专利名称：编码早期肝发育蛋白质的基因及其在诊断和治疗肝病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及在肝发育早期分离的肽及蛋白质，及编码这些肽和蛋白质的基因，及针对这些蛋白质培养的抗体，和其在诊断和治疗肝疾病和其他病变中的应用方法。
本发明的背景在美国和其他国家，由于传染、基因缺陷或酗酒造成的晚期肝病是广泛发病和死亡的主要原因，给世界上众多人们带来很大的潜在痛苦和经济损失。此外，许多其他疾病，包括胆汁异常和血液病变，也与肝的许多功能，如铁运载，肝细胞形成，生血功能坏损有关。通常，与肝功能衰弱有关的严重疾病是几乎不治的，唯一的治疗方式是需要作肝移植。然而，从需要作肝移植患者的数量和捐献者的数量的巨大差异来看，许许多多的人们是得不到这种治疗的，这样，目前移植不是这种疾病可实施的方法。
同时，肝发育的准确性质及发育早期的肝蛋白质的作用还没有得到很好的了解。至今，还没有确定或分离出肝脏特异的生长因子，肝细胞形成的明确的分子机理仍然没有阐明。这样，一直就认为需要确定和了解在肝发育中的基因调节和表达的变化，包括确定哪些基因开启或关闭肝细胞的形成和肝的发育。因此，分离和确定出在早期肝发育中起重要作用的基因和蛋白质，对于了解在分化的肝脏中，基因调节和表达的作用是积极的，对于诊断和治疗与肝和肝功能有关的许多疾病也是有益的。
本发明的概述由此，本发明的一个目的是提供包含编码早期肝发育蛋白质，包括elf1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白质106、和praja-1肝蛋白质的核酸序列的基因。
本发明进一步的目的是提供分离和提纯的、由上述基因编码的早期发育肝蛋白质。
本发明进一步的目的是提供为早期肝发育特有的蛋白质，和从所说的蛋白质和肽中获得的肽，和从所说的蛋白质和肽中培养用作标记的抗体，用在确定这种蛋白质和肽，探测肝细胞组，及治疗肝脏疾病的方法中。
本发明进一步的目的是使用本发明的早期发育肝蛋白质，提供应用在诊断和治疗肝脏病变中的肝特异生长因子。
本发明进一步的目的是提供使用本发明的早期发育肝蛋白质，诊断和治疗晚期肝疾病的方法。
本发明进一步的目的是提供使用本发明的早期发育肝蛋白质，诊断和治疗其他肝脏病变和疾病的方法，包括癌症，衰退性神经学上的病变，贫血，和共济失调。
这些和其他目的是借助本发明实现的，本发明提供了编码涉及发育胚胎肝脏分化的各种蛋白质的基因，包括称作elf1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白质106、和praja-1的蛋白质，和一些编码早期发育肝蛋白质的其他阶段特异基因，以及它们在诊断和治疗多种肝疾病和其他病变中的应用方法。
附图简要说明本发明将以较好的具体实施作详细说明，具体实施与附图相配合，其中
图1表示依据本发明的编码liyor-1(145)蛋白质的核酸序列。
图2a表示依据本发明的编码elf-1蛋白质的核酸序列。
图2b表示依据本发明的编码elf-2蛋白质的核酸序列。
图2c表示依据本发明的编码elf-3蛋白质的核酸序列。
图3表示依据本发明的编码praja-1蛋白质的核酸序列。
图4表示依据本发明的编码pk蛋白质的核酸序列。
图5表示依据本发明的编码106蛋白质的核酸序列。
图6表示依据本发明的编码基因20的核酸序列。
图7表示依据本发明的编码基因36的核酸序列。
图8表示依据本发明的编码基因41的核酸序列。
图9表示依据本发明的编码基因112的核酸序列。
图10表示依据本发明的编码基因114的核酸序列。
图11表示依据本发明的编码基因118的核酸序列。
图12表示依据本发明的编码基因129的核酸序列。
图13表示本发明的从praja-1蛋白质获得的RING-H2基元与其他几种蛋白质的对比。
图14表示praja-1基因和其他基因在鼠染色体X上的位置。
图15表示praja-1和鼠Neurodap1蛋白质的PILEUP对比。
图16a表示依据本发明的elf蛋白质的核苷酸和氨基酸序列。
图16b表示elf3’端序列与鼠β-fordin片段和两个典型EST序列的核苷酸多种对比。
图17表示在中期妊娠发育期间，elf蛋白质mRNA的Northern印迹分析自显影图。
图18是包含用标记elf蛋白质作探针，从不同样品获取基因组DNA的9条泳道的zoo印迹分析说明。
图19-20表示半量RT-PCR，演示了elf、ss3、145在bloc和肝脏移植培养物中的表达，与HNF3β，C/FBP，α-胎儿球蛋白质和GAPDH的对比。
本发明的详细叙述依据本发明，早期发育肝蛋白质和编码它们的基因已被分离及测序，这些基因和蛋白质可用来诊断和/或治疗多种肝脏病变和其他疾病。通常，本发明是在肝脏和其他器官处于从未分化状态到分化状态的转变时的胚胎发生阶段，从对肝形成的研究中获得的。这种方式捕获了开始于普通内胚层细胞组的肝形成阶段。此外，组织分化的早期阶段与肿瘤形成和组织修复的过程密切相关，这样，依据本发明获得的分离的早期发育肝蛋白质应与晚期硬化和肝细胞癌的一些疾病，和许多其他疾病状况的诊断和治疗有关。
在对本发明的用于早期肝细胞形成的肝蛋白质进行确定和分离时，采取的第一步是“捕获”和分析早期肝形成不同阶段的基因表达，尤其是约9天到14.5天阶段在鼠中呈现的基因表达。在这方面，建立了四个胚胎肝脏cDNA文库，如在交配后10.0，11.5，12.5，14.5天的文库，以及，在一组阶段特异的相减杂交、分离后，分离肝脏限制性克隆体。正如下面更详细的说明的那样，序列分析显示这些克隆体编码一系列早期发育肝蛋白质，这些蛋白质通常是“阶段特异”的，如，它们仅仅在发育的特异阶段出现，而不在其他阶段出现，早期发育肝蛋白质包括，elf蛋白质1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白质106、和由基因20、36、41、112、114、118和129编码的蛋白质，这些本文将作进一步说明。
确定和分离发育肝蛋白质的初始方案有四个主要目的(1)建立早期胚胎肝文库；(2)用含有已知的生长因子(IGF-I，IGF-II，IGFBP2)和已知在发育肝中表达的转录激活剂(C/EBP和LFB1)的一组探针，筛查和表征这些胚胎肝文库；(3)使用这些cDNA文库进行相减杂交，通过Southern印迹杂交、测序、转录尺寸、丰富度、和组织分布等来分析随后的相减克隆体的阶段特异性；(4)使用胚胎肝移植培养物对这些相减基因进行功能鉴定。
至于本发明的主要目的，所决定的是将其集中在肝发育的四个阶段，特别集中在发育鼠的约e10天，e11天，e12天，和e14天(交配后胚胎天数)。确定的这四个阶段发育时间点，代表从未分化的中胚层/内胚层细胞，到发育完好分化的胚胎肝的肝发育阶段。这些阶段一般分为如(1)在约e9-10，在细胞极中发生变化；(2)在约e10.5-11，发生内胚层细胞向环境间质侵入和移入；(3)在约e11.5-12，假性裂片形成，肝细胞棒状体和早期窦状体一起形成；(4)在约e12.5-14.5，肝脏由生血位点和完全分化的胚胎肝细胞标记。因此，表示这些阶段的cDNA文库代表在肝细胞形成的关键时期，“捕获的”更充分表达的mRNA种类，使它们能够分离，并提供了分析肝在发育期间基因表达的变化模式的方法。
本发明的另一方面是，通过确定和分离本发明的早期发育肝蛋白质基因，和这些基因的表达，发展诊断和治疗肝病变和其他疾病的有用方法。依据对这些早期发育肝蛋白质进行的研究，很清楚地是，确定了的不同的基因和蛋白质对于肝发育的不同方面是很重要的，并可应用在适当疾病的治疗中。在胚胎形成期间，肝一般是从前肠憩室发育的，包括四种主要细胞类型第一种是肝细胞，或内胚层组；第二种是胆树状小管细胞或胆管细胞，第三种是生血细胞；第四种是Kupffer细胞/Ito细胞。这些将在下面阐述，对于依据本发明获得及分离的早期发育蛋白质，可以认为elf蛋白质是形成胆树的重要蛋白质，如反义试验所示；praja-1蛋白质显示出对铁运载的重要性，及对肝细胞形成和生血功能的重要性；liyor-1(145)和pk在Ito细胞的形成和纤维化方面表现出重要性。
