11.一种具有序列号1中氨基酸残基1-94氨基酸序列的人CC型趋化因子样蛋白质；或者含有前面序列中的氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与这种人CC型趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性的变异体。
12.一种具有序列号2中氨基酸24-94氨基酸序列的小鼠CC型趋化因子样蛋白质；或者含有前面序列中氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该小鼠CC型趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性的变异体。
13.一种序列号2中氨基酸残基1-93氨基酸序列的小鼠CC型趋化因子样蛋白质；或者含有前面序列中的氨基酸或氨基酸序列发生替换、插入、缺失的序列，且具有与该小鼠CC型，趋化因子样蛋白质基本上同等的功能或活性的变异体。
14.编码权利要求1-13中任一项中蛋白质或其变异体的DNA。
15.含有权利要求14中DNA的表达载体。
16.将权利要求15中的表达载体导入宿主细胞而获得的转化体。
17.权利要求16的转化体，其中宿主细胞为蚕细胞。
18.权利要求1-13任一项中的蛋白质或其变异体的制备方法，其特征在于培养权利要求16的转化体，并从培养基中回收产生的蛋白质。
19.含有权利要求1-13任一项中的蛋白质或其变异体的医药组合物。
20.抗权利要求1-13任一项中的蛋白质或其变异体的单克隆抗体。
21.产生权利要求20中单克隆抗体的杂交瘤细胞。
22.筛选权利要求1-13任一项中之蛋白质的激动剂或拮抗剂的方法，包括将推测含有这种激动剂或拮抗剂的样品与分泌该蛋白质的细胞及诱导该蛋白质分泌的细胞因子混合，测定该蛋白质的分泌量。
23.筛选权利要求1-13任一项中之蛋白质的激动剂或拮抗剂的方法，包括将推测含有这种激动剂或拮抗剂的样品与该蛋白质特异的受体进行反应，测定其结合活性和/或反应性。
全文摘要
分离的新型CC型趋化因子样蛋白质,它是在免疫学刺激物的作用下从外周血单核细胞表达的,具有细胞迁移活性;编码该蛋白质的DNA;含有该DNA的表达载体和转化体;用该转化体制备重组蛋白质的方法;和含有该蛋白质的医药组合物。
文档编号C07K14/435GK1202906SQ96198552
公开日1998年12月23日 申请日期1996年9月27日 优先权日1995年9月27日
发明者今井俊夫, 吉田哲也, 义江修 申请人:盐野义制药株式会社