专利名称：单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物的制作方法
相关申请的交叉参考本申请是1997年4月1日提交的共同未决的专利申请序号08/831,073的继续部分申请。
背景技术：
化合物单磷酰基脂质A(MLA)和3-O-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MLA)是减毒的细菌脂多糖(LPS)的脂质A衍生物。LPS和脂质A是在给予这些化合物的病人中诱导体液抗体反应和细胞介导的免疫应答的有力的免疫刺激剂。然而，脂质A和LPS也可表现出毒性副作用如引起发热和局部Shwarzman反应。MLA和3D-MLA是已得到修饰以减轻LPS毒性的脂质A样分子。
象脂质A，MLA和3D-MLA分子具有一个上面带有长链脂肪酸的糖主链。主链包括糖甙键连接的两个六碳糖环。MLA和3D-MLA在4位磷酸化。5-8个长链脂肪酸(12-14碳)结合在糖主链上使MLA和3D-MLA成为强疏水分子，不易溶于水。
减毒的脂质A衍生物(ALD)MLA和3D-MLA用作感染性疾病的预防疫苗和治疗癌性肿瘤和慢性感染的治疗性疫苗中的免疫佐剂。大多数疫苗中所含的抗原制品经常是水溶性蛋白的复杂的混合物使得不溶于水的佐剂难以配制在水性疫苗制剂中。因此，在加入抗原制品水前，MLA和3D-MLA必须先与溶剂混合。然而，溶剂的存在可能使疫苗制剂进一步复杂化，并且，在某些情况下降低其成分的有效性。另外，溶剂可能刺激粘膜表面或者在注射位点引起炎症。含有非干扰性的共同溶剂的MLA或3D-MLA的简单制剂可获得来自疫苗组合物中的佐剂和抗原的最大好处，本发明满足了这一需要。
发明概述本发明涉及减毒的脂质A衍生物(ALD)和表面活性剂的水性制剂及其制备方法。根据本发明，有用的减毒脂质A的衍生物包括单磷酰基脂质A(MLA)和3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MLA)。MLA的水性制剂(MLA/AF)或3D-MLA的水性制剂(3D-MLA/AF)，改变了对用于疫苗制备的不良溶剂或共同溶剂系统的需要。本发明提供ALD和表面活性剂的稳定水性组合物，当与抗原一起施用于小鼠时，加强动物对该抗原的细胞和体液免疫应答。令人吃惊地，当鼻内给药时，本发明的水性制剂诱发免疫动物中高水平的血清和粘膜分泌的IgA。要求专利保护的水性组合物的实施方案包括约4∶1的MLA或3D-MLA与表面活性剂的摩尔比并具有约50-70nm的颗粒大小。1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)是优选的表面活性剂。
本发明公开了制备水性组合物的方法。在一种实施方案中，溶解ALD和表面活性剂并在乙醇中均匀地混合。乙醇挥发后留下一层薄膜。将水加到薄膜上。通过超声处理使ALD和表面活性剂悬浮于水中。超声处理悬浮液直至澄清。给予要求专利保护的组合物和抗原的动物表现出对此抗原的加强的体液和细胞免疫应答。本发明还公开和要求专利保护应用组合物增强这些应答的方法。
附图简述
图1a-d表示给予3-O-脱酰基单磷酰基脂质A的水性配方(3D-MLA/AF)中的破伤风类毒素(TT)抗原★或盐水中破伤风类毒素抗原◆的小鼠的抗体效价。图1a表示给予破伤风类毒素抗原的小鼠的总IgG抗体效价。图1b表示给予破伤风类毒素抗原的小鼠的IgG2a抗体效价。图1c表示给予破伤风类毒素抗原的小鼠的IgG2b的抗体效价，图1d表示动物的IgG1抗体效价。
图2表示用纯化的蛋白衍生物免疫的小鼠的T-细胞增殖反应。表示了在初次接种后14天给予3D-MLA/AF中的破伤风类毒素小鼠和正常对照组小鼠的增殖反应。
发明详述本发明涉及减毒的脂质A衍生物(ALD)的水性佐剂制剂。将ALD和表面活性剂以约4∶1的摩尔比悬浮于水中并且通过超声处理使悬浮中颗粒大小约为50-70nm。
根据本发明，减毒的脂质A衍生物可配制成水性复合物以提供有力的佐剂。减毒的脂质A衍生物是表现脂质A有利的免疫刺激性质但较少表现出该化合物的不良副作用的脂质A样化合物。例如，单磷酰基脂质A(MLA)和3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MLA)是强力的免疫刺激物但比脂质A毒性小得多的ALD。MLA和3D-MLA可用于本发明的组合物中，这是已知的并不需在此详细描述。见例如，于1984年3月13日授予的转让给Ribi ImmunoChem Research，Inc.的美国专利序号4,436,727公开了单磷酰基脂质A及其制备。也是转让给Ribi ImmunoChem Research，Inc.的美国专利号4,912,094和Myers等的再审查证书BI4,912,094包括3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A及其制备。涉及MLA和3D-MLA的每一这些专利的公开内容在此引入作为参考。