由此，依据本发明，可以考虑认为elf蛋白质1-3在对疾病如，胆汁郁积，胆结石，肝堵塞，肝狭窄，原发性胆硬化，和原发性硬化胆管炎的治疗方面是很有用的。此外，蛋白质praja-1、liyor-1(145)和pk在对晚期肝疾病，缺水外胚层发育异常，肝细胞癌，和贫血，如铁粒细胞性贫血，共济失调，如脊髓小脑共济失调，和衰退性神经学上的病变，缺水外胚层发育异常，和血色沉着病的治疗方面是有用的。
进一步还发现，在结肠癌细胞组织中确定出了蛋白质praja-1，正常组织是不产生这种蛋白质的。因此，本发明提供了检测及诊断结肠癌的方法，其中，从被测试患者获取结肠细胞或组织，对这些细胞或组织进行筛查确定praja-1蛋白质存在或不存在。在结肠细胞或组织中确定praja-1可以决定细胞是否是癌细胞，因为通常在非癌结肠细胞中检测不到praja-1。
在依据本发明的cDNA文库的制备中，为了分离影响肝细胞及肝脏形成的关键的早期发育肝蛋白质，采用上述的四个发育阶段是必要的。尽管这些研究是在鼠体上进行的，但这些肝形成的各阶段对人类发育的相关性，将在下面这些研究的总结中指出(1)交配后10天(e10，34-39个体节)(人27天)在鼠体内，初级肝盲囊在妊娠第十天中出现。它是在心脏原基发育之前，在胚胎和胚胎外区域间的边界上，从在外胚层中第七天形成的前肠凹痕发育而来。在这个阶段，尽管细胞要进行胚胎肝细胞的形成，但它们性质上仍然是上皮细胞，并且在没有心脏环境间质存在的情况下，肝盲囊是不能生存的。这可能是肝细胞在未分化状态可能的最早阶段，所以，被认为是非常重要的；一些细胞分化成生血细胞，而其他细胞分化成肝细胞。因此，在λ-Unizap中建立第10.0天的文库，并且以前没有在这个阶段建立过cDNA肝文库。(2)交配后11.5天(e11.5，40-44个体节)(人32天)这个阶段的特点是肝脏的生长很快。肝胚芽形成后不久，内胚层细胞繁殖，破坏将横膈与上皮细胞分开的膈膜，使上皮细胞移入间质。e11.5的肝脏由含有成核红血球的，由大型窦状体分离的宽型肝棒状体构成。生血位点发现与肝棒状体相混合。在此阶段获得的胚胎肝在λ-gt10和λ-Zap中建立cDNA文库，其原因是，虽然这些细胞的繁殖很快，但它们仍然没有达到完全区分的胚胎阶段。(3)交配后12.5-13.0天(e12.5，人35-45天)(胚胎尺寸7-9mm)这个阶段可通过早期指发育痕迹和足板前期凹痕轻松确认。在这个阶段，肝脏发育良好，所有肝叶都清晰可见；它含有许多巨核细胞和具有红血球生成活性的细胞。在λ-gt10和λ-Zap中建立e12.5的cDNA文库，这是可以看到完全分化的胚胎肝细胞的最早阶段。(4)交配后14.5天(e14.5，人51-57天)(胚胎尺寸20-32mm)在这个阶段，单个、独立前足趾可以看到；皮肤上的毛囊也可以确认出，脐带疝非常明显。这个阶段代表了含有分散生血位点的充分分化的胚胎肝。为了与建立在λ-Unizap(stratagene)中的第十天的文库便于相减，在λ-Unizap中建立这个阶段的cDNA文库。
其中p是1-100；
其中R5、R6和R7是在链中具有至多大约100个原子的直链或支链烷基、烷氧基、烷基胺、烷基硫、亚烷基、亚烷基氧基、亚烷基胺、亚烷基硫、芳基、芳氧基或芳基硫，其链可含有为侧链的或作为链中骨架一部分的饱和或未饱和环或杂环取代基，并且，其中的任何杂原子可以或不可以直接与芳香环连接；或R5、R6和R7是具有结构-(CR12)e-[SiR42-O]f-SiR42-(CH3)g-的硅氧烷，其中R1取代基是H或具有1-5个碳原子的烷基基团，和各位置中的R4取代基独立地是具有1-5个碳原子的烷基基团或芳基基团，e是1-10和f是1-50；
<p>表2 早期胚胎肝cDNA文库和成年鼠肝文库
交配后e10.5、e11.5、e12.5、e14.5阶段的鼠的cDNA插入及成年鼠肝，在Biogel A150柱(＞500 bp)上在与载体连接前进行尺寸筛选。文库中膜动蛋白频率在表3中列出。
使用已知的发育调节cDNA对cDNA文库进行性质分析，是为了建立在发育中有意义的重要早期基因的发育结构，然后用特定数目的探针对这些文库进行筛查。下面是用作筛查这些文库的探针，包括类胰岛素生长因子I(IGFI)，得自于Dr.DerekleRoith(NIH)；类胰岛素生长因子II(IGFII)和IGFII结合蛋白质-2(BP-2)，均从Dr.Matt Rechler of NIH获得；LFB1是从EMBLin Heidelberg的Drs.Monaci，Nicosia和Cortese获得的；C/EBP探针是从New York N.Y.的Rockefeller University的Dr.Darnekk获得的。
表3 10.0、11.5和12.5天的文库的克隆频率(按双份进行)阳性cDNA克隆体/100,000 PloyA+含有cDNA的克隆体。
N.D.＝没有作数据显示在任何胚胎文库中都没有检测到IGFI，然而，从e6.5到e8.5检测到IGFII的克隆频率是增长的(在e6.5是8，在e7.5是8，在e8.5是38，数据没有给出)，在e10.0和e12.5文库中也检测到了IGFII(在e10.0是3，在e12.5是4-见表3)。IGFII在成年肝文库中没有检测到。有趣地是，在早期e6.5、e7.5、e8.5文库中，BP2的克隆频率与IGFII的克隆频率是相同的(数据没有给出)，但在肝脏cDNA文库中克隆频率是不同，在e10.0、e11.5中每100,000被检测的BP2只有一个克隆，在成年肝文库中检测到的是7，相比之下，IGFII的数据较大。这表示在胚胎和胎儿中，它的时序和空间的表达与IGFII是不同的，这一点由随后的原位研究证实。在e12.5文库中检测到了LFBI，但每100,000筛查LFBI只有一个克隆，这表示它在有丝分裂细胞中是不存在的，但从出生以后它的含量是调节并增加的。在e6.5、e7.5、e8.5和e10.0文库中没有检测到C/EBP(数据未给出)，但在e11.5和e12.5文库中突然测得低含量的C/EBP(在e11.5中约2克隆/100,000，在e12.5中约为5)，表示在胚胎阶段，虽然它被表达出来，但它的含量也是可以调节的，虽然是向下的。最后，β-膜动蛋白用作参照物所有七个文库具有相同β-膜动蛋白频率，从120克隆到300克隆/100,000，这被认为是这种胚胎文库的代表性。
接着，实施用相减法确定阶段特异克隆体，建立两个相减的文库。进行两次相减处理，产物相减文库含有64个克隆体(e11.5-e12.5)，和174个克隆体(e10.5-e14.5)。进一步对这些克隆体进行如下特性测试(1)Southern杂交；(2)测序；(3)Northern分析；(4)Zoo印迹分析；(5)蛋白质的体外翻译。
在对这些克隆体进行Southern印迹测试中，三十四个克隆体显示阶段特异性，不含线粒体的、核糖体的和球蛋白的序列。对这三十四个阶段特异性克隆体进行DNA测序，是为了确认带有与已知发育基因同源基因的克隆体(如细胞极性基因，同源框基因等)，测出对每个克隆体的前400个碱基对序列。对构成本发明的一部分的一些基因进行详细分析，包括liyor-1(145)、蛋白质106、pk、和praja-1，因为这些克隆体表现出真实的阶段特异性，并显示是属于编码信号传导蛋白质的一组基因，由于研究显示它们在细胞谱系中的重要性，所以它们在发育中是有很大影响的。依据本发明中的基因编码的其他阶段特异性蛋白质在下面作进一步阐述。对蛋白质如praja-1和elf，以及其他早期发育肝蛋白质进行的研究已阐述了这些蛋白质的序列，下面将作更详细的说明。
作为用来阐述这些肝蛋白质的发育表达的一个测试实例，测试liyor-1(145)蛋白质，用以确定在发育期间这些转录是否分化地表达，是否对中胚层或内胚层衍生来的组织特异，或在成年鼠和人的器官中表达。因此，对妊娠中期胚胎的组织进行分析，来确定在肝发育中145的作用。在这些试验中，解剖第十一天以后的组织，在这个阶段，独立的肝、心脏和其他组织可容易地解剖出来，并且随后分离的RNA质量也很好。
