专利名称：Yn87448病毒毒株全基因组序列及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种YN87448病毒毒株全基因组序列及其克隆方法。
病毒是微生物的一种，YN87448病毒是从人血中分离的，测序结果与国际上从脑炎病人分离的毒力最强的辛德毕斯S.A.AR86毒株序列同源性达98％，但生物学特性差异非常大，S.A.AR86可致成年小鼠死亡，而YN87448则不致成年鼠死亡，YN87448将是用于预防辛德毕斯脑炎流行的最佳侯选疫苗株，它也可开发成治疗神经系统疾病的载体，具有极大的开发价值。
本发明目的是提供一种YN87448病毒毒株全基因组序列，全基因组序列及其克隆方法，该基因序列从分子水平阐明其与国外流行株的差异，它对了解病毒的来源、进化过程及分子流行病学有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案YN87448病毒毒株全基因组序列的克隆方法，它包括(1)病毒的培养及纯化；(2)病毒RNA的提取；(3)病毒RNA的逆转录；(4)病毒基因序列扩增引物的设计与合成；所述的引物是选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物；引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二碱基，引物扩增片段一般不超过1.4Kb。
(5)目的基因的PCR扩增，将全基因分为多个片段分别护增克隆测序，其中包括病毒3’端基因序列的扩增，病毒基因结构区非结构区的扩增；病毒基因5’端的序列测定；(6)目的基因片段回收；(7)将目的基因片段克隆上述PCR片段与pGEM-T载体连接；(8)感受态细胞的制备(9)连接产物的转化(10)双链模板的提取及序列测序。
以下结合实施例对本发明作进一步说明1.病毒的培养及纯化乳鼠脑的传代，在无菌的超净台下，打开YN87448毒株的冻干管，用1ml0.5％的水解乳蛋白的Hanks液溶解，离心5000rpm 2分钟，用注射器向乳鼠颅腔接种0.02ml/只。72小时左右，小鼠全都发病。乘小鼠濒死前，在无菌条件下，取出乳鼠脑。
病毒在BHK21细胞上的传代；每只乳鼠脑加入2ml 0.5％的水解乳蛋白，磨碎。离心12000rpm 2分钟。取上清0.2ml加入到一长满单层BHK21的细胞的方瓶中，再加0.8ml的含2％PS(青霉素和链霉素)1％G(谷氨酰胺)的Eagle培养液，于37℃不断的旋摇1.5小时后，再补加9ml的含2％PS，1％G，及含5％小牛血清的Eagle培养液后，37℃放置48小时。
空斑试验将病毒用0.5％的水解乳蛋白的Hanks液稀释成0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001，0.0000001。分别由低向高加入0.2ml的病毒稀释液到8瓶长满单层BHK21的细胞瓶中。再向每个瓶中加入6ml的预温45℃的覆盖物。覆盖物的组成，1％的琼脂，1XEagle，10％的小牛血清，1％的谷氨酰胺，先用NaHCO3调pH到7.0后，再加1.5％的中性红。覆盖物铺好后，用铝箔包裹细胞瓶。37℃暗处放置48小时左右观查形成的空斑。将形成的单个空斑挑到长满单层的BHK21的细胞瓶中，待染毒48小时后，将此染毒液，用0.5％的水解乳蛋白的Hanks液稀释成0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001，0.0000001。分别由低向高加入0.2ml的病毒稀释液到8瓶长满单层BHK21的细胞瓶中，进行下轮空斑的筛选。筛选三次。
2 病毒RNA的提取共提取三管，每管取0.25ml染毒细胞液，加入0.75ml的Trizol试剂15-30℃5分钟，加0.20ml氯仿，混匀15秒后，15-30℃放5分钟，2-8℃离心12000rpm 15分钟，吸出水相，加入0.50ml的异丙醇，15-30℃放10分钟，然后于2-8℃离心12000rpm 10分钟，弃上清向沉淀中加入1ml 75％乙醇洗涤，2-8℃离心7500rpm 5分钟。弃上清，留沉淀。沉淀即为总RNA.
3 病毒RNA的逆转录对三管RNA编号，编为1，2，3号，每管中加入10ul DEPC H2O，1号管中加入1.5ul的引物5′-cac aga ctg cag cga att cgg tacctt ttt ttt ttt ttt g-3′做逆转录，2号管中加入1.5ul的引物5′-NNNNNN-3′(N＝A，T，G，C)做逆转录，3号管中加入1.5ul的引物5′-ata tac gtg cac acg g-3做逆转录，三管都经历70℃10分钟，冰水浴5分钟，再向每管加4ul 5Xbuffer，2ul DTT，2ul dNTP(10mM)，0.5ul RNA酶抑制剂(40U/ul)，0.5ulMLV(200U/ul)反转录酶.混匀后，39℃1小时。
4 目的片段的PCR扩增4.1病毒3′端基因序列的扩增，采用以下条件10XPCRbuffer20ul 2.5mMdNTP 16ul5′-atg tgg ggn ggn gcnyaytgyttytgyga-3′(100pmol/ul)2 ul5′-cac aga ctg cag cga att cgg tac ctt ttt ttt ttt ttt g-3′(100pmol/ul)2ul
1号管逆转录产物1ul H2O 157ul混匀后，94℃沸水浴2分钟。加Taq 2ul.PCR的条件94℃30秒72℃80秒45℃30秒30个循环，72℃6分钟。NA，T，G，C，YC，T，A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶。
引物的设计原则从甲病毒的共同保守区的结构区的E1区及3′非结构区设计一对引物(5′-atg tgg ggn ggn gcnyaytgyttytgyga-3′and 5′-cac agactg cag cga att cgg tac ctt ttt ttt ttt ttt g-3′)。
4.2病毒基因结构区，非结构区的扩增，采用以下十三对引物模板选用3.中的2号管。
F1-205′-att ggc ggc gta gta cac ac-3′R1063-10485′-ata tac gtg cac acg g-3′F1006-10235′-gca aag tta ccg ata cag-3′R1974-19915′-gta cag ctt gcg gtt cac-3′F1898-19145′-agg aag tgc cgt acc at-3′R2987-30015′-acg tta gtg agc tgc -3′F2934-29505′-cgc act gag gac agg ct-3′R3892-39085′-ctc act att gcg gtc gg-3′F3727-37435′-cgc agg cac ggt acg ac-3′R4850-48675′-cta gac gac ggg ttg tgg-3′F4780-47975′-gca acg aac aac tgt gtg -3′R5810-58265′-cca gaa cat tgc gct cc-3′F5782-57995′-tgc aga acc agc tta cag-3′R6825-68405′-tat ccg tct cca gta c-3′F6795-68135′-ata gca gaa cac ttc aag c-3′R8494-85135′-ttc gag gat gtc gag agc tc-3′Fjunction5′-att tag gac cac cgt aga gat-3′R8494-85135′-ttc gag gat gtc gag agc tc-3′F8430-84465′-ttg ctt gga aac gtg ag-3′R9595-96105′-gca tag acc ctt act g-3′F8462-84725′-cgc tcg agc gcc cca cat-3′R9570-95845′-cgc tcg agc gcc cca cat-3′F9552-95695′-gtc gac cga gat ggc ctg-3′R10746-107995′-gca gtg ggc ggc ctg agt-3′
F10702-107195′-cca aga acg tgc atg tcc-3′R11645-116635′-gaa atg tta aaa aca aaa t-3′PCR条件94℃ 30秒72℃ 90秒58℃ 30秒共30个循环。
72℃6分钟4.3病毒基因的5′端序列测定经过以下三个步骤。
4.3.1单链cDNA的纯化按照Gibco 5′-RACE试剂盒说明书进行。主要经过以下步骤1.加120ul的6M NaI到3.中制备的3号管反转录产物中，混合后，用注射器将其推入到含玻璃粉的小柱子中，13000rpm离心20秒，弃掉滤过液。2.加0.4ml该试剂盒中冷的(4℃)洗脱液1Xwash buffer到小柱中，13000rpm离心20秒，弃掉滤过液。重复三次。3.加0.4ml该试剂盒中冷的(4℃)洗脱液70％乙醇到小柱中，13000rpm离心20秒，弃掉滤过液。重复两次。4.加50ul的热蒸溜水(65℃)洗脱，13000rpm离心20秒，得到纯的含cDNA的滤过液。
4.3.2单链cDNA的加多聚C尾DEPC H2O 6.5ul，5Xtailing buffer 5.0ul，2mM dCTP 2.5ul，纯的cDNA 10ul混匀后，94℃2-3分钟，冰浴1分钟，加1ul的末端转移酶TdT，混匀后，37℃10分钟，65℃10分钟灭活末端转移酶TdT，离心20秒，放于冰上，用于以后的PCR。
4.3.3两次套式PCR扩增.