不探究引入作为参考的以前专利的细节，在此所用的单磷酰基脂质A(MLA)来源于脂质A，大肠杆菌脂多糖的一种成分，是强力但高度毒性的免疫系统调节剂。Edgar Ribi和他的同事实现了起初称为精制去毒内毒素的单磷酰基脂质A(MLA)的生产。通过在中等强度无机酸溶液(如0.1 HCl)中回流从革兰氏阴性细菌无庚糖突变体获得的内毒素提取物(LPS或脂质A)约30分钟来生产MLA。这种处理导致还原末端葡萄糖胺的位置1处磷酸部分的丢失。
同时，这种处理中，从非还原葡萄糖胺的位置6去除核心糖。结果产物(MLA)表现出明显减轻的正常与内毒素起始物质相关的内毒素活性如热原性、局部Shwarzman反应性和如鸡胚50％致死量分析(CELD50)中测定的毒性。然而，出予预料地保留了脂质A和LPS作为免疫调节剂的功能。
另外一种可能用于本发明实施的减毒脂质A衍生物称为3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MLA)。已知3D-MLA如美国专利序号4,912,094，再审查证书B1 4,912,094(′094专利)中所述的，并且与MLA不同，因为它是在不对其它基团造成不利影响的条件下，从MLA分子选择性去除在位置3与还原末端葡萄糖胺相连的酯的β-羟基肉豆蔻基酰基残基。3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A可从RiBiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Montana 59840获得。
MLA和3D-MLA分子是多种带有不同脂肪酸链长度的脂肪酸取代形式即十七碳酰基、十六碳酰基和十五碳酰基等的复合物或混合物。因此，本发明包括MLA和3D-MLA的多种形式。而且本发明包括合成或半合成方法产生的化合物的混合物形式和单独化合物。--094专利中描述的脂质A的主链与从明尼苏达沙门氏菌R595通过十七碳酰基脂质A3-脱酰基作用获得的产物相一致。此公开内容中包括其它脂肪酸取代类型；基本特征是该物质是3-O-脱酰基的。
用于本发明的修饰的3D-MLA的制备是通过在导致脂质A主链的位置3单个脂肪酸丢失的条件下将MLA进行碱水解。在碱性介质中，位置3的β-羟基肉豆蔻基脂肪酸异常地不稳定。仅需温和的碱处理就可使脂质A完全达到3-脱酰基。其它脂质A的酯键需要在水解发生前某种更强烈的条件以致于在不明显影响分子的其它部分的情况下选择性地使位置3的部分脱酰基。目前不清楚位置3的酯连接的β-羟基肉豆蔻基脂肪酸对碱性介质的异常敏感性的原因。
尽管已知碱性水解方法，选择除了水解在位置3的β-羟基肉豆蔻基的酯键以外不引起进一步水解的条件是重要的。通常水解可在水性或有机介质中进行。后一种情况下，溶剂包括甲醇(乙醇)、二甲基亚砜(DMSO)。二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿、二氯甲烷等以及它们的混合物。也可联合应用水和一种或多种上而提取的有机溶剂。
碱性基质可选自多种氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐和胺。举例的碱包括无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等，有机碱如烷基胺，并且包括但不局限于二乙胺、三乙胺等。
在水性介质中pH值典型地在约10-14之间，pH值约12-13.5是优选的范围。典型地，水解反应在约20℃-80℃的温度下进行，优选在约50-60℃下反应约10-30分钟。例如，水解可在室温(22℃-25℃)下3％三乙胺水溶液中进行48小时。选择水解温度和时间的唯一要求是使脱酰基作用发生以便仅在位置3去除β-羟基肉豆蔻基。