对使用32P标记的1.1Kb插入代表蛋白质145，使用从不同发育阶段获取的polyA RNA，在不同鼠组织内进行的与liyor-1(145)DNA的RNA杂交试验进行研究。在145含量稳定的情况下，通过测量膜动蛋白的相对量，来测定发育改变的特异性。在高度严谨冲洗下显示了2.2kb转录。对每条带的光密度扫描显示，145的最大表达出现在肝和心脏中，在其他组织中的表达要少些，但在第十一天特异性地表达，在第12.5和第14.5天量减少(1-2月后Northerns显影)。
对在成年组织中的蛋白质145RNA的分布，和在进展中它的保留状况作进一步特征检测，涉及成年鼠和人类组织的RNA分析。蛋白质145与成年肝、肾和睾丸杂交，在肝和肾中为2.4Kb转录体，在睾丸中为2.6Kb转录体，其丰富度很低这两个印迹在胶片上于-70℃曝光一个月后显影。对elf蛋白质和编码它的核酸作同样的试验，显示elfDNA通常保留在许多不同的物种中，包括人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，鸡，和酵母，在所有研究的物种中，除了兔子，都表现出了elf DNA。
最后，依据本发明，为了在实验室中建立鼠胚胎肝移植培养物，对相减基因建立了功能性测定，这个试验通常被认为是反义试验的主要障碍，原因是由于在第9.5天当肝脏胚芽为0.2mm时，需要解剖很小的组织。在这个方面，对相邻的心脏中胚层和前肠内胚层的相互作用进行研究，确定在细胞类特异基因表达中随后的变化，特别是有关α-胎儿球蛋白和清蛋白的表达的变化，和部分有关上皮基膜组成的变化。依据本发明培养肝移植体的方法在下面阐述。在这些试验中得到的结果显示，在完全没有中胚层衍生物存在的培养中，肝内胚层会很快恶化。15个这样的肝移植体只有2个存活。苏木精和曙红染色显示，坏死的内胚层没有明显的肝分化迹象。当与周围的中胚层尤其是心脏中胚层(整体解剖)相连合时，内胚层细胞繁殖并侵入中胚层部分。可以看到肝细胞被组成棒状体，被窦状体分离，伴随着假性裂片形成。从整体解剖获取的全部15个培养物都完全存活了。这项研究证实了阐述肝形成需要周围中胚层的先前移植体研究。
因此，为鼠肝发育四个主要阶段e10、e11.5、e12.5、和e14.5以及成年肝建立了cDNA文库。通过采用仔细地初始RNA印迹分析，尺寸分级，定量，和定性分析，显示出它们各自mRNA种类的真正代表性。Northern分析肯定了阶段特异性，和它们转录体的限制性表达对于145，含有对妊娠中期脑和肝组织具有限制性的1.35和2.37Kb转录体，对成年鼠和人的Northern印迹分析显示出，在肝、肾、睾丸中145转录体含量极低。有关145蛋白质的进一步试验显示，对于田鼠磷脂酶C-γ(PLC-γ)其序列一致性为53％(20S.D.’s)，145保留部分的氨基酸与PLC-γ的对比确定了分裂的血小板-白细胞C激酶底物同源(PH)区域。蛋白质145(liyor-1)氨基酸的含量与PLC-γ的氨基端PH区域有99％的一致性。PH区域是有100个氨基酸的区域，已在很多中蛋白质中发现，包括丝氨酸/苏氨酸激酶，GTP酶激活蛋白质，磷脂酶和细胞骨架蛋白质，这个PH区域被认为与信号传导是有关的。核磁共振光谱显示P-胞衬蛋白(fodrin)的PH区域是静电极性分子，带有可能结合配位体的囊。具有重要意义的事实是，这个囊与肽酰-脯氨酰-顺-反-异构酶FKBP有关，其中，这个囊涉及对大环化合物FK506的结合。因此，已经考虑了的是，蛋白质145的确带有对与FK506类似的“自然”配位体结合的囊，并因此表现为肝细胞分化的潜在因子。
对PLC-γ的调节，是通过SH2-区域决定的复合物，酪氨酸磷酸化受体的酪氨酸激酶，和在酪氨酸残基上的磷酸化作用联合进行的。PLC-γ和蛋白质145的独特性质是两个都含分裂的PH区域，PLC的分裂PH区域填充了SH2-SH2-SH3区域和周围X和Y催化反应区域之间的间隙。SH2区域调节了PLC-γ与活性生长因子受体如表皮生长因子(EGF)，或血小板衍生的生长因子(PDGF)受体的高亲和相互作用。PH区域同样可用来在肝发育期间，在蛋白质激酶和其假定目标之间作引导复合物形成的特定非催化反应区域。此外，在145和PLC-γ中的完全同一的区域和分裂的PH区域，也保留在一些其他蛋白质中，如TOR2，重要的酵母PI3活化酶，和v-ab1中。可给SH2区域划上平行线与活性生长因子受体相联系的蛋白质具有特别的酶属性，在结构上不属于它们的催化区域，并且蛋白质也含有约100个氨基酸的相同的非催化区域，称src同源性(SH)区域2。通过SH区域与活化酶区域和磷酸化底物相互作用的明显性质，它首先在无受体蛋白质酪氨酸活化酶如Src和Fps中被确认出。可以认为在细胞信号机制的演化期间，获取SH2区域给PLC-γ和GAP提供了与跨膜酪氨酸激酶相互作用的能力，并因此而将生长因子刺激与PI转换和激酶途径相偶合。PH区域可与SH2区域同样保留，并能以与SH2区域同样的方法加以使用。
如上所述，蛋白质liyor-1(145)显示出在Ito细胞的形成和纤维化中的重要性，这样，就可用于治疗晚期肝疾病和其他病况包括肝细胞癌，贫血，共济失调，血色沉着病等。现在认识到的是，蛋白质liyor-1的使用可以是，给适合的患者服用对治疗该患者具体病况为有效量的这种肝蛋白质，具体采用的是传统方式和本领域技术人员熟知的用药方式来实施。使用本发明cDNA文库确定的liyor-1序列在图1中列出，适当量的liyor-1(145)蛋白质可用传统的方式制备，对重组的或其它形式的编码145蛋白质的核酸进行表达，之后，蛋白质可被分离和/或制成所需的足够纯的形式。另外，145蛋白质也可与任何其他适当的，通常用来给患者服用的化合物一起服用，如适当的药用可接受的载体。
如本文下面的实例所述，依据本发明，早期发育肝蛋白质的其他基因已被分离和测序，包括编码elf蛋白质、praja-1蛋白质、pk蛋白质、蛋白质106的基因，和基因20，36，41，112，114，118和129。对于elf蛋白质，这些蛋白质是通过分析从妊娠中期胚胎中获取的组织的mRNA来研究的。解剖第11天以后的组织，在这个阶段，独立的肝、心脏和其他组织可容易地解剖出来，随后分离的RNA质量也很好。对使用32P标记的1.1Kb插入代表蛋白质elf，使用从不同发育阶段获取的polyA RNA，与elf DNA在不同鼠组织内进行的RNA杂交进行研究。在elf含量稳定的情况下，通过测量膜动蛋白的相对量，来测定发育改变的特异性。在高度严谨冲洗下显示了2.4kb转录体。对每条带的光密度扫描显示，elf的最大表达出现在肝和心脏中，在其他组织中的表达要少些，在第十一天特异表达，在第12.5和第14.5天量减少(1-2月后Northerns显影)。
然后，使用原位杂交确定在e11.5心脏和肝中elf的表达，连同确定在早期肝发育期间它的表达模式，这些在下面的实例中将作说明。从前肠内胚层细胞产生的肝胚芽，在妊娠第九天长成为横膈(13-20个体节阶段)。在交配后10.5到11.0天期间，相当程度的分化出现肝脏在这段时间充分增大，这种体积的增大是由于，横膈的间质被肝棒状体侵入和肝脏中生血活性的产生。在第9.5天，elf的明显标记在心脏中变得显著，模式是小梁式的，包括心原基的壁。部分窦房心室壁也显示高强度的elf表达。周围组织，特别是尾部肝胚芽区域没有显示存在银色颗粒。
在下一个阶段，第10.5天，银色颗粒清晰地突出了发育的肝脏，在这个部分显示为水平结构(L)。在这个阶段，在发育的心脏组织中的信号减弱。周围组织显著缺少银色颗粒。在第11.5天，elf明显标记在肝脏中变得显著，其尺寸变大。在这个阶段，心脏仅在后部显示微弱信号。作为对照，除了有义探针，α-胎儿球蛋白的核糖探针概括出了11-12天发育的胚胎肝。