第一次PCRH2O 31.5ul，10 X PCRbuffer 5.0ul 25mM MgCL23.0ul 10mM dNTP 1.0ul引物5′-ata tac gtg cac acg g-3(100pmol/ul)2.0ul试剂盒锚定引物(10uM)2.0ul加多聚C尾的单链cDNA 2.0ul混匀后，94℃沸水浴2分钟，加Taq 0.5ul。
PCR的条件94℃30秒72℃30秒55℃30秒35个循环，72℃6分钟。
第二次PCRH2O 31.5ul，10XPCRbuffer5.0ul 25mM MgCL2 3.0ul10mMdNTP 1.0ul引物5′-ggt gta tca agt acg gtc-3′(100pmol/ul)2.0ul试剂盒锚定引物(10uM)2.0ul第1次PCR的产物0.5ul混匀后，94℃沸水浴2分钟，加Taq 0.5ul。
5 回收PCR扩增的目的片段将PCR扩增后的样品200ul加到1.0％的TAE(pH 8.0)琼脂糖胶上后，电泳，割下扩增的目的片段，用Promega公司的PCR片段纯化试剂盒纯化，向样品胶条中加入1ml树脂，65℃10分钟待胶熔化后，摇匀20秒，用注射器将样品推入小柱子中，用2ml的80％异丙醇洗涤两次，每次离心12000rpm 1分钟。最后加入50ul的TE(pH 8.0)1分钟后，离心12000rpm 20秒得到50ul的纯化片段。
6.DH5 α感受态菌的制备取3ml的LB培养液，用牙签挑起无氨苄青霉素抗性的单菌落到此培养液中，于37℃摇床上摇菌12小时后，取出50ul的菌液加入到5ml的LB培养液中，再于37℃摇床上摇菌4小时左右(OD0.6)时，将菌液均分到5个1.5ml规格的EP管中，12000rpm离心30秒，弃上清，加入0.4ml的0。1M的CaCl2吹匀后，12000rpm再离心30秒，弃上清，加入0.1ml的0.1M的CaCl2吹匀后，放置于冰水浴中备用。
7 PCR扩增的目的片段克隆克隆上述PCR产物到pGEM-T载体上，步骤如下7.0ul PCR产物，1.0ulpGEM-T载体，1.0ul T4 DNA连结酶缓冲液，1.0ul T4 DNA连结酶，混匀后，4℃放置12小时。加连结物到4℃的DH5α感受态菌中，2小时后热休克42℃90秒，冰水浴5分钟。加入100ul LB。37℃1小时。与40ul X-gal(20mg/ml)，4.0ul IPTG(200mg/ml)一起加到氨苄青霉素碟中。涂匀。37℃放置14小时，用牙签挑起单菌落到3ml含有氨苄青霉素的LB中，于37℃摇床上摇菌12小时后，快提质粒8 快提质粒的方法取1.5ml菌液A.12000rpm，4℃，30秒。弃上清。
B.加入预冷的100ul Sol1，振荡混匀。
C.加入新制的200ul Sol2，颠倒五次混匀，冰浴放置。
D.加入预冷的150ul Sol3，轻轻转动混匀，冰浴放置3-5分钟。
E.12000rpm，4℃，5分钟。弃沉淀，留上清。
F.加入等量酚∶氯仿(1∶1)颠倒五次混匀，12000rpm，4℃，2分钟，转上清于另一管中。
G.用二倍体积的无水乙醇，颠倒五次混匀，-20℃放置60分钟H.12000rpm，4℃，5分钟.留沉淀，弃上清。
I.用1ml70％的乙醇于4℃洗涤DNA沉淀，晾干。
J.加入19ulTEbuffer(pH 8.0)溶解DNA沉淀，再加入1ulRNA酶37℃40分钟。
用ApaI和SacI双酶切鉴定插入片段的大小，并配合PCR验证阳性克隆。
9.测序模板的提取及核苷酸序列的测定将鉴定正确的单菌落，接种于含氨苄青霉素的3ml LB中，37℃摇菌10小时。5000rpm离心2分钟，用100ul的100ul Sol1，轻轻振荡混匀，冰浴放置5分钟。加入200ul Sol2，颠倒五次混匀，冰浴放置5分钟，加入200ul Sol3，轻轻转动混匀，冰浴放置10分钟。
12000rpm，4℃，10分钟。上清中加RNA酶至终浓度20ul/ml，37℃水浴30分钟；加400ul氯仿抽提两次，上清中加等体积的异丙醇，12000rpm，4℃，10分钟。然后加70％乙醇洗沉淀一次。真空抽干后加30ul的去离子水悬浮沉淀，加4MNaCl 8ul，13％PEG8000 40ul，12000rpm，4℃，10分钟，弃上清，留沉淀，再用70％乙醇洗沉淀一次，弃上清。沉淀真空抽干后溶于20ul去离子水中。然后用Sanger双脱氧终止法，用荧光染料标记，然后在PE公司的377型DNA测序仪上采用T7和SP6通用引物从正，反方向测定克隆片段的核苷酸序列。然后将测序结果与基因库同源序列比较。确认病毒YN87448毒株为一株新的Sindbis样病毒。
测得YN87448病毒的基因序列全长为11717个核苷酸，不包括5′端的帽子结构3′端的多聚腺苷酸尾。序列如下ATTGGCGGCGTAGTACACACTATTGAATTAAACAGCCGACCAATTGCACTACCATCACAATGGAGAAGCCAGTAGTTAACGTAGACGTAGACCCTCAGAGTCCGTTTGTCGTGCAACTGCAAAAGAGCTTCCCGCAATTTGAGGTAGTAGCACAGCAGGTCACTCCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCCAGTAAACTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATTTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCAGTACCATTGCGTTTGCCCCATGCGTAGTCCAGAAGACCCGGACCGCATGATGAAATATGCCAGCAAACTGGCGGAAAAAGCATGTAAGATTACAAACAAGAACTTGCATGAGAAGATCAAGGACCTCCGGACCGTACTTGATACACCGGATGCTGAAACGCCATCACTCTGCTTCCACAACGATGTTACCTGCAACACGCGTGCCGAGTACTCCGTCATGCAGGACGTGTACATCAACGCTCCCGGAACTATTTACCACCAGGCTATGAAAGGCGTGCGGACCCTGTACTGGATTGGCTTCGACACCACCCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGTTCGTACCCTGCATACAACACCAACTGGGCCGACGAAAAAGTCCTTGAAGCGCGTAACATCGGACTCTGCAGCACAAAGCTGAGTGAAGGCAGGACAGGAAAGTTGTCGATAATGAGGAAGAAGGAGTTTAAGCCCGGGTCACGGGTTTATTTCTCCGTTGGATCGACACTTTACCCAGAACACAGAGCCAGCTTGCAGAGCTGGCATCTTCCATCGGTGTTCCACTTGAAAGGAAAGCAGTCGTACACTTGCCGCTGTGATACAGTGGTGAGCTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAAATCACCATCAGTCCCGGGGTCACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACATACAATAGCGAGGGCTTCTTGCTATGCAAAGTTACCGATACAGTAAAAGGAGAACGGGTATCGTTCCCCGTGTGCACGTATATCCCGGCCACCATATGCGATCAGATGACCGGCATAATGGCCACGGATATCTCACCTGACGATGCACAAAAACTTCTGGTTGGGCTCAACCAGCGAATCGTCATTAACGGTAAGACTAACAGGAACACCAATACCATGCAAAATTACCTTCTGCCAATCATTGCACAAGGGTTCAGCAAATGGGCCAAGGAGCGCAAAGCAGATCTTGACAATGAAAAAATGCTGGGCACCAGAGAGCGCAAGCTTACATATGGCTGCTTGTGGGCGTTTCGCACTAAGAAAGTGCACTCGTTCTATCGCCCACCTGGAACGCAGACCAGCGTAAAAGTCCCAGCCTCTTTTAGCGCTTTCCCCATGTCATCCGTATGGACTACCTCTTTGCCCATGTCGCTGAGGCAGAAGGTGAAATTGGCATTACAACCAAAGAAGGAGGAAAAACTGCTGCAAGTCCCGGAGGAATTAGTTATGGAGGCCAAGGCTGCTTTCGAGGATGCTCAGGAGGAATCCAGAGCGGAGAAGCTCCGAGAAGCACTCCCACCATTAGTGGCAGACAAAGGTATCGAGGCAGCTGCGGAAGTTGTCTGCGAAGTGGAGGGGCTCCAGGCGGACATCGGAGCAGCACTCGTCGAAACCCCGCGCGGTCATGTAAGGATAATACCTCAAGCAAATGACCGTATGATCGGACAGTATATCGTTGTCTCGCCGATCTCTGTGCTGAAGAACGCTAAACTCGCACCAGCACACCCGCTGGCAGACCAGGTTAAGATCATAACGCACTCCGGAAGATCAGGAAGGTATGCAGTCGAACCATACGACGCTAAAGTACTGATGCCAGCAGGAAGTGCTGTACCATGGCCAGAATTCTTAGCACTGAGTGAGAGCGCCACGCTAGTGTACAACGAAAGAGAGTTTGTGAACCGCAAGCTGTACCATATTGCCATGCACGGTCCCGCTAAGAATACAGAAGAGGAGCAGTACAAGGTTACAAAGGCAGAGCTCGCAGAAACAGAGTACGTGTTTGACGTGGACAAGAAGCGATGCGTTAAGAAGGAAGAAGCCTCAGGACTTGTCCTTTCGGGAGAACTGACCAACCCGCCCTATCACGAACTAGCTCTTGAGGGACTGAAGACTCGACCCGCGGTCCCGTACAAGGTTGAAACAATAGGAGTGATAGGCACACCAGGATCGGGCAAGTCAGCTATCATCAAGTCAACTGTCACGGCACGTGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAAGAAAACTGCCGCGAAATTGAGGCCGACGTGCTACGGCTGAGGGGCATGCAGATCACGGCGAAGACAGTGGATTCGGTTATGCTCAACGGATGCCACAAAGCCGTAGAAGTGCTGTATGTTGACGAAGCGTTCGCGTGCCACGCAGGAGCACTACTTGCCTTGATTGCAATCGTCAGACCCCGTAAGAAGGTAGTACTATGCGGAGACCCTAAGCAATGCGGATTCTTCAACATGATGCAACTAAAGGTACATTTCAACCACCCTGAAAAAGACATATGTACCAAGACATTCTACAAGTTTATCTCCCGACGTTGCACACAGCCAGTCACGGCTATTGTATCGACACTGCATTACGATGGAAAAATGAAAACCACAAACCCGTGCAAGAAGAACATCGAAATCGACATTACAGGGGCCACGAAGCCGAAGCCAGGGGACATCATCCTGACATGTTTCCGCGGGTGGGTTAAGCAACTGCAAATCGACTATCCCGGACATGAGGTAATGACAGCCGCGGCCTCACAAGGGCTAACCAGAAAAGGAGTATATGCCGTCCGGCAAAAAGTCAATGAAAACCCGCTGTACGCGATCACATCAGAGCATGTGAACGTGTTGCTCACCCGCACTGAGGACAGGCTAGTATGGAAAACTTTACAGGGCGACCCATGGATTAAGCAGCTCACTAACGTACCTAAAGGAAATTTTCAGGCCACCATCGAGGACTGGGAAGCTGAACACAAGGGAATAATTGCTGCGATAAACAGTCCCGCTCCCCGTACCAATCCGTTCAGCTGCAAGACTAACGTTTGCTGGGCGAAAGCACTGGAACCGATACTGGCCACGGCCGGTATCGTACTTACCGGTTGCCAGTGGAGCGAGCTGTTCCCACAGTTTGCGGATGATAAACCACACTCGGCCATCTACGCCTTAGACGTAATTTGCATTAAGTTTTTCGGCATGGACTCGACAAGCGGACTGTTTTCCAAACAGAGCATCCCGTTAACGTACCATCCTGCCGACTCAGCGAGGCCAGTAGCTCATTGGGACAACAGCCCAGGAACACGCAAGTATGGGTACGATCACGCCGTTGCCGCCGAACTCTCCCGTAGATTTCCGGTGTTCCAGCTAGCTGGGAAAGGCACACAGCTTGATTTGCAGACGGGCAGAACTAGAGTTATCTCTGCACAGCATAACTTGGTCCCAGTGAACCGCAATCTCCCTCACGCCTTAGTCCCCGAGCACAAGGAGAAACAACCCGGCCCGGTCGAAAAATTCTTGAGCCAGTTCAAACACCACTCCGTACTTGTGATCTCAGAGGAAAAAATTGAAGCTCCCCACAAGAGAATCGAATGGATCGCCCCGATTGGCATAGCCGGCGCAGATAAGAACTACAACCTGGCTTTCGGGTTTCCGCCGCAGGCACGGTACGACCTGGTGTTCATCAATATTGGAACTAAATACAGAAACCATCACTTTCAACAGTGCGAAGACCACGCGGCGACCTTGAAAACCCTTTCGCGTTCGGCCCTGAACTGCCTTAACCCCGGAGGCACCCTCGTGGTGAAGTCCTACGGTTACGCCGACCGCAATAGTGAGGACGTAGTCACCGCTCTTGCCAGAAAATTTGTCAGAGTGTCTGCAGCGAGGCCAGAGTGCGTCTCAAGCAATACAGAAATGTACCTGATTTTCCGACAACTAGACAACAGCCGCACACGACAATTCACCCCGCATCATTTGAATTGTGTGATTTCGTCCGTGTACGAGGGTACAAGAGACGGAGTTGGAGCCGCACCGTCGTACCGTACTAAAAGGGAGAACATTGCTGATTGTCAAGAGGAAGCAGTTGTCAATGCAGCCAATCCACTGGGCAGACCAGGAGAAGGAGTCTGCCGTGCCATCTATAAACGTGGGCCGAACAGTTTCACCGATTCAGCCACAGAGACAGGCACCGCAAAACTGACTGTGTGCCAAGGAAAGAAAGTGATCCACGTGGTTGGCCCTGATTTCCGGAAACACCCAGAGGCAGAAGCCCTGAAATTGCTGCAAAACGCCTACCATGCAGTGGCAGACTTAGTAAATGAACATAATATCAAGTCTGTCGCCATCCCATTGCTATCTACAGGCATTTACGCAGCCGGAAAAGACCGCCTTGAGGTATCACTTAACTGCTTGACAACCGCGCTAGACAGAACTGATGCGGACGTAACCATCTACTGCCTGGATAAGAAGTGGAAGGAAAGAATCGACGCGGTGCTCCAACTTAAGGAGTCTGTAACTGTGCTGAAGGATGAGGATATGGAGATCGACGACGAGTTAGTATGGATCCATCCGGACAGTTGCCTGAAGGGAAGACAGGGATTCAGTACTACAAAAGGAAAGTTGTATTCGTACTTTGAAGGCACCAAATTCCATCAAGCAGCAAAAGATATGGCGGAGATAAAGGTCCTGTTCCCAAATGACCAGGAAAGCAACGAACAACTGTGTGCCTACATATTGGGGGAGACCATGGAAGCAATCCGCGAAAAATGCCCGGTCGACCACAACCCGTCGTCTAGCCCGCCAAAAACGCTGCCGTGCCTCTGTATGTATGCCATGACGCCAGAAAGGGTCCACAGACTCAGAAGCAATAACGTTAAAGAAGTTACAGTATGCTCCTCCACCCCCCTTCCAAAGTACAAAATCAAGAATGTTCAGAAGGTTCAGTGCACAAAAGTAGTCCTGTTTAACCCGCATACCCCCGCATTCGTTCCCGCCCGTAAGTACATAGAAGCACCAGAACAGCCTGCAGCTCCGCCTGCACAGGCCGAGGAGGCCCCCGGAGTTGTAGCGACACCAACACCACCTGCAGCTGATAACACCTCGCTTGATGTCACGGACATCTCACTGGACATGGAAGACAGTAGCGAAGGCTCACTCTTTTCGAGCTTTAGCGGATCGGACAACTCTATTACTAGTATGGACAGTTGGTCGTCAGGACCTAGTTCACTAGAGATAGTAGACCGAAGGCAGGTGGTGGTGGCTGACGTCCATGCCGTCCAAGAGCCTGCCCCTGTTCCACCGCCAAGGCTAAAGAAGATGGCCCGCCTGGCAGCGGCAAGAATGCAGGAAGGGCCAACTCCACCGGCAAGCACCAGCTCTGCGGACGAGTCCCTTCACCTTTCTTTTGATGGGGTATCTATGTCCTTCGGATCCCTTTTCGACGGAGAGATGGTCCGCTTGGCAGCGGCACAACCCCCGGCAACATGCCCTACGGATGTGCCTATGTCTTTCGGATCGTTTTCCGACGGAGAGATTGAGGAGTTGATCCGCAGAGTAACCGAGTCGGAGCCCGTCCTGTTTGGGTCATTTGAACCGGGCGAAGTGAACTCAATTATATCGTCCCGTTCAGCCGTATCTTTTCCACCACGCAAGCAGAGACGTAGACGCAGGAGCAGGAGGACCGAATACTGACTAACCGGGGTAGGTGGGTACATATTTTCGACGGACACAGGCCCTGGGCACTTGCAAAAGAAGTCCGTTCTGCAGAACCAGCTTACAGAACCGACCTTGGAGCGCAATGTTCTGGAAAGAATCTACGCCCCGGTGCTCGACACGTCGAAAGAGGAACAGCTCAAACTCAGGTACCAGATGATGCCCACCGAAGCCAACAAAAGCAGGTACCAGTCTCGAAAAGTAGAAAACCAGAAAGCCATAACCACTGAGCGACTGCTTTCAGGGCTACGACTGTATAACTCTGCCACAGATCAGCCAGAATGCTATAAGATCACCTACCCGAAACCATCGTATTCCAGCAGTGTACCAGCTAACTACTCTGACCCAAAGTTTGCTGTAGCTGTTTGTAACAACTATCTGCATGAGAATTACCCGACGGTAGCATCTTATCAGATCACCGACGAGTACGATGCTTACTTGGATATGGTAGACGGGACAGTCGCTTGCCTAGATACTGCAATTTTTTGCCCCGCCAAGCTTAGAAGTTACCCGAAAAGACACGAGTATAGAGCCCCAAACATCCGCAGTGCGGTTCCATCAGCGATGCAGAACACGTTGCAAAACGTGCTCATTGCCGCGACTAAAAGAAACTGCAACGTCACACAAATGCGTGAACTGCCAACACTGGACTCAGCGACATTCAACGTTGAATGCTTTCGAAAATATGCATGCAATGACGAGTATTGGGAGGAGTTTGCCCGAAAGCCAATTAGGATCACTACTGAGTTCGTTACCGCATACGTGGCCAGACTGAAAGGCCCTAAGGCCGCCGCACTGTTCGCAAAGACGCATAATTTGGTCCCATTGCAAGAAGTGCCTATGGATAGATTCGTCATGGACATGAAAAGAGACGTGAAAGTTACACCTGGCACGAAACACACAGAAGAAAGACCGAAAGTACAAGTGATACAAGCCGCAGAACCCCTGGCGACCGCTTACCTATGCGGGATCCACCGGGAGTTAGTGCGCAGGCTTACAGCCGTTTTGCTACCCAACATTCACACGCTCTTTGACATGTCGGCGGAGGACTTTGATGCAATCATAGCAGAACACTTCAAGCAAGGTGACCCGGTACTGGAGACGGATATCGCCTCGTTCGACAAAAGCCAAGACGACGCTATGGCGTTAACCGGCCTGATGATCTTGGAAGACCTGGGTGTGGACCAACCACTACTCGACTTGATCGAGTGCGCCTTTGGAGAAATATCATCCACCCATCTGCCCACGGGTACCCGTTTCAAATTCGGGGCGATGATGAAATCCGGAATGTTCCTCACGCTCTTTGTCAACACAGTTCTGAATGTCGTTATCGCCAGCAGAGTATTGGAGGAGCGGCTTAAAACGTCCAAATGTGCAGCATTTATCGGCGACGATAACATTATACACGGAGTAGTATCTGACAAAGAAATGGCTGAGAGGTGTGCCACCTGGCTCAACCTGGAGGTTAAGATCATTGACGCAGTCATCGGCGAGAGACCACCTTACTTCTGCGGTGGATTCATCTTGCAAGATTCGGTTACCTCCACAGCGTGTCGCGTGGCGGACCCCTTGAAAAGGCTGTTTAAGTTGGGTAAACCGCTCCCAGCCGACGACGAGCAAGACGAAGACAGAAGACGCGCTCTGCTAGATGAAACAAAGGCGTGGTTTAGAGTAGGTATAACAGACACCTTAGCAGTGGCCGTGGCAACTCGGTATGAGGTAGACAACATCACACCTGTCCTGCTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTTCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAGGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACCACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCAGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGATGCCTGCCCGCAATGGGCTGGCTTCCCAAATCCAGCAACTGACCACAGCCGTCAGTGCCCTAGTCATTGGACAGGCAACTAGACCTCAAACCCCACGCCCACGCCCGCCGCCGCGCCAGAAGAAGCAGGCGCCAAAGCAACCACCGAAGCGGAAGAAACCAAAAACACAGGAGAAGAAGAAGAAGCAACCTGCAAAACCCAAACCCGGAAAGAGACAGCGTATGGCACTTAAGTTGGAGGCCGACAGACTGTTCGACGTAAAAAATGAGGACGGAGATGTCATCGGGCACGCACTGGCCATGGAAGGAAAGGTAATGAAACCTCTCCACGTGAAAGGAACTATTGACCACCCTGTGCTATCAAAGCTCAAATTCACCAAGTCGTCAGCATACGACATGGAGTTCGCACAGTTGCCGGTCAACATGAGAAGTGAGGCGTTCACCTACACCAGTGAACACCCTGAAGGGTTCTACAACTGGCACCACGGAGCGGTGCAGTATAGTGGAGGCAGATTTACCATCCCCCGCGGAGTAGGAGGCAGAGGAGACAGTGGTCGTCCGATTATGGATAACTCAGGCCGGGTTGTCGCGATAGTCCTCGGAGGGGCTGATGAGGGAACAAGAACCGCCCTTTCGGTCGTCACCTGGAATAGCAAAGGGAAGACAATCAAGACAACCCCGGAAGGGACAGAAGAGTGGTCTGCTGCACCACTGGTCACGGCCATGTGCTTGCCTGGAAACGTGAGCTTCCCATGCAATCGCCCGCCCACATGCTACACCCGCGAACCATCCAGAGCTCTCGACATCCTCGAAGAGAACGTGAACCACGAGGCCTACGACACCCTGCTCAACGCCATATTGCGGTGCGGATCGTCCGGCAGAAGTAAAAAAAAAAGCGTCACTGACGACTTTACCTTGACCAGCCCGTACTTGGGCACATGCTCGTACTGTCACCATACTGAACCGTGCTTTAGCCTGATTAAGATCGAGCAGGTCTGGGATGAAGCGGACGACAACACCATACGCATACAGACTTCCGCCCAGTTTGGATACGACCAAAGCGGAGCAGCAAGCTCAAATAAGTACCGCTACATGACGCTCGAGCAGGATCATACTGTCAAAGAAGGCACCATGGATGACATCAAGATCAGCACCTCAGGACCGTGTGGAAGGCTTAGCTACAAAGGATACTTTCTCCTCGCGAAGTGTCCTCCAGGGGACAGCGTAACGGTTAGCATAGCGAGTAGCAACTCAGCAACGTCATGCACAATGGCCCGCAAGATAAAACCAAAATTCGTGGGACGGGAAAAATATGACCTACCTCCCGTTCACGGTAAGAAGATTCCTTGCACAGTGTACGACCGTCTGAAAGAAACAACCGCCGGCTACATCACTATGCACAGGCCGGGACCGCACGCCTATACATCCTATCTGAAGGAATCATCAGGGAAAGTTTACGCGAAGCCACCATCCGGGAAGAACATTACGTACGAGTGCAAGTGCGGCGATTACAAGACCGGAACCGTTACGACCCGTACCGAAATCACGGGCTGCACCGCCATCAAGCAGTGCGTCGCCTATAAGAGCGACCAAACGAAGTGGGTCTTCAACTCGCCGGACTCTATCAGACACGCCGACCACACGGCCCAAGGGAAATTGCATTTGCCTTTCAAGCTGATCCCGAGTACCTGCATGGTCCCTGTTGCCCACGCGCCGAACGTAGTACACGGCTTTAAACACATCAGCCTCCAATTAGACACAGACCATCTGACATTGCTCACCACCAGGAGACTAGGGGCAAACCCGGAACCAACCACTGAATGGATCATCGGAAAGACGGTTAGAAACTTCACCGTCGACCGAGATGGCCTGGAATACATATGGGGCAATCACGAACCAGTAAGGGTCTATGCCCAAGAGTCTGCACCAGGAGACCCTCACGGATGGCCACACGAAATAGTACAGCATTACTATCATCGCCATCCTGTGTACACCATCTTAGCCGTCGCATCAGCTGCTGTGGCGATGATGATTGGCGTAACTGTTGCAGCATTATGTGCCTGTAAAGCGCGCCGTGAGTGCCTGACGCCATATGCCCTGGCCCCAAATGCCGTGATTCCAACTTCGCTGGCACTTTTGTGCTGTGTTAGGTCGGCTAATGCTGAAACATTCACCGAGACCATGAGTTACTTATGGTCGAACAGCCAGCCGTTCTTCTGGGTCCAGCTGTGTATACCTCTGGCCGCTGTCATCGTTCTAATGCGCTGTTGCTCATGCTGCCTGCCTTTTTTAGTGGTTGCCGGCGCCTACCTGGCGAAGGTAGACGCCTACGAACATGCGACCACTGTTCCAAATGTGCCACAGATACCATATAAGGCACTTGTTGAAAGGGCAGGGTACGCCCCGCTCAGTTTGGAGATTACTGTCATGTCCTCGTAGGTTTTGCCTTCCACCAACCAAGAGTACATCACCTGCAAATTCACCACTGTGGTCCCCTCCCCTAAAGTCAGATGCTGCGGCTCCTTGGAATGTCAGCCCGCGGCTCACGCAGATTATACCTGCAAGGTCTTTGGAGGGGTGTACCCCTTCATGTGGGGAGGAGCACAATGTTTTTGCGACAGTGAGAACAGCCAGATGAGTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAGCAGATTGCGCGACTGACCACGCGCAGGCGATTAAGGTGCATACTGCCGCGATGAAAGTAGGACTGCGTATAGTGTACGGGAACACTATCAGTTTCCTAGATGTGTACGTGAACGGAGTCACACCAGGAACGTCTAAAGACCTGAAAGTCATAGCTGGACCAATTTCAGCATTGTTTACACCATTCGATCACAAGGTCGTTATCCATCGCGGCCTGGTGTACAACTATGACTTTCCGGAATACGGAGCGATGAAACCAGGAGCGTTTGGAGACATTCAAGCTACCTCCTTGACTAGCAAAGACCTCATCGCCAGCACAGATATTAGGCTACTCAAGCCTTCCGCCAAGAACGTGCATGTCCCGTACACGCAGGCCGCATCTGGATTCGAGATGTGGAAAAACAACTCAGGCCGCCCACTGCAGGAAACCGCCCCTTTTGGGCGCAAGATTGCAGTCAATCCGCTTCAGGCGGTGGACTGCTCATACGGGAACATTCCCATCTCTATTGACATCCCGAACGCTGCCTTTATCAGGACATCAGATGCACCACTGGTCTCAACAGTCAAATGTGATGTCAGTGAGTGCACTTATTCAGCGGACTTCGGCGGGATGGCTACCCTGCAGTATGTATCCGACCGCGAAGGACAATGCCCTGTACATTCGCATTCGAGCACAGCAACCCTCCAAGAGTCGACAGTTCATGTCCTGGAGAAAGGAGCGGTGACAGTACACTTCAGCACCGCGAGCCCACAGGCAAACTTCATTGTATCGCTGTGTGGTAAGAAGACAACATGCAATGCAGAATGCAAACCACCAGCTGATCATATCGTGAGCACCCCGCACAAAAATGACCAAGAATTCCAAGCCGCCATCTCAAAAACTTCATGGAGTTGGCTGTTTGCCCTTTTCGGCGGCGCCTCGTCGCTATTAATTATAGGACTTATGATTTTTGCTTGCAGCATGATGCTGACTAGCACACGAAGATGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGCAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAACTGATGTGCATAATGCATCAGGCTGGTATATTAGATCCCCGCTTACCGCGGGCAATATAGCAACACCAAAACTCGACGTATTTCCGAGGAAGCGCAGTGCATAATGCTGCGCAGTGTTGCCAAATAATCACTATATTAACCATTTATTCAGCGGACGCCAAAACTCAATGTATTTTTGAGGAAGCATGGTGCATAATGCCATGCAGCGTCTGCATAACTTTTTATTATTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAACATTTC
本发明优点本发明将全基因分15个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，连入T载体，利用通用引物测序，在扩增中所用引是根据甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物，引物3’末端可能终止在简单密码子较少的氨基酸位置，且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基。因此，本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于了解病毒的来源，致病性、分类、进化等过程，本病毒有可能作为栽体使用。特别是全基因序列表明该病毒可开发成预防辛德毕斯脑炎流行的疫苗株，具备极大的开发价值。
权利要求
1.一种YN87448病毒毒株全基因组序列，其特征在于其全长包括11717个核苷酸(不包括5’端的帽子结构、3’端的多聚核苷酸尾)序列如下ATTGGCGGCGTAGTACACACTATTGAATTAAACAGCCGACCAATTGCACTACCATCACAATGGAGAAGCCAGTAGTTAACGTAGACGTAGACCCTCAGAGTCCGTTTGTCGTGCAACTGCAAAAGAGCTTCCCGCAATTTGAGGTAGTAGCACAGCAGGTCACTCCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCCAGTAAACTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATTTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCAGTACCATTGCGTTTGCCCCATGCGTAGTCCAGAAGACCCGGACCGCATGATGAAATATGCCAGCAAACTGGCGGAAAAAGCATGTAAGATTACAAACAAGAACTTGCATGAGAAGATCAAGGACCTCCGGACCGTACTTGATACACCGGATGCTGAAACGCCATCACTCTGCTTCCACAACGATGTTACCTGCAACACGCGTGCCGAGTACTCCGTCATGCAGGACGTGTACATCAACGCTCCCGGAACTATTTACCACCAGGCTATGAAAGGCGTGCGGACCCTGTACTGGATTGGCTTCGACACCACCCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGTTCGTACCCTGCATACAACACCAACTGGGCCGACGAAAAAGTCCTTGAAGCGCGTAACATCGGACTCTGCAGCACAAAGCTGAGTGAAGGCAGGACAGGAAAGTTGTCGATAATGAGGAAGAAGGAGTTTAAGCCCGGGTCACGGGTTTATTTCTCCGTTGGATCGACACTTTACCCAGAACACAGAGCCAGCTTGCAGAGCTGGCATCTTCCATCGGTGTTCCACTTGAAAGGAAAGCAGTCGTACACTTGCCGCTGTGATACAGTGGTGAGCTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAAATCACCATCAGTCCCGGGGTCACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACATACAATAGCGAGGGCTTCTTGCTATGCAAAGTTACCGATACAGTAAAAGGAGAACGGGTATCGTTCCCCGTGTGCACGTATATCCCGGCCACCATATGCGATCAGATGACCGGCATAATGGCCACGGATATCTCACCTGACGATGCACAAAAACTTCTGGTTGGGCTCAACCAGCGAATCGTCATTAACGGTAAGACTAACAGGAACACCAATACCATGCAAAATTACCTTCTGCCAATCATTGCACAAGGGTTCAGCAAATGGGCCAAGGAGCGCAAAGCAGATCTTGACAATGAAAAAATGCTGGGCACCAGAGAGCGCAAGCTTACATATGGCTGCTTGTGGGCGTTTCGCACTAAGAAAGTGCACTCGTTCTATCGCCCACCTGGAACGCAGACCAGCGTAAAAGTCCCAGCCTCTTTTAGCGCTTTCCCCATGTCATCCGTATGGACTACCTCTTTGCCCATGTCGCTGAGGCAGAAGGTGAAATTGGCATTACAACCAAAGAAGGAGGAAAAACTGCTGCAAGTCCCGGAGGAATTAGTTATGGAGGCCAAGGCTGCTTTCGAGGATGCTCAGGAGGAATCCAGAGCGGAGAAGCTCCGAGAAGCACTCCCACCATTAGTGGCAGACAAAGGTATCGAGGCAGCTGCGGAAGTTGTCTGCGAAGTGGAGGGGCTCCAGGCGGACATCGGAGCAGCACTCGTCGAAACCCCGCGCGGTCATGTAAGGATAATACCTCAAGCAAATGACCGTATGATCGGACAGTATATCGTTGTCTCGCCGATCTCTGTGCTGAAGAACGCTAAACTCGCACCAGCACACCCGCTGGCAGACCAGGTTAAGATCATAACGCACTCCGGAAGATCAGGAAGGTATGCAGTCGAACCATACGACGCTAAAGTACTGATGCCAGCAGGAAGTGCTGTACCATGGCCAGAATTCTTAGCACTGAGTGAGAGCGCCACGCTAGTGTACAACGAAAGAGAGTTTGTGAACCGCAAGCTGTACCATATTGCCATGCACGGTCCCGCTAAGAATACAGAAGAGGAGCAGTACAAGGTTACAAAGGCAGAGCTCGCAGAAACAGAGTACGTGTTTGACGTGGACAAGAAGCGATGCGTTAAGAAGGAAGAAGCCTCAGGACTTGTCCTTTCGGGAGAACTGACCAACCCGCCCTATCACGAACTAGCTCTTGAGGGACTGAAGACTCGACCCGCGGTCCCGTACAAGGTTGAAACAATAGGAGTGATAGGCACACCAGGATCGGGCAAGTCAGCTATCATCAAGTCAACTGTCACGGCACGTGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAAGAAAACTGCCGCGAAATTGAGGCCGACGTGCTACGGCTGAGGGGCATGCAGATCACGGCGAAGACAGTGGATTCGGTTATGCTCAACGGATGCCACAAAGCCGTAGAAGTGCTGTATGTTGACGAAGCGTTCGCGTGCCACGCAGGAGCACTACTTGCCTTGATTGCAATCGTCAGACCCCGTAAGAAGGTAGTACTATGCGGAGACCCTAAGCAATGCGGATTCTTCAACATGATGCAACTAAAGGTACATTTCAACCACCCTGAAAAAGACATATGTACCAAGACATTCTACAAGTTTATCTCCCGACGTTGCACACAGCCAGTCACGGCTATTGTATCGACACTGCATTACGATGGAAAAATGAAAACCACAAACCCGTGCAAGAAGAACATCGAAATCGACATTACAGGGGCCACGAAGCCGAAGCCAGGGGACATCATCCTGACATGTTTCCGCGGGTGGGTTAAGCAACTGCAAATCGACTATCCCGGACATGAGGTAATGACAGCCGCGGCCTCACAAGGGCTAACCAGAAAAGGAGTATATGCCGTCCGGCAAAAAGTCAATGAAAACCCGCTGTACGCGATCACATCAGAGCATGTGAACGTGTTGCTCACCCGCACTGAGGACAGGCTAGTATGGAAAACTTTACAGGGCGACCCATGGATTAAGCAGCTCACTAACGTACCTAAAGGAAATTTTCAGGCCACCATCGAGGACTGGGAAGCTGAACACAAGGGAATAATTGCTGCGATAAACAGTCCCGCTCCCCGTACCAATCCGTTCAGCTGCAAGACTAACGTTTGCTGGGCGAAAGCACTGGAACCGATACTGGCCACGGCCGGTATCGTACTTACCGGTTGCCAGTGGAGCGAGCTGTTCCCACAGTTTGCGGATGATAAACCACACTCGGCCATCTACGCCTTAGACGTAATTTGCATTAAGTTTTTCGGCATGGACTCGACAAGCGGACTGTTTTCCAAACAGAGCATCCCGTTAACGTACCATCCTGCCGACTCAGCGAGGCCAGTAGCTCATTGGGACAACAGCCCAGGAACACGCAAGTATGGGTACGATCACGCCGTTGCCGCCGAACTCTCCCGTAGATTTCCGGTGTTCCAGCTAGCTGGGAAAGGCACACAGCTTGATTTGCAGACGGGCAGAACTAGAGTTATCTCTGCACAGCATAACTTGGTCCCAGTGAACCGCAATCTCCCTCACGCCTTAGTCCCCGAGCACAAGGAGAAACAACCCGGCCCGGTCGAAAAATTCTTGAGCCAGTTCAAACACCACTCCGTACTTGTGATCTCAGAGGAAAAAATTGAAGCTCCCCACAAGAGAATCGAATGGATCGCCCCGATTGGCATAGCCGGCGCAGATAAGAACTACAACCTGGCTTTCGGGTTTCCGCCGCAGGCACGGTACGACCTGGTGTTCATCAATATTGGAACTAAATACAGAAACCATCACTTTCAACAGTGCGAAGACCACGCGGCGACCTTGAAAACCCTTTCGCGTTCGGCCCTGAACTGCCTTAACCCCGGAGGCACCCTCGTGGTGAAGTCCTACGGTTACGCCGACCGCAATAGTGAGGACGTAGTCACCGCTCTTGCCAGAAAATTTGTCAGAGTGTCTGCAGCGAGGCCAGAGTGCGTCTCAAGCAATACAGAAATGTACCTGATTTTCCGACAACTAGACAACAGCCGCACACGACAATTCACCCCGCATCATTTGAATTGTGTGATTTCGTCCGTGTACGAGGGTACAAGAGACGGAGTTGGAGCCGCACCGTCGTACCGTACTAAAAGGGAGAACATTGCTGATTGTCAAGAGGAAGCAGTTGTCAATGCAGCCAATCCACTGGGCAGACCAGGAGAAGGAGTCTGCCGTGCCATCTATAAACGTGGGCCGAACAGTTTCACCGATTCAGCCACAGAGACAGGCACCGCAAAACTGACTGTGTGCCAAGGAAAGAAAGTGATCCACGTGGTTGGCCCTGATTTCCGGAAACACCCAGAGGCAGAAGCCCTGAAATTGCTGCAAAACGCCTACCATGCAGTGGCAGACTTAGTAAATGAACATAATATCAAGTCTGTCGCCATCCCATTGCTATCTACAGGCATTTACGCAGCCGGAAAAGACCGCCTTGAGGTATCACTTAACTGCTTGACAACCGCGCTAGACAGAACTGATGCGGACGTAACCATCTACTGCCTGGATAAGAAGTGGAAGGAAAGAATCGACGCGGTGCTCCAACTTAAGGAGTCTGTAACTGTGCTGAAGGATGAGGATATGGAGATCGACGACGAGTTAGTATGGATCCATCCGGACAGTTGCCTGAAGGGAAGACAGGGATTCAGTACTACAAAAGGAAAGTTGTATTCGTACTTTGAAGGCACCAAATTCCATCAAGCAGCAAAAGATATGGCGGAGATAAAGGTCCTGTTCCCAAATGACCAGGAAAGCAACGAACAACTGTGTGCCTACATATTGGGGGAGACCATGGAAGCAATCCGCGAAAAATGCCCGGTCGACCACAACCCGTCGTCTAGCCCGCCAAAAACGCTGCCGTGCCTCTGTATGTATGCCATGACGCCAGAAAGGGTCCACAGACTCAGAAGCAATAACGTTAAAGAAGTTACAGTATGCTCCTCCACCCCCCTTCCAAAGTACAAAATCAAGAATGTTCAGAAGGTTCAGTGCACAAAAGTAGTCCTGTTTAACCCGCATACCCCCGCATTCGTTCCCGCCCGTAAGTACATAGAAGCACCAGAACAGCCTGCAGCTCCGCCTGCACAGGCCGAGGAGGCCCCCGGAGTTGTAGCGACACCAACACCACCTGCAGCTGATAACACCTCGCTTGATGTCACGGACATCTCACTGGACATGGAAGACAGTAGCGAAGGCTCACTCTTTTCGAGCTTTAGCGGATCGGACAACTCTATTACTAGTATGGACAGTTGGTCGTCAGGACCTAGTTCACTAGAGATAGTAGACCGAAGGCAGGTGGTGGTGGCTGACGTCCATGCCGTCCAAGAGCCTGCCCCTGTTCCACCGCCAAGGCTAAAGAAGATGGCCCGCCTGGCAGCGGCAAGAATGCAGGAAGGGCCAACTCCACCGGCAAGCACCAGCTCTGCGGACGAGTCCCTTCACCTTTCTTTTGATGGGGTATCTATGTCCTTCGGATCCCTTTTCGACGGAGAGATGGTCCGCTTGGCAGCGGCACAACCCCCGGCAACATGCCCTACGGATGTGCCTATGTCTTTCGGATCGTTTTCCGACGGAGAGATTGAGGAGTTGATCCGCAGAGTAACCGAGTCGGAGCCCGTCCTGTTTGGGTCATTTGAACCGGGCGAAGTGAACTCAATTATATCGTCCCGTTCAGCCGTATCTTTTCCACCACGCAAGCAGAGACGTAGACGCAGGAGCAGGAGGACCGAATACTGACTAACCGGGGTAGGTGGGTACATATTTTCGACGGACACAGGCCCTGGGCACTTGCAAAAGAAGTCCGTTCTGCAGAACCAGCTTACAGAACCGACCTTGGAGCGCAATGTTCTGGAAAGAATCTACGCCCCGGTGCTCGACACGTCGAAAGAGGAACAGCTCAAACTCAGGTACCAGATGATGCCCACCGAAGCCAACAAAAGCAGGTACCAGTCTCGAAAAGTAGAAAACCAGAAAGCCATAACCACTGAGCGACTGCTTTCAGGGCTACGACTGTATAACTCTGCCACAGATCAGCCAGAATGCTATAAGATCACCTACCCGAAACCATCGTATTCCAGCAGTGTACCAGCTAACTACTCTGACCCAAAGTTTGCTGTAGCTGTTTGTAACAACTATCTGCATGAGAATTACCCGACGGTAGCATCTTATCAGATCACCGACGAGTACGATGCTTACTTGGATATGGTAGACGGGACAGTCGCTTGCCTAGATACTGCAATTTTTTGCCCCGCCAAGCTTAGAAGTTACCCGAAAAGACACGAGTATAGAGCCCCAAACATCCGCAGTGCGGTTCCATCAGCGATGCAGAACACGTTGCAAAACGTGCTCATTGCCGCGACTAAAAGAAACTGCAACGTCACACAAATGCGTGAACTGCCAACACTGGACTCAGCGACATTCAACGTTGAATGCTTTCGAAAATATGCATGCAATGACGAGTATTGGGAGGAGTTTGCCCGAAAGCCAATTAGGATCACTACTGAGTTCGTTACCGCATACGTGGCCAGACTGAAAGGCCCTAAGGCCGCCGCACTGTTCGCAAAGACGCATAATTTGGTCCCATTGCAAGAAGTGCCTATGGATAGATTCGTCATGGACATGAAAAGAGACGTGAAAGTTACACCTGGCACGAAACACACAGAAGAAAGACCGAAAGTACAAGTGATACAAGCCGCAGAACCCCTGGCGACCGCTTACCTATGCGGGATCCACCGGGAGTTAGTGCGCAGGCTTACAGCCGTTTTGCTACCCAACATTCACACGCTCTTTGACATGTCGGCGGAGGACTTTGATGCAATCATAGCAGAACACTTCAAGCAAGGTGACCCGGTACTGGAGACGGATATCGCCTCGTTCGACAAAAGCCAAGACGACGCTATGGCGTTAACCGGCCTGATGATCTTGGAAGACCTGGGTGTGGACCAACCACTACTCGACTTGATCGAGTGCGCCTTTGGAGAAATATCATCCACCCATCTGCCCACGGGTACCCGTTTCAAATTCGGGGCGATGATGAAATCCGGAATGTTCCTCACGCTCTTTGTCAACACAGTTCTGAATGTCGTTATCGCCAGCAGAGTATTGGAGGAGCGGCTTAAAACGTCCAAATGTGCAGCATTTATCGGCGACGATAACATTATACACGGAGTAGTATCTGACAAAGAAATGGCTGAGAGGTGTGCCACCTGGCTCAACCTGGAGGTTAAGATCATTGACGCAGTCATCGGCGAGAGACCACCTTACTTCTGCGGTGGATTCATCTTGCAAGATTCGGTTACCTCCACAGCGTGTCGCGTGGCGGACCCCTTGAAAAGGCTGTTTAAGTTGGGTAAACCGCTCCCAGCCGACGACGAGCAAGACGAAGACAGAAGACGCGCTCTGCTAGATGAAACAAAGGCGTGGTTTAGAGTAGGTATAACAGACACCTTAGCAGTGGCCGTGGCAACTCGGTATGAGGTAGACAACATCACACCTGTCCTGCTGGCATTGAGAACTTTTGCCCAGAGCAAAAGAGCATTTCAAGCCATCAGAGGGGAAATAAGGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACCACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCAGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGATGCCTGCCCGCAATGGGCTGGCTTCCCAAATCCAGCAACTGACCACAGCCGTCAGTGCCCTAGTCATTGGACAGGCAACTAGACCTCAAACCCCACGCCCACGCCCGCCGCCGCGCCAGAAGAAGCAGGCGCCAAAGCAACCACCGAAGCGGAAGAAACCAAAAACACAGGAGAAGAAGAAGAAGCAACCTGCAAAACCCAAACCCGGAAAGAGACAGCGTATGGCACTTAAGTTGGAGGCCGACAGACTGTTCGACGTAAAAAATGAGGACGGAGATGTCATCGGGCACGCACTGGCCATGGAAGGAAAGGTAATGAAACCTCTCCACGTGAAAGGAACTATTGACCACCCTGTGCTATCAAAGCTCAAATTCACCAAGTCGTCAGCATACGACATGGAGTTCGCACAGTTGCCGGTCAACATGAGAAGTGAGGCGTTCACCTACACCAGTGAACACCCTGAAGGGTTCTACAACTGGCACCACGGAGCGGTGCAGTATAGTGGAGGCAGATTTACCATCCCCCGCGGAGTAGGAGGCAGAGGAGACAGTGGTCGTCCGATTATGGATAACTCAGGCCGGGTTGTCGCGATAGTCCTCGGAGGGGCTGATGAGGGAACAAGAACCGCCCTTTCGGTCGTCACCTGGAATAGCAAAGGGAAGACAATCAAGACAACCCCGGAAGGGACAGAAGAGTGGTCTGCTGCACCACTGGTCACGGCCATGTGCTTGCCTGGAAACGTGAGCTTCCCATGCAATCGCCCGCCCACATGCTACACCCGCGAACCATCCAGAGCTCTCGACATCCTCGAAGAGAACGTGAACCACGAGGCCTACGACACCCTGCTCAACGCCATATTGCGGTGCGGATCGTCCGGCAGAAGTAAAAAAAAAAGCGTCACTGACGACTTTACCTTGACCAGCCCGTACTTGGGCACATGCTCGTACTGTCACCATACTGAACCGTGCTTTAGCCTGATTAAGATCGAGCAGGTCTGGGATGAAGCGGACGACAACACCATACGCATACAGACTTCCGCCCAGTTTGGATACGACCAAAGCGGAGCAGCAAGCTCAAATAAGTACCGCTACATGACGCTCGAGCAGGATCATACTGTCAAAGAAGGCACCATGGATGACATCAAGATCAGCACCTCAGGACCGTGTGGAAGGCTTAGCTACAAAGGATACTTTCTCCTCGCGAAGTGTCCTCCAGGGGACAGCGTAACGGTTAGCATAGCGAGTAGCAACTCAGCAACGTCATGCACAATGGCCCGCAAGATAAAACCAAAATTCGTGGGACGGGAAAAATATGACCTACCTCCCGTTCACGGTAAGAAGATTCCTTGCACAGTGTACGACCGTCTGAAAGAAACAACCGCCGGCTACATCACTATGCACAGGCCGGGACCGCACGCCTATACATCCTATCTGAAGGAATCATCAGGGAAAGTTTACGCGAAGCCACCATCCGGGAAGAACATTACGTACGAGTGCAAGTGCGGCGATTACAAGACCGGAACCGTTACGACCCGTACCGAAATCACGGGCTGCACCGCCATCAAGCAGTGCGTCGCCTATAAGAGCGACCAAACGAAGTGGGTCTTCAACTCGCCGGACTCTATCAGACACGCCGACCACACGGCCCAAGGGAAATTGCATTTGCCTTTCAAGCTGATCCCGAGTACCTGCATGGTCCCTGTTGCCCACGCGCCGAACGTAGTACACGGCTTTAAACACATCAGCCTCCAATTAGACACAGACCATCTGACATTGCTCACCACCAGGAGACTAGGGGCAAACCCGGAACCAACCACTGAATGGATCATCGGAAAGACGGTTAGAAACTTCACCGTCGACCGAGATGGCCTGGAATACATATGGGGCAATCACGAACCAGTAAGGGTCTATGCCCAAGAGTCTGCACCAGGAGACCCTCACGGATGGCCACACGAAATAGTACAGCATTACTATCATCGCCATCCTGTGTACACCATCTTAGCCGTCGCATCAGCTGCTGTGGCGATGATGATTGGCGTAACTGTTGCAGCATTATGTGCCTGTAAAGCGCGCCGTGAGTGCCTGACGCCATATGCCCTGGCCCCAAATGCCGTGATTCCAACTTCGCTGGCACTTTTGTGCTGTGTTAGGTCGGCTAATGCTGAAACATTCACCGAGACCATGAGTTACTTATGGTCGAACAGCCAGCCGTTCTTCTGGGTCCAGCTGTGTATACCTCTGGCCGCTGTCATCGTTCTAATGCGCTGTTGCTCATGCTGCCTGCCTTTTTTAGTGGTTGCCGGCGCCTACCTGGCGAAGGTAGACGCCTACGAACATGCGACCACTGTTCCAAATGTGCCACAGATACCATATAAGGCACTTGTTGAAAGGGCAGGGTACGCCCCGCTCAGTTTGGAGATTACTGTCATGTCCTCGTAGGTTTTGCCTTCCACCAACCAAGAGTACATCACCTGCAAATTCACCACTGTGGTCCCCTCCCCTAAAGTCAGATGCTGCGGCTCCTTGGAATGTCAGCCCGCGGCTCACGCAGATTATACCTGCAAGGTCTTTGGAGGGGTGTACCCCTTCATGTGGGGAGGAGCACAATGTTTTTGCGACAGTGAGAACAGCCAGATGAGTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAGCAGATTGCGCGACTGACCACGCGCAGGCGATTAAGGTGCATACTGCCGCGATGAAAGTAGGACTGCGTATAGTGTACGGGAACACTATCAGTTTCCTAGATGTGTACGTGAACGGAGTCACACCAGGAACGTCTAAAGACCTGAAAGTCATAGCTGGACCAATTTCAGCATTGTTTACACCATTCGATCACAAGGTCGTTATCCATCGCGGCCTGGTGTACAACTATGACTTTCCGGAATACGGAGCGATGAAACCAGGAGCGTTTGGAGACATTCAAGCTACCTCCTTGACTAGCAAAGACCTCATCGCCAGCACAGATATTAGGCTACTCAAGCCTTCCGCCAAGAACGTGCATGTCCCGTACACGCAGGCCGCATCTGGATTCGAGATGTGGAAAAACAACTCAGGCCGCCCACTGCAGGAAACCGCCCCTTTTGGGCGCAAGATTGCAGTCAATCCGCTTCAGGCGGTGGACTGCTCATACGGGAACATTCCCATCTCTATTGACATCCCGAACGCTGCCTTTATCAGGACATCAGATGCACCACTGGTCTCAACAGTCAAATGTGATGTCAGTGAGTGCACTTATTCAGCGGACTTCGGCGGGATGGCTACCCTGCAGTATGTATCCGACCGCGAAGGACAATGCCCTGTACATTCGCATTCGAGCACAGCAACCCTCCAAGAGTCGACAGTTCATGTCCTGGAGAAAGGAGCGGTGACAGTACACTTCAGCACCGCGAGCCCACAGGCAAACTTCATTGTATCGCTGTGTGGTAAGAAGACAACATGCAATGCAGAATGCAAACCACCAGCTGATCATATCGTGAGCACCCCGCACAAAAATGACCAAGAATTCCAAGCCGCCATCTCAAAAACTTCATGGAGTTGGCTGTTTGCCCTTTTCGGCGGCGCCTCGTCGCTATTAATTATAGGACTTATGATTTTTGCTTGCAGCATGATGCTGACTAGCACACGAAGATGACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGCAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAACTGATGTGCATAATGCATCAGGCTGGTATATTAGATCCCCGCTTACCGCGGGCAATATAGCAACACCAAAACTCGACGTATTTCCGAGGAAGCGCAGTGCATAATGCTGCGCAGTGTTGCCAAATAATCACTATATTAACCATTTATTCAGCGGACGCCAAAACTCAATGTATTTTTGAGGAAGCATGGTGCATAATGCCATGCAGCGTCTGCATAACTTTTTATTATTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAACATTTC
2.一种YN87448病毒毒株全基因组序列的克隆方法，其特征在于它包括(1)病毒的培养及纯化；(2)病毒RNA的提取；(3)病毒RNA的逆转录；(4)病毒基因序列扩增引物的设计与合成；所述的引物是选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物；引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二碱基，引物扩增片段一般不超过1.4Kb。(5)目的基因的PCR扩增，将全基因分为多个片段分别护增克隆测序，其中包括病毒3’端基因序列的扩增，病毒基因结构区非结构区的扩增；病毒基因5’端的序列测定；(6)目的基因片段回收；(7)将目的基因片段克隆上述PCR片段与pGEM-T载体连接；(8)感受态细胞的制备(9)连接产物的转化(10)双链模板的提取及序列测序。
3.根据权利要求2所述的YN87448病毒毒株全基因组序列的克隆方法，其特征在于所述的全基因分为15个片段，所述病毒基因序列扩增引物为F1-205′-att ggc ggc gta gta cac ac-3′R1063-10485′-ata tac gtg cac acg g-3′F1006-10235′-gca aag tta ccg ata cag-3′R1974-19915′-gta cag ctt gcg gtt cac-3′F1898-19145′-agg aag tgc cgt acc at-3′R2987-30015′-acg tta gtg agc tgc -3′F2934-29505′-cgc act gag gac agg ct-3′R3892-39085′-ctc act att gcg gtc gg-3′F3727-37435′-cgc agg cac ggt acg ac-3′R4850-48675′-cta gac gac ggg ttg tgg-3′F4780-47975′-gca acg aac aac tgt gtg -3′R5810-58265′-cca gaa cat tgc gct cc-3′F5782-57995′-tgc aga acc agc tta cag-3′R6825-68405′-tat ccg tct cca gta c-3′F6795-68135′-ata gca gaa cac ttc aag c-3′R8494-85135′-ttc gag gat gtc gag agc tc-3′F junction5′-att tag gac cac cgt aga gat-3′R8494-85135′-ttc gag gat gtc gag agc tc-3′F8430-84465′-ttg ctt gga aac gtg ag-3′R9595-96105′-gca tag acc ctt act g-3′F8462-84725′-cgc tcg agc gcc cca cat-3′R9570-95845′-cgc tcg agc gcc cca cat-3′F9552-95695′-gtc gac cga gat ggc ctg-3′R10746-107995′-gca gtg ggc ggc ctg agt-3′F10702-107195′-cca aga acg tgc atg tcc-3′R11645-116635′-gaa atg tta aaa aca aaa t-3′
全文摘要
一种YN87448病毒毒株全基因组序列及其克隆方法,该克隆方法将全基因分15片段,用RT－PCR方法扩增相应cDNA,连入pGEM－T载体,利用通用引物测序,在病毒基因序旬扩增引物设计上,选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物,引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基,本发明从分子水平阐明了本病毒与其他流行株的差异,对了解病毒的来源进化过程及分子流行病学有重要意义。也表明:它是预防辛德毕斯脑炎流行的最佳制备疫苗的候选株。
文档编号C07H21/00GK1252445SQ9812069
公开日2000年5月10日 申请日期1998年10月27日 优先权日1998年10月27日
发明者梁国栋, 周国林, 李蕾, 付士红, 金奇, 张海林, 黄文丽, 侯云德 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所