实践中，已发现特别有利的水解方法，包括将脂质A或单磷酰基脂质A溶解于氯仿∶甲醇2∶1(v/v)中，用含有0.5M Na2CO3的水性缓冲液在pH10.5饱和此溶液，然后在45℃-50℃真空机或吸气器(约100mHg)下迅速蒸发溶剂。得到的物质在位置3选择性地脱酰基。这一过程也可用上面所列的任一种无机碱进行。在某些情况下，在用水性缓冲液饱和之前向有机溶液中加入相转移催化剂如四丁基溴化铵是可取的。
制备本发明的组合物中，一般地，将减毒的脂质A衍生物(ALD)与每种溶解于溶剂中的表面活性剂相混合。溶剂挥发后留下一薄膜。在薄膜上加水并且在加热得到的悬浮液的同时进行超声处理直至澄清。最终悬浮液具有约40-150nm并且优选地约50-70nm的颗粒大小。
ALD与表面活性剂以约10份ALD比约1到5份表面活性剂的摩尔比相混合。优选地，成分以约4份ALD比1份表面活性剂的摩尔比相混合。根据本发明有用的表面活性剂包括但不限于胆汁盐、天然磷脂和鞘脂。在要求专利保护的组合物中胆汁盐如甘氨脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐可用作表面活性剂。其它合适的表面活性剂包括鞘脂如鞘磷脂和鞘氨醇及磷脂如卵磷脂、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或它们的混合物。优选的实施方案中，磷脂1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)是表面活性剂。DPPC用于人是可接受的并且当制剂是鼻内给药时尤其有效。
将ALD和表面活性剂溶解于溶剂是并彻底混合。根据本发明有用的水性或有机溶剂包括氯仿、醇(如乙醇)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等及它们的混合物。
将溶剂从ALD和表面活性剂的混合物蒸发掉并留下一层薄膜。将水加到薄膜上并在加热得到的悬浮液的同时进行超声处理直至澄清。优选在水浴超声波仪中对悬浮液进行超声处理。水浴温度可为40℃-80℃，优选地约60℃。悬浮液可超声处理5分钟至约1小时直至澄清。超声处理的时间可随悬浮液的体积和浓度不同而不同但可由本领域技术人员容易地确定。最终悬浮液中颗粒大小约40-150nm并优选地约50-70nm。
将有效量的本发明组合物与抗原施用于恒温动物以增强动物对该抗原的免疫应答。本发明的组合物加强了动物对抗原的体液免疫应答以及细胞免疫应答。所给予的激发期望的应答的抗原的量可由本领域技术人员容易地确定并且将随所给的抗原类型，给药途径和免疫时间表的不同而不同。两次免疫分别21天皮下给小鼠1μg破伤风类毒素及要求专利保护的组合物激发对该抗原的体液免疫应答。当鼻内给药时，本发明的组合物和抗原刺激细胞毒性T-淋巴细胞的产生。在0天和21天鼻内给予要求专利保护的组合物中的乙型肝炎表面抗原(2.5μg)刺激了免疫的动物体内细胞毒性T-淋巴细胞的产生。而且，当鼻内给药时，本发明的组合物在激发免疫动物的IgA反应中特别有效。给予0.5-12.5μg的3-O-脱酰基单磷酰基脂质A的水性制剂中的破伤风类毒素的小鼠表现出对该抗原增高的IgA效价。本发明的组合物的有效量是可刺激或增强免疫应答的量。例如，申请专利的组合物的有效量可含有1到约250μg减毒脂质A衍生物并且以典型的70kg成年病人为基础的给药优选地约25-50μg。
提供下面的实施例以进一步说明但不限制本发明的组合物和方法。应理解的是在此提供的小鼠模型是恒温动物的代表并且与其它恒温动物的情况包括人合理地相关。除非另有说明，所有百分比是重量百分比且所有溶剂混合物比例为体积比。实施例1-减毒的脂质A衍生物的水性制剂的制备根据本发明，注射用水中含有1000μg/ml来自明尼苏达沙门氏菌R595的减毒的脂质A形式的3D-MLA(RiBi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Montana 59840)和118μg/ml的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)的3-O-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MLA/AF)的水性制剂的制备如下将DPPC溶解于乙醇使其浓度为4mg/ml并旋转使其澄清。将2.7mlDPPC溶液加到含有100mg冻干的3D-MLA的小瓶中并轻轻旋动以湿润3D-MLA。轻轻向小瓶中吹入过滤的氮气以去除乙醇。向小瓶中加入注射用水(91.7ml)，然将小瓶塞好，封口并悬浮于Labline 9303水浴超声波仪中。60℃超声处理悬浮液10分钟直至澄清。用来自Malvern Instruments的PSC 1000 Spectrometer测定得到的水性制剂中含有70nm的颗粒并用0.2μm滤器过滤除菌。实施例2-抗体反应的刺激作用用本发明水性制剂中的破伤风类毒素(TT)免疫的小鼠产生破伤风类毒素特异抗体。免疫之后用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定小鼠血清中TT特异的总IgG效价和IgG同种型(2a，2b，1)的效价。