比较第9.5天和10.5天的胚胎显示，elf时序和空间的表达在心脏中elf表达升和降的时序梯度，可从第9天的发育心脏中的明显染色，和在下一阶段较弱染色中(第10.5天)推断出来。同时，肝的表达增加了。空间梯度明显，银色颗粒从发育的心脏向肝脏移动的密度增加在第10.5天，由elf cDNA制备的反义RNA探针与第9.5天心脏间质组织特异杂交；第10.5天的表达对心脏和肝脏是限制性的，elf表达最终对在后面第11.5天的胚胎的肝脏是限制性的。值得注意的是，在后面的阶段(第12.5，14.5天p.c.)，在胚胎肝中可以看到elf的表达，但是，丰富度减少相当长时间后的Northerns和原位显影结果出来时，才测试出这些后面阶段的信息。elf的有义探针不与任何组织杂交。这说明elf的表达不是突然“开”“关”的现象，更为具有梯度模式与脑β-膜收缩蛋白的表达模式相一致。
α-胎儿球蛋白反义RNA探针与11.5、12.5、13.5、14.5胚胎鼠肝组织特异杂交，这与以前对从胚胎肝样品中分离的mRNA的研究是相符的。我们通过原位杂交可以检测到的α-胎儿球蛋白mRNA的最早阶段，是在妊娠第10.5-11.0天。对清蛋白mRNA的同样试验显示，清蛋白在第9.5天在从前肠上皮的细胞簇中和见到的侵入横膈中的清蛋白细胞簇中被表达。在α-胎儿球蛋白试验中，将肝在随后的所有阶段中作上标记(第11天以后)，经过组织学检验，确定主要发生在内皮细胞中。生血细胞出现收缩，但不含在α-胎儿球蛋白阳性细胞中可见的杂交颗粒。这些试验显示elfmRNA出现在早期胚胎心脏中，然后移动到e11的肝脏中。
接着，确定了elf是肝形成中胚层组成的标记。因为Northern分析显示elf表达出现在第11.5天的心脏和肝组织中，所以实施原位定位是为了研究elf表达对心脏和肝中胚层组织是否是特异限制性的，然后与α-胎儿球蛋白的内皮表达比较。在发育胚胎中的中胚层的主要区域是背部(体节)，中部，和侧部。具体地，侧板中胚层包括躯体组织(胸膜，心包膜，腹膜，肢体胚芽)，内脏组织[心脏，心外膜，心肌，结缔组织和内脏的平滑肌及血管，血管胚(hemangioblastic)组织，肾上腺皮层及脾]。在第9天(13-20个体节)时，发育的心脏显示是在胚胎内，循环系统内皮细胞被管壁包围的唯一区域。普通心室和心房的壁表现出程度增加的横纹(trabeculation)。在内皮细胞和心肌细胞之间的空间里充满了称为心脏胶质的疏松间质。使用elf反义核糖探针进行的第9天和第10天胚胎心脏的原位杂交显示出，心室和心房区域高含量的标记和显著的横纹(trabeculation)。
肝间质也是从侧板中胚层产生的。肝间质的横膈部分是从心前区域的内脏中胚层产生的，这一点被认为是造成后来肝细胞分化的原因。然而，组织移植试验显示，所有侧板衍生物可在后面替换肝间质。初始试验显示，内皮层的迁移必须与前者的间质相互作用，以分化成肝细胞，最近对清蛋白mRNA(肝细胞分化的指示剂)表达的研究已证实这些性质；最初清蛋白mRNA的表达出现在横膈侵入期间，在当前肠内皮层细胞明显接触心脏间质组织时。同样地，清蛋白转录的引物延伸分析显示，发生在10.5天的起始转录位置，在第12.5天肝器官形成时有15-20倍的清蛋白mRNA的升高。在我们使用α-胎儿球蛋白作为分化肝细胞的标记的试验中，很显然的一点是，α-胎儿球蛋白表达对于肝发育后期的内胚层组成是限制性的，elf表达似乎在疏松组织的轻度染色的间质细胞中，初始在心脏间质中(在第9.5天)出现，然后在心脏和肝脏组织中出现(在第10.5天)，随后又限制在肝组织(在第11.5天以后)；然后，当整个胚胎肝形成时，elf表达的丰富度降低。组织学检验后期(第11.5天以后的)部分显示出了颗粒的分散分布，以及与elf的杂交信号局限在外窦状细胞中，而不在肝细胞中。
由于elf在早期心脏中胚层中的表达，及后来的表达被限制在肝中胚层，这就说明，对于肝发育的中胚层组成，这是一种新标记。分子标记在胚胎学研究中的诱导事件解剖中的价值是无法衡量的。例如，在非洲爪蟾(Xenopus)的vg-1中，TGF-β家族的一个成员被认为是当前背中胚层诱导的最好候选，而事实上最初的分离是通过对位于发育非洲爪蟾卵的植物性半球中的mRNA的分化筛查完成的。活化素和属于TGF-β家族的其他基因如vg-1，以及wnt和BFGF家族，代表了导致实施特定中胚层演化的级联的组成，并且所有都是作为中胚层诱导因子的好的候选。然而，这些基因中，只有vg-1显示出位于植物性细胞中，即对造成体内中胚层诱导负责的分裂球。vg-1的特异位置是很重要的，其负责对vg-1在中胚层形成中作诱导剂的作用的研究中所要求的一致性。同样地，对于分离肝形成所需的假定诱导剂，关键的步骤是定位从胚胎肝分离出的新mRNA。因此，已经认识到的是，elf和与其有关的调节基因作为肝生长因子是具有巨大的潜在好处的。
对elf的进一步特征化涉及对成年鼠和人类组织的RNA分析，已经确定的是，elf与成年肝、肾、和睾丸杂交，在肝和肾中为2.4Kb转录体，在成年睾丸中为2.6Kb转录体，其丰富度很低两个印迹在胶片上于-70℃曝光一个月后显影。对从人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，鸡，和酵母中获取的DNA(基因组)的elf表达进行的基因组DNA分析显示，elf保留在许多不同的物种中，在所有研究的物种中，除了兔子，都表现出了elf DNA。
在elf的体外转录和翻译中，使用核酸酶处理的兔子网状细胞溶胞体(promega)的后者显示了34Kb的蛋白质，如elf插入尺寸所预计的，说明这种插入对于特异蛋白质编码序列是框内的。这些研究建立的理论是，特异中胚层mRNA是以保证它们后来的与特异中胚层组织相隔离的方式定位的，这样，则假设的肝脏中胚层组成就如胚胎移植理论中所示。
对elf蛋白质已经测序，并且确定的是，在早期肝发育期间可确认出至少三种特异elf蛋白质基因，这些基因的序列被称为elf-1，elf-2，elf-3，分别在图2a、2b、2c中给出。如上所述，在早期肝发育期间，elf蛋白质1-3对胆树的形成可能是重要的。因此，已经认识到的是，依据本发明，elf蛋白质在治疗多种与肝功能有关的疾病中是有用的，包括胆汁郁积，胆结石，胆阻塞，胆狭窄，原发性胆硬化，原发性硬化胆管炎。使用elf蛋白质的治疗方式，对本领域的技术人员是显而易见的，包括服用对治疗上述具体病况为有效量的分离的elf蛋白质。同样显而易见的是，elf蛋白质本身可用一些适当的方式，通过表达图2a-2c中所示的核酸序列来制备，包括制备这些蛋白质的重组方法，然后分离，离析和/或充分提纯elf蛋白质。一旦用这种方式获得了elf蛋白质，就可以将其制成患者可接受的任何适当形式。此外，这三种elf蛋白质任何一种可与任何其他适当的，通常用来给患者服用的化合物一起服用，如适当的药用可接受的载体。
依据本发明确定及分离出的，认为也能用于多种治疗方法中的另一种蛋白质是praja-1。目前，已对praja-1与早期发育肝蛋白质的试验一起进行了研究，对氨基酸翻译的分析显示出COOH-终端RING-H2基元序列的存在，它是一种锌指变异体。此外，对成年鼠RNA的Northern印迹分析显示出在肝、脑、和肾中对3.1kb、2.6kb、和2.1kb转录体的表达，和在睾丸中对2.3kb转录体的表达。praja-1的表达在结肠癌细胞系SW480中也是明显的，下面将作阐述，已经认识到的是，praja-1蛋白质对于结肠癌细胞的早期发现是一种有用的标记。
还了解到的是，praja-1位于X染色体，在约36cM的地方。位于该区域的其他基因包括膜突蛋白[moesin](Msn)，雄性荷尔蒙受体(Ar)，白细胞间介素-2受体γ(IL-2rg)，X-连接的锌指蛋白质(Zfx)，以及tabby(Ta)。鼠和人类X染色体之间的同义和保留基因顺序可与这个区域中的人类疾病基因相比较。在这个区域中与中胚层有关的人类疾病包括缺水外胚层发育异常(eda)，铁粒细胞性贫血和脊髓小脑共济失调(asa)，因此，已经认识到的是，依据本发明，praja-1在治疗这些疾病状况，及衰退性神经病学上的病变中将是有用的。
对praja-1的体外表达显示，翻译的产物走出两个相邻的间隔带，为Mr＝55.6和56.9kD，比预测的ORF尺寸47.4kD要大。一种可能的解释是，表达产物是强酸性的，已知的酸性蛋白质如granin会给SDS-PAGE带来异常高的Mr值。存在两种产物说明翻译开始于第二个中间的ATG密码子，如在Met-19。
此外，对praja-1的反义研究显示，praja-1对于肝脏机构体系形成是很重要的。在1.25、2.5、和5mfn浓度，使用对praja-1的两种不同ODN，进行初步反义研究。在这些试验中，肝和块移植体用这些反义ODN处理，与对照物对比(混杂的，有义的或无ODN的)。结果显示，对照物肝脏一般比反义处理的肝脏大，对照物块显示出早期肝细胞的生长，软骨的生长，和保存很好的胆管。用任何一种对praja-1的反义ODN处理过的肝和块，都显示出最小程度的肝细胞生长，细胞坏疽，及仍保存着软骨组织，并且是剂量依赖性的。
在praja-1中，除了RING-H2指外，刚超过这个基元序列的三十四个COOH-终端氨基酸的部分富含脯氨酸残基(17.6％)；并如所述的，蛋白质通常是强酸性的。在几种哺乳动物转录因子中发现了富含脯氨酸的区域，如在转录因子CTF的COOH-终端。富含脯氨酸区域和酸性区域可能会发挥与其他蛋白质相接触的作用。当将praja-1序列整体考虑时，鼠Neurodap1基因具有最大的相似性。Neurodap1在鼠脑中大量表达，在心脏和骨骼肌中的量要少的多。同样地，尽管praja-1显示在脑中表达，但不象Neurodap1(较大4.8kb转录体)，它也在肝和肾中表达。Neurodap1的亚细胞定位，显示集中在内质网状细胞(ER)和大脑皮层和面部核子的高尔基体周围，尤其是在轴突胞体神经键的后神经键密度区域中。根据其亚细胞定位，加上RING-H2指的存在，Neurodap1可能与分泌或蛋白质分类相关联。与Neurodap1的这种相似性表明praja-1很可能与蛋白质-蛋白质相互作用有关，可能与涉及肝细胞形成的蛋白质分类或分泌路径有关。
对编码praja-1蛋白质的基因测序，该核酸序列在图3中给出。如上所述，praja-1蛋白质对于铁的运载可能是很重要的，对肝细胞形成及生血作用也是很重要的。因此，依据本发明，praja-1可用于诊断和治疗一些疾病如晚期肝疾病，铁存贮病变，肝细胞癌，及贫血如铁粒细胞性贫血，共济失调如脊髓小脑共济失调，和血色沉着病。正如本此领域的技术人员可明了那样，这些治疗方式涉及给遭受上述一种病况的患者服用有效量的praja-1蛋白质。此外，praja-1蛋白质的分离可通过表达图3中所示的编码praja-1蛋白质的核酸序列来获得，使用任何此领域熟知的适当方法如重组方式。一旦用这种方式分离，可获得所需形式的praja-1蛋白质，如充分提纯的状态，并且可加入到对需要这种治疗的患者为适应的任何适当治疗模式中。此外，praja-1蛋白质可与任何其他适当的、通常用来给患者服用的化合物一起服用，如适当的药用可接受的载体。
如上所述，进一步还发现，在癌性结肠组织中确定出来了蛋白质praja-1，如在结肠癌细胞系SW480中，其正常体是不产生这种蛋白质的。因此，已经认识到的是，依据本发明，提供了一种检测诊断结肠癌的方法，其中从测试患者获取结肠细胞或组织，用任何适当的方式筛查这些细胞或组织，确定在测试细胞或组织中存在或不存在praja-1蛋白质。用这种方式，在从患者获取的结肠细胞或组织中确定出praja-1，说明在结肠细胞或组织中出现癌病况，这样本发明为在早期，当疾病仍处于可治疗的状况下，确定患者是否感染了结肠癌提供了简单有效的方法。相反，不存在praja-1通常表示在测试的结肠细胞中无癌症状。
依据本发明，还有其他编码早期发育肝蛋白质的基因被确定和测序，这些蛋白质对于诊断和治疗与肝脏或肝功能有关疾病的多种方法中是有用的。包括在这些额外基因中的有，编码被确认为pk蛋白质的核酸，如图4中所示，编码被确认为蛋白质106蛋白质的核酸，如图5中所示，以及基因20，36，41，112，114，118和129，如图6-12所示。这些蛋白质对于肝细胞形成也是有用的，对于使用与上述许多蛋白质相似的方法，及使用与应该用于治疗各种病况的已知生长因子相同的方法治疗肝疾病也是有用的。例如，蛋白质pk在Ito细胞形成和纤维化中是很重要的，这样就可使用与蛋白质liyor-1(145)相同的方法加以利用。因此，蛋白质pk，如从图4所示的核酸序列制备的，在治疗晚期肝疾病，肝细胞癌，以及其他疾病状况包括贫血，共济失调，和血色沉着病中也很可能是有用的。如同上面的情况，这些早期发育肝蛋白质可与用来给患者服用的任何其他合适的化合物一起服用，如适当的药用可接受的载体。
本发明的另一方面包括培养上面提到的早期发育蛋白质的抗体，或培养从这些蛋白质衍生的肽或融合蛋白质如pk蛋白质(也称作itih-4)的抗体。如同被本领域中的技术人员所认识的，这些蛋白质的抗体，或从这些蛋白质衍生选择的肽或融合蛋白质的抗体，可用目前已知的任何适当的传统方法制备，包括在这样一些动物如，兔子，绵羊，山羊，或豚鼠中培养抗体。在一个较好的实施例中，下列抗体是在兔子中培养的(1)在鼠elf基因N-终端aa2-14上的肽(13-mer)，序列为5-ELQRTSSVSGPLS-3；(2)在鼠elf基因C-终端aa2140-2154上的肽(14-mer)，序列为5-FNSRRTASDHSWSG-3；(3)在鼠praja-1基因中部aa144-156上的肽(13-mer)，序列为5-LRRKYRSREQPQS-3。
此外，本发明还包括下列肽的抗体(1)从基因145(Cded)C-终端设计的145肽-A(18-mer)，序列为5-SAQSLVVTLGRVEGGIRV-3或5-CSAQSLVVTLGRVEGGIRV-3；
(2)从基因145(Cded)中部设计的145肽-B(17-mer)，序列为5-KIEGSSKCAPLRPASRL-3或5-CAPLRPASRLRASQTLG-3；(3)从基因G59(Praja1)N-终端设计的g59肽-A(16-mer)，序列为5-PPREYRASGSRRGMAY-3或5-PPREVYASGSRRGMAYC-3；(4)从基因G59(Praja1)中部设计的g59肽-B(15-mer)，序列为5-CKVPRRRRTMADPDFW-3；本发明也包括融合蛋白质的抗体，如40kD pk/itih-4融合蛋白质，其包括itih-4d两个EF-手性基元序列(约400-bp14kD)。
前述的具体实施仅仅是对权利要求的发明的演示，在上面没有具体说明的、对此领域中的技术人员显然的或熟知的变通具体实施也属于本发明的范围内。
此外，下面给出的实例是对权利要求的发明的演示，不能以任何方式认为是对所附权利要求书限定的本发明范围的限制。
实例1依据本发明确定涉及早期鼠肝发育的基因的克隆策略，我们分离了Praja-1，此基因与果蝇melanogaster goliath(gl)基因具有相似的序列，它涉及最终形成肠肌肉组织、脂肪及心肌的中胚层细胞的形成。Praja-1是一个2.1kb基因，编码一个假定的423个氨基酸的ORF，并包含一个羧基终端RING-H2区域。使用Jackson Laboratory BSS测试组，我们定位出Praja-1在染色体X的36cM处，邻近X的非活性中心基因Xist。Northern印迹分析显示，在从成年鼠组织脑、肝、肾获取的mRNA中，及从发育鼠胚胎(交配后第7，11，15和17天)中获取的mRNA中，有3个转录体(3.1kb、2.6kb、和2.1kb)。体外转录/翻译得到Mr为55.6KD和56.9KD的两种产物。RING-H2区域、在羧基-终端的一个富含脯氨酸区域、及富含酸性氨基酸区域的存在，可得到这样一个假说Praja-1产物涉及调节蛋白质-蛋白质相互作用，可能作为蛋白质分类或转运途径的一部分。鼠Neurodap1与Praja-1的相似性强化了这一假说，鼠Neurodap1的产物显示位于脑中的内质网及高尔基体上。
进行肝细胞分化的分子机制还没有被很好的了解，因此，确定控制肝发育的基因可以为明确肝的功能及发育提供有力工具，并可以将诱导肝细胞分化用于治疗目的。作为克隆这样基因的策略的一部分，我们分离了一种新的RING-H2指基因，Parja-1。RING-H2是一种锌指，除Cys4被His取代，它与RING指是相同的[参阅Freemont，Ann.N.Y.Acad.Sci.684174-192，1993；Lovering et al.，P.N.A.S.902112-2116，(1993)]。现在我们可以看到Praja-1在邻近羧基终端有一个RING-H2基元序列。这个RING-H2基元序列与果蝇melangogaster gl基因(Bouchard et al.，Gene 125205-209，1993)及鼠Neurodap1(Nakayama et al，.J.Neurosci.155238-5248，1995)基因相类似。Praja-1位于X染色体上，在鼠的脑、肝及肾脏中表达。所以RING-H2基元序列的存在，加上翻译产物的酸性及亲水性特征，可推出这样一个假设Praja-1在蛋白质运载中起到作用。材料及方法cDNA的制备及3′-RACE PCR.
从交配11天后的胚胎鼠(ICR，Harlan Sprague-Dawley)的肝中用胍硫酸氰盐(Chomczynski et al.，Ann.Biochem 162156-159，1987)分离出RNA。按制造商说明用Dynabeads从总量RNA中分离出Poly(A)+mRNA。用Promega反转录酶系统和3′-RACE引物5′-GACTCGAGTCGACATCGA-T17[Frohman，InM.A.Innis et al.，(eds.)，PCR protocolsa guide to methods andapplications，Academic press，San Diego，pp.28-38，1990]从Poly(A)+mRNA中制备第一条cDNA链。3′-RACE引物在PCR中也可用作反引物。正向PCR引物，最初设计用来扩增克隆145/PH(血小板-白细胞C激酶底物同源性)区域的保留区域，是5′-CTCAAGCAGGTCCTGGCACA。PCR反应混合物包括cDNA(约10ng的Poly(A)+mRNA)，25pmol各种引物，ImMdNPT混合物和2.5单位的AmpliTaq DNA聚和酶(Perkin-Elmer)，加入10mM Tris，1.5mM MgCl2，和75mM KCl，pH9.2，最后的体积为50ml。温度程序包括35个周期的变性(94℃，1分钟)，退火(55℃，1分钟)，延伸(72℃，3分钟)，之后再加8分钟的延伸。PCR反应产物之一(CH7)包括725bp片段，它被克隆成运载体PCRII，使用的是Invitrogen TA克隆试剂盒测序，通过序列分析显示含有RING-H2指。最终cDNA克隆的与CH7相当的部分体在图3中列出。基因文库筛查通过使用反向PCR引物加AmpliTaq聚合酶，在72℃的PCR缓冲液中的引物延伸，将PCR产物CH7用[a-32P]-dCTP(3000Ci/mmol，Amersham)标记[Konat et al.，in PCRTechnologyCurrent Innovations(H.G.Griffin and A.M.Griffin，Eds.)，CRC Press.Boca Raton，PP.37-42，1994]。产物反义探针用来筛查在载体Zap中的整个胚胎鼠(交配第11天后)cDNA文库的噬菌斑。将阳性噬菌斑选出并提纯，并用标准工艺将DNA从溶胞体中分离(Silhavy et al.，Experiment with gene fusions，Coldspring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1984)。用EcorI将插入体从Zap DNA中切除。为了测序和随后的操作，将其亚克隆到PGEM3Zf(-)(Promega)。DNA序列分析采用Genband中BLAST搜索法，进行DNA序列与已经存在序列的对比，使用GCG程序PILEUP实施排序。染色体制图使用[32P]-标记的CH7作探针，对从C57BL/6J(B6)和Musspretus(SPRET/Ei)中获取的基因组DNA进行Southern印迹分析，显示对TaqI酶的限制性片段长度多态性。使用从JacksonLaboratory Backcross DNA Panel Map Service获取的(B6XSPRET/Ei)XSPRET/Ei反交测试组(BBS)，使用这种多态性跟踪Praja-1基因的遗传(Rowe et al.，Mammalian Genome 5253-274，1994)。通过最小化在每一个单型体内多级重组的数量，确定相对于其它标记的顺序和连锁。Praja-1表达的Northern印迹分析将含有2毫克从鼠组织获取的Poly(A)+mRNA(Clontech)的Northern印迹，用[32P]标记过的CH7反义链和Express Hyb杂交溶液在68℃进行探测。依据制造商的说明冲洗，并进行放射自显影。与Northern印迹一起提供的[32P]标记的b-肌动蛋白探针用作对照物，以标准化每条链中的RNA含量。体外转录/翻译使用转录/翻译一体的兔子网状细胞溶胞体系，依照制造商的说明进行(35S)蛋氨酸标记。在PGEM32F(-)中Praja-1的克隆加一个荧光素酶对照体克隆与T7-RNA聚合酶一起使用(正向)。每个反应包括兔子网状细胞溶胞体12.5ml，反应缓冲液1ml，1mM氨基酸混合液(除蛋氨酸外)0.5ml，0.5ml T7-RNA聚合酶，20单位的RNasin，最后体积为25ml。在300℃90分钟温育后，按照Laemmli，Nature227680-685(1970)，产物在SDS/疏基乙醇处理缓冲液中溶胞，在10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离。蛋白质用BioRad Trans-Blot仪器，依据制造商的说明电转染到BAS-NC膜上，通过放射自显影使标记产物可见。结果新基因praja-1的分离和序列分析作为对涉及肝发育及肝功能的基因的分析的一部分，我们扩增了前面未被描述的基因CH7的3’未端。使用CH7探针对鼠胚胎cDNA文库进行筛查，分离了两个重叠克隆体，Praja-1-5和Praja-1-6。对共有的重叠区域进行的序列分析显示出有424个氨基酸的开放读框(ORF)，预计尺寸为47.4KD。水疗法分析(Kyteet al.，J.Mol.Biol.157105-132，1981；未给出)显示，翻译产物具有强亲水性，不带有疏水前导区或膜跨越区域。翻译也有很强的酸性，pI为4.6，含有17.7％的酸性残基(Asp加Glu)。图3中所示的推测的ATG启始密码子被选出，是因为它是符合开放读框内的最上游的ATG，TAG终止密码位于推测的ATG启始密码子上游的21对碱基对之前。然而，这个ATG的前后与共有Kozak识别序列GCCAGGatgG，仅是勉强匹配，其中在-3上没有嘌呤且在+4上没有G(由Kozak评论，Genome7563-574，1996)。氨基酸翻译的序列分析显示存在羧基终端RING-H2基元序列，它是一个锌指变异体(Freemont，同上)。图13显示了Praja-1的RING-H2基元序列与含RING-H2的其它几种蛋白质的对比。鼠染色体X上Praja-1位置的连锁分析Praja-1的限制性片段长度多样性的确定是，使用CH7作探针，在含有从几种限制性酶(TaqI，BglII，EcoRI，HindIII，HincII，KpnI，PstI)酶解过的亲本中获取的DNA的Southern印迹上测得的。对于每种使用的酶，C57B61/J仅有一个限制性片段，而在SPRET/Ti带内总是可观察到两个片段。