用含有0.1μg破伤风类毒素(TT)+50μg 3D-MLA/AF或0.1μg TT与盐水的一定剂量的疫苗免疫雌性ICR小鼠。按实施例1制备3D-MLA/AF。在第0天和第21天皮下注射疫苗。第二次免疫后第14天收集血清并用标准ELISA技术测定以报导破伤风类毒素特异性抗体IgG1、IgG2a和IgG2b同种型以及总IgG的相对量。
图1表示由3D-MLA/AF产生的破伤风类毒素特异抗体效价。当与破伤风类毒素抗原一起施用时，3D-MLA/AF刺激免疫动物的IgG抗体产生并且尤其活跃地刺激IgG2a产生。实施例3-细胞增殖的刺激作用当脾细胞用该抗原处理时，通过用本发明的佐剂组合物和纯化的蛋白衍生物(PPD)(结核)菌素免疫诱导的小鼠表现出体外增殖反应。
通过用一定剂量的含有50μg PPD+50μGg3D-MLA/AF的疫苗皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠。按实施例1制备3D-MLA/AF。免疫后14天收集脾细胞并作为增殖测定中淋巴细胞的来源。在微量滴定孔中，脾细胞以106个细胞/ml密度在含有0.1、1或10μg PPD/ml的培养液中培养96小时。培养的最后24小时向培养物中加入氚标记的胸腺嘧啶。在玻璃纤维滤纸上收集细胞并测定氚的掺入。刺激指数由用PPD刺激的细胞的每分钟计数(CPM)除以单纯培养液中的培养细胞的CPM而定。得到的数据见图2。实施例4-细胞毒性T-淋巴细胞反应的刺激作用用细胞毒性测定法检测给予本发明的水性佐剂组合物和蛋白抗原之后的细胞毒性T-淋巴细胞反应的诱导。用配制在3D-MLA/AF中的25μg卵白蛋白(OVA)皮下注射(腹股沟)给多组C57/BL/6小鼠进行首次免疫。如实施例1制备3D-MLA/AF。注射体积为200μl。21天后每实验组的3只小鼠被杀检并且摘取脾脏，制成单细胞悬浮液并计数。
将来自实验组的脾细胞(3-4ml培养液中75×106个细胞)置于25cm2T-培养瓶中。然后，将1.0ml的5×106/ml的辐射的(20,000拉德)E.G7(OVA)细胞加入培养瓶中。使体积达到10ml。将培养瓶直立于37℃、5％CO2培养箱中培养4天。第4天从培养瓶中取出存活细胞，洗一次，重悬于5.0ml中并且计数。将复原的效应细胞的浓度调节为5×106活细胞/ml并且用100μl/孔的培养液作为稀释剂在96孔圆底培养板(Corning 25850)的孔中将100μl体积连续稀释三次。然后，将1×105细胞/ml的100μl体积的51Cr标记的(见下面)靶细胞〔E.G7(OVA)-卵白蛋白基因转染的EL-4细胞系〕加到孔中。自发释放(SR)孔含有100μl靶细胞和100μl培养液。最大释放(MR)孔含有100μl靶细胞和100μl去污剂(2％Tween 20)。效应细胞/靶细胞(E/T)比为50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1。400×g离心培养板并在37℃、5％CO2下培养4小时。培养之后，用Skatron上清收集系统收集上清液。
按下面用51Cr(铬酸钠)标记靶细胞即E.G7(OVA)。在15ml的圆锥形试管中将总体积为1.0ml的5×106靶细胞和250μCi51Cr混和。细胞悬浮液在37℃水浴中培养90分钟，并每隔15分钟轻轻混合。培养之后，通过离心并用15ml培养液倾析洗标记的细胞3次。第三次离心之后将细胞重悬于10ml新鲜培养液中并将其置于室温中30分钟，然后离心。最终细胞重悬于培养液中，密度为1×105细胞/ml。细胞毒性测定的结果见表1。
表1
*磷酸缓冲盐水实施例5-水性ALD制剂鼻内给药的抗体反应的刺激鼻内给予3D-MLA/AF中的破伤风类毒素(TT)的小鼠产生的血清和粪便提取物中都可检测到IgA效价。而且，鼻内给予本发明的水性制剂和TT产生IgG同种型IgG2a和IgG2b的高效价。