使用TaqI获得的多样性，在BBS测试组中用来对C57B1/6J等位基因的遗传分类。这里有两个Spretus带S1和S2和一个C57B1/6J带B1。在对praja-1基因型与数据库内分类的其他基因比较后，可以确定praja-1位于鼠染色体约36cM的位置上(图14)。S1带是在SPRET/Ei染色体X上的praja-1等位基因。S2TaqI片段出现在每种反交动物中，因为所有反交得到的雄性动物含有这种等位基因，所以它不是位于X染色体上的。因为雌性动物也含有S2带，所以它不是Y-连锁的。这样，S2是常染色体位点，含有praja-1探针序列的同源序列。位于这个区域的其他基因包括膜突蛋白(Msn)，雄性荷尔蒙受体(Ar)，白细胞间介素-2受体γ(Il2rg)，X-连锁锌指蛋白质(zfx)，和tabby(Ta)。这个区域距Xist位点也是1.1±1.1cM。进一步的研究是需要确定praja-1是否在无活性X-染色体上没有表达，及在X-无活性区是否起作用。在鼠和人类X染色体之间同义和保留的基因顺序(Herman et al.，Genome 6S317-S330，1996)，可与此区域的人类疾病基因比较。此区域中涉及中胚层的人类疾病包括缺水性外胚层发育异常(eda)和铁粒细胞性贫血以及脊髓小脑共济失调(asat)。
体外表达产生的蛋白质产物比预计的尺寸大。Praja-1-5和praja-1-6克隆体的体外转录/翻译产物的放射自显影显示，只有Praja-1-5产生了有意义的产物。这种产物跨越两个邻近间隔的带，Mr＝55.6和56.9kD，比预计的ORF尺寸47.4kD要大。一个可能的解释是表达产物是强酸性的，已知的酸性蛋白质如granin给SDS-PAGE带来异常高的Mr值(Huttner et al.，TrendsBiol.Sci.1627-30，1991)。存在两种产物说明翻译开始于第二个中间的ATG密码子，如Met-19(图3)。
在胚胎和鼠组织中存在着praja-1的转录体。从成年鼠获取的RNA的Northern印迹分析显示，在肝、脑和肾中有3.1kb、2.6kb和2.1kb的转录体的表达，另外在睾丸中有2.3kb转录体的表达。Praja-1蛋白质不象是膜受体，因为它缺少疏水跨膜区域。一致的亲水性建议该蛋白质是可溶性的。在图13中，Praja-1RING-H2基元序列与从几种其他蛋白质中获取的基元序列一起列出。RING指通常被认为是在蛋白质-蛋白质相互作用中起作用(Borden et al.，Curr.Opinion.Struct.Biol.6395-401，1996；Saurin et al.，Trends Biochem.Sci.96208-214，1996)。引用一个具体实例，如果两个组成急性前髓细胞白血病原致癌蛋白PML的RING指的Zn++键合点的半胱氨酸的任一个突变，那么核子多蛋白复合物，或称为核体，就不会出现(Borden et al.，EMBO.J141532-1541，1995)。作者总结认为PNM RING区域，和可能的其他RING指区域与蛋白质-蛋白质的相互作用有关。
在praja-1中，除了RING-H2指外，刚超过这种基元序列的三十四个COOH-终端氨基酸的片段(图3)富含脯氨酸残基(17.6％)；并如所述的，蛋白质通常是强酸性的。在几种哺乳动物转录因子中发现了富含脯氨酸的区域，如在转录因子CTF的COOH-终端，富含脯氨酸区域和酸性区域可能会起到与其他蛋白质相接触的作用(Mitchell et al.，Science 245371-378，1989)。对富含脯氨酸COOH-终端的BLAST的搜索显示，在可利用的数据库中没有与任何蛋白质有意义的匹配。然而，当将praja-1序列整体考虑时，鼠Neurodap1基因具有最大的相似性。对比序列在图15中列出。
Neurodap1在鼠的脑中大量表达，在心脏和骨骼肌中的量要少的多。同样地，尽管praja-1显示在脑中最大的表达，但不象Neurodap1，它也在肝和肾中表达。Neurodap1的亚细胞定位，显示集中在内质网状细胞(ER)和大脑皮层和面部核子的高尔基体周围，尤其是在轴突胞体神经键的后神经键密度区域中(Nakayama et al.，同上)。根据其亚细胞定位，加上RING-H2指的存在，Neurodap1可能与分泌器官或蛋白质分类相关连。然而，Praja-1确实与Neurodap1在一些方面相区别。除了与Neurodap1相比在一些不同的器官中表达之外，Praja-1编码的产物比(47.4kD，依据图3中克隆体的组成)Neurodap1编码的产物77.9kD要小。尺寸的不同是在蛋白质的N-终端(图15)。我们观察到的Praja-1最大的转录体为3.1kb，而Neurodap1在田鼠脑mRNA的Northern印迹上存在单一的4.8kD转录体。
依据BRCA1的事实，其含有RING指，具有酸性pI，是一种分泌蛋白质，也具有蛋白质granin家族的性质(Jensen et al.，Nature Genet.12303-308，1996)，我们检验了praja-1的granin特征。我们发现在praja-1翻译产物中没有区域与共有序列E[N/S]LX[A/D]X[D/E]XEL完美匹配，尽管两个区域七分之五的保留残基相互匹配。我们也不能证明存在明显的螺旋式盘绕，这种结构存在于BRCA1和以前提及的带有三重结构的蛋白质中。在这些方面，与其他蛋白质如BRCA1相比，praja-1与Neurodap1更为相似。同样，尽管在praja-1中RING-H2显示出与melanogaster goliath(gl)中的RING-H2有更多的相似性(图13)，但Goliath蛋白质呈碱性pI(8.9)，并且没有与RING-H2指外部的praja-1相似的序列。RING-H2基元序列加酸性和富含脯氨酸区域，以及与Neurodap1的相似性，可得出这样的结论，praja-1与蛋白质-蛋白质相互作用有关，可能与蛋白质分类或分泌路径有关。
实例2依据本发明，为了分离和确认用于涉及肝脏和肝功能治疗的早期发育肝蛋白质，对肝组织中分化诱导进行研究。在发育胚胎中，诱导的相互作用，细胞间的联络，及细胞极性的建立对于发育期间的生长和成型是很重要的。然而，影响肝细胞分化或肝发育的精确机理以前没有被阐明。对哺乳动物肝发育的首先认识，是通过胚胎组织的间质和内胚层之间的相互作用的特异序列而建立的。在鼠妊娠的第9.5天，根据从心脏间质传出的信号，肝脏憩室的内胚层细胞繁殖并移入周围横膈中。疏松间质的这个特异区域接着分化成肝间质，在妊娠约10.5天肝胚芽最终可在显微镜下看到。这种肝间质继续使肝细胞繁殖扩增，然后持续整个胚胎生命(Le Dorarin，Med.Biol.53425-455，1997)。清蛋白转录最早可在第9.5天检测到(Cascio et al.，Development 113217-225，1991)，说明当肝内胚层开始与心脏间质接触时，肝细胞分化就开始了。作为对基因表达的这样限制性模式的调节信号转导途径的分析的第一步，就要求分子标记以及调节基因来确定肝发育所需的相互作用。
肝脏基因调节途径的解剖使得转录活性剂，C/EBP，DBP，LFB1/HNF 1，3和4(Johnson，Cell Growth Differ.147-52，1990；Kuo et al.，Development 109473-481，1990；Frain et al.，Cell59145-157，1989)，肝特异基因，如α-胎儿球蛋白和清蛋白(Tilghman，Oxford Survevs on Rukaryotic Genes，OxfordUniversity Press，1985)得到确定和特征化。然而，除了HNF4、3α和β(Ang et al.，Development 1191301-1315，1991和Cell78561-574，1994)之外，在确定发育肝的细胞组和区域特异中，没有发现上述一种起到确定性作用。肝胚芽的体积小(约4×10-2mm3)，产生的蛋白质，DNA和信使RNA的量更小。这样使对肝发育的分子分析很困难。因此，建立早期胚胎肝cDNA文库，实施相减杂交仍然是获得早期鼠肝发育期间所需的基因的无偏差目录的最似可信和广泛的方法(参阅Harrison et al.，Development 1212479-2489，1995)。