鼻内给多组ICR小鼠磷酸缓冲盐水(PBS)中的或与25μg 3D-MLA/AF混合的0.5、2.5、10或12.5μg破伤风类毒素。小鼠在0天首次接触抗原，在第10天取血(d10P1°)，在第14天加强免疫，第24天取血(d10P2°)，在第28天加强，在第38天取血(d10P3°)。用ELISA测定每次取血的混合血清的IgG和IgA特异的抗-破伤风类毒素抗体。在第22天(d7P2°)检查粪便提取液。免疫的小鼠的血清IgG和IgA效价见于表2-5中所示。
表2
>*n＝4表3表2中来自d10P3°取血的血清IgG同种型分析
<p>表4
*给予10μg破伤风类毒素表5表4中d10P3°取血的血清IgG同种型分析
实施例6-通过水性ALD制剂的鼻内给药刺激对乙型肝炎表面抗原的免疫反应鼻内给予小鼠本发明的组合物中的乙型肝炎表面抗原(HBSAG)产生对该抗原的血清IgG和IgA效价。在阴道洗液中检测分泌的IgA并用细胞毒性测定检测细胞毒性T-淋巴细胞反应的诱导。
鼻内用20μl的2.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF对多组Balb/C小鼠进行初次免疫(1°)。按实施例1制备3D-MLA/AF。21天后鼻内给小鼠20μl的7.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF进行第二次免疫(2°)。第二次免疫之后第28天用与第二次免疫相同的组合物进行第三次免疫(3°)。第二次免疫之后16天(d16，2°之后)及第三次免疫之后第8天(d8，3°之后)进行测定以检测细胞毒性T-淋巴细胞活性。在第二次免疫之后第22天(d22，2°之后)和第三次免疫之后第21天(d21，3°之后)评估血清和粘膜抗体效价。所有的测定按本领域标准方法进行并且在前面实施例2和4中有描述。此实验的结果见表6-8。
表6<
>表7<
>用2.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF鼻内免疫多组Balb/C小鼠并在21天后用7.5μg HBsAg+10μg 3D-MLA/AF鼻内给药加强免疫。加强免疫之后第10天收集阴道样品。
表8
本发明组合物中的HBsAg的鼻内给药刺激对该抗原的体液和细胞免疫应答。用配制在3D-MLA/AF的抗原鼻内免疫诱导细胞毒性T-淋巴细胞反应和抗原特异性体液和粘膜免疫应答。实施例7-通过水性ALD制剂的鼻内给药产生对流感的保护性免疫反应。
用含有配制在本发明组合物中的血凝素抗原的FLUSHIELD流感疫苗鼻内免疫小鼠产生在阴道洗液中重新发现的IgG和IgA。免疫的小鼠也100％得到保护免受以后的流感攻击。
鼻内用含有0.3μg血凝素抗原(HA)+10μg 3D-MLA/AF的FLUSHIELD流感疫苗(Wyeth-Lederle)以21天的时间间隔免疫ICR小鼠3次。按实施例1制备3D-MLA/AF。在最后一次免疫之后14天收集阴道洗液。最后一次免疫之后第35天用10LD50(半数致死量)的传染性流感A/HK/68攻击小鼠并监测死亡率。
表9
实施例8-单磷酰基脂质A的组合物单磷酰基脂质A可配制成本发明的水性组合物中并可以与实施例1-7中相同的量给药以产生相似的结果。
应理解前面所述的实施例仅仅是本发明的说明。可对组合物和/或所用的方法进行某些修饰并且仍可达到本发明的目的。这些修饰可包括在要求专利保护的本发明范围之内。
权利要求
1.一种水性佐剂组合物包含减毒的脂质A衍生物和一种或多种表面活性剂。
2.权利要求1的水性佐剂组合物，其中所述减毒的脂质A衍生物选自单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
3.权利要求1的水性佐剂组合物，其中所述减毒的脂质A衍生物是单磷酰基脂质A。
4.权利要求1的水性佐剂组合物，其中所述减毒的脂质A衍生物是3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
5.权利要求1的水性佐剂组合物，其中所述的表面活性剂选自甘氨脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、鞘磷脂、鞘氨醇、卵磷脂、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或它们的混合物。
6.权利要求1的水性佐剂组合物，其中所述的表面活性剂是1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
7.权利要求1的水性佐剂组合物，其中减毒的脂质A衍生物与表面活性剂的摩尔比是从约10∶1到约10∶5。
8.权利要求1的水性佐剂组合物，其中减毒的脂质A衍生物与表面活性剂的摩尔比约为4∶1。
9.制备水性佐剂组合物的方法，包括步骤a.将一种或多种表面活性剂溶解于溶剂中；b.混合溶解的表面活性剂和减毒的脂质A衍生物以获得减毒的脂质A衍生物和表面活性剂的混合物；c.从表面活性剂和减毒的脂质A衍生物的混合物中蒸发掉溶剂；d.将水加入蒸发后的混合物以获得悬浮液；并且e.对步骤d的悬浮液加热并超声处理直至澄清。
10.权利要求9的方法，其中所述减毒的脂质A衍生物选自单磷酰基脂质A和3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
11.权利要求9的方法，其中所述减毒的脂质A衍生物是单磷酰基脂质A。
12.权利要求9的方法，其中所述减毒的脂质A衍生物是3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
13.权利要求9的方法，其中所述的表面活性剂选自甘氨脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、鞘磷脂、鞘氨醇、卵磷脂、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、L-α-磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或它们的混合物。
14.权利要求9的方法，其中所述的表面活性剂是1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
15.权利要求9的方法，其中减毒的脂质A衍生物与表面活性剂的摩尔比是从约10∶1到约10∶5。
16.权利要求9的方法，其中减毒的脂质A衍生物与表面活性剂的摩尔比约为4∶1。
17.权利要求9的方法，其中所述的溶剂选自氯仿、醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺或它们的混合物。
18.权利要求9的方法，其中所述溶剂是乙醇。
19.权利要求9的方法，其中所述悬浮液加热到约60°-约80°。
20.权利要求9的方法，其中所述悬浮液加热到约60℃。
21.权利要求9的方法，其中对所述悬浮液超声处理约5-60分钟。
22.权利要求9的方法，其中对所述悬浮液超声处理约10分钟。
23.一种增强恒温动物对能够激发动物免疫应答的蛋白抗原的免疫应答的方法，此方法包括给予该动物一种或多种蛋白抗原和有效量的含有减毒的脂质A衍生物和一种或多种表面活性剂的水性佐剂组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述减毒的脂质A衍生物选自单磷酰基脂质A和3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
25.权利要求23的方法，其中所述水性佐剂组合物是鼻内给药。
26.一种刺激恒温动物对能够激发动物免疫应答的蛋白抗原的血清和粘膜分泌型IgA反应的方法，此方法包括给予动物一种或多种蛋白抗原和有效量的含有减毒的脂质A衍生物和一种或多种表面活性剂的水性佐剂组合物。
27.权利要求26的方法，其中所述减毒的脂质A衍生物选自单磷酰基脂质A和3-O-脱酰基的单磷酰基脂质A。
28.权利要求26的方法，其中所述水性佐剂组合物是鼻内给药。
全文摘要
含有减毒的脂质A衍生物和表面活性剂的水性佐剂组合物增强恒温动物对蛋白抗原的免疫反应。根据本发明有用的减毒的脂质A衍生物包括单磷酰基脂质A和3－O－脱酰基的单磷酰基脂质A。表面活性剂和表面活性剂的混合物溶解于溶剂中。1,2－二棕榈酰基－sn－甘油－3－磷酸胆碱是优选的表面活性剂。将溶解的表面活性剂加入减毒的脂质A衍生物中以获得混合物。混合物中减毒的脂质A衍生物与表面活性剂的摩尔比约为4∶1。蒸发掉溶剂并将水加到所得的薄膜上。在60℃水浴中对悬浮液超声处理直至变得澄清。给予这种佐剂制剂的动物表现出对所给抗原增强的抗体反应并表现出增强的淋巴细胞增生和细胞毒性T－淋巴细胞反应。水性佐剂组合物和抗原的鼻内给药刺激血清和粘膜分泌的IgA的产生。
文档编号C07H13/06GK1259052SQ98804685
公开日2000年7月5日 申请日期1998年4月1日 优先权日1997年4月1日
发明者R·T·克莱恩 申请人:科里克萨有限公司