标记的分离提供了与基因表达这样的限制性模式有关的转录活化剂和生长因子的更进一步信息，并且最终提供了确定与肝细胞分化有关的信号转导途径的方法。在一些情况中，这些途径已成为脊椎动物头和躯干的模式及轴形成的特征(Oliver et al.，Development 121693-705，1995；Kessel et al.，Science 249374-379，1990)。例如，在非洲爪蟾(Xenopus)中，涉及brachyury，活化素和wnt有关的基因的网络，负责中胚层诱导、somitogenesis、肌性和成骨的分化(参阅如，Wilkinson et al.，Nature 343657-659，1990；Herrmann et al.，Development 113913-917，1991；Green et al.，Trends Genet.7245-250，1990；Sokol et al.，Cell 67741-752，1991；Smith et al.，67753-767，1991)，并且背腹轴的形成是由于Xgsk-3(果蝇zw3/shaggy的非洲爪蟾同源物)磷酸化它的armadillo的非洲爪蟾同源物，β-连环蛋白(catenin)，从而调节可供背轴形成用的β-连环蛋白的含量。然而，对早期肝发育或它的重要的中胚层组成进行特征化而言，没有现成可用的分子标记或途径。
正是由于本发明，使对于肝发育而言，确定和特征化这样的分子标记和可能的诱导性转录体成为可能。如下所述，描述了elf蛋白质的特征，并且，这种蛋白质的表达可能标记肝发育的分别的组成。关于这种特征的“颠倒”方法通常会确定出完全意料不到的基因组，特别是，这里描述的是elf蛋白质，它通过在表膜上的相互作用，可能在建立细胞极性中起到作用。时cDNA文库的特征描述在肝发育中的四个阶段(e10、e11、e12、和e14，其中e是指胚胎)确定了从未分化中胚层/内胚层细胞到发育良好和分化的胚胎肝的发育时间点。在e9-10天时，细胞极性中出现变化。在e10.5-11天，发生内胚层细胞侵入和移入到周围间质；在e11.5-12天，假性裂片形成，肝细胞棒状体与早期窦状体一起形成。因此，代表这些基因的cDNA文库，表示在肝细胞形成的关键时间段“捕获的”大量表达的mRNA种类，并能使它们分离，提供一种分析肝发育期间基因表达变化模式的方法。
含有5.0×106-4.1×107个独立克隆体的文库是用最大的cDNA片段制成的。目前估计显示，含有5.0×105个独立克隆体的文库(Smabrook et al.，Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)是具有99％可能性的存在少见转录体(每个细胞少于10个复制体)的典型文库。因此，我们的文库很可能是代表这些阶段mRNA种类的真正典型文库。文库的质量和发育分布使用基因，如已知会在发育肝不同时间段中表达的IGF-II、IGFBP-2、IGF-I、C/EBP、HNF/LFBI，获得了文库有关的数据。下面表2中的数据显示，IGF-I在任何胚胎文库中都没有检测到，而IGF-H在e10.0和e12.5文库中检测到(在e10.0是3，在e12.5是4)。IGF-II在成年肝文库中没有被检测到。有趣地是，在早期e6.5、e7.5和e8.5的文库中，BP-2与IGF-II的克隆频率相似(数据没有列出)，但在肝cDNA文库中克隆频率不同，因为，与IGF-II的较大的数目相比，BP-2在e10.0和e11.5中每100,00检测基因只有一个克隆，在成年肝cDNA文库中检测到7个。这表示它在胚胎和胎儿中的时序和空间的表达与IGF-II不同，并且这一点在随后的原位研究中被证实。在e12.5文库中检测到的HNF/LFBI突然在第11.5和12.5天中以低含量检测到(在e11.5天2个克隆/100,000，在e12.5天5个克隆/100,000)，证实尽管它是表达的，但在胚胎阶段它的含量也是可调节的，虽然是向下的。最后，将鼠β-肌动蛋白用作参考所有七个文库具有相同的β-肌动蛋白频率，从120-300个/100,00克隆，这被认为是这样的胚胎文库的特点。通过相减方式确定阶段特异性克隆如前面所提及的，建立两个相减的文库，包含64个克隆体(e11.5-12.5)，和174个克隆体(e10.5-11.5)。通过Southern杂交，测序，Northern印迹分析，Zoo印迹分析，和蛋白质体外授精对这些克隆体进行进一步性质测试。使用Southern印迹，三十四个克隆体显示阶段特异性，不含有线粒体RNA，核糖体，及球蛋白序列，进一步的分析是对elf进行的。Elf转录体的确定和发育调节分析从妊娠胚胎中期获取的组织中的elf mRNA。解剖第11天以后的组织，因为在这个阶段可容易地解剖到独立的肝、心脏和其他组织，并且后来分离的RNA质量也很好。使用32P-标记的1.1kb插入体代表elf，在稳定含量elf中发育变化的特异性也可用测试3-肌动蛋白相对含量来评定。在高度严谨的冲洗下显示2.1kb的转录体。对每条带的光密度扫描显示elf最大的表达出现在肝和心脏中，在其他组织中要小些，在第11天特异性表达，在12.5和14.5天以减少的量表达(Northerns1-2月后显影)。Elf的序列分析相减杂交后，对一个阶段特异克隆详细分析sc32。然后在高度严谨条件(0.2×SSC，60℃)下对初始文库进行筛查，以获得sc32的重叠克隆体。将阳性的挑出，体内切除(Stratagene)到Bluescript中，使用双脱氧链终止法，使用预先确定序列的相应的寡聚核苷酸对这些克隆体测序。在挑出的七个克隆体中，发现三个与sc32重叠，并包含编码elf的序列(图16a和图16b)。通过对鼠胚胎组织进行Northern印迹分析，证实了克隆体与elf的身份。对于elf而言，用sc32作探针，得到同样的初始2.1kb转录体。不存在起始密码子说明我们没有克隆cDNA的5’端。然而，Northern印迹显示了2.1kb转录体，这表明我们克隆了全部的elf，这可能代表β-胞衬蛋白的拼接形式。通过比较elf序列与表达序列标签(EST)数据文库，证实了elf序列3’端的真实性。尽管，没有发现elf序列的鼠ESTs，但发现了三个不同的人类EST克隆体，跨越了独特的最后100nt和5’邻近序列的区域。说明在人类细胞中存在elf的同源体(参阅图16a和图16b)。
先前的序列分析显示elf对β-胞衬蛋白(一种非红细胞血影蛋白)有80％的一致性。我们的elf序列位于β-血影蛋白的区域II和III之间。区域II含有17个重复的106个氨基酸的基元序列，和一个锚蛋白键合区域(图16a)。锚蛋白键合区域对内收蛋白、锚蛋白、和Na+、K+ATPase正确的亚细胞定位是必需的，没有它细胞形态就会混乱。区域II包括C终端区域，其含有不同数量的残基(52-256)并以各种不同的拼接形式造成组织的特异表达(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992)，以及PH区域。Elf的原位定位使用elf有义探针和α-胎儿球蛋白反义探针作对照物，原位杂交证实在11.5心脏和肝中的elf表达，并确定了在肝发育期间它的表达模式。肝盲囊，其在前肠-中肠的连接处产生，在妊娠的第9天开始长成横膈(13-20个体节阶段)。在交配后10.5天到11.0天之间，在这种初始肝中可以看到相当大程度的分化。经这段时间，肝充分增大总体积的增大是由于肝棒状体侵入横膈间质，和这个器官中生血活性的开始。在9.5天，在心脏轮廓中elf明显标记变得显著模式是小梁式的，包括心脏原基的壁。部分头向室(sino-atrial chamber)的壁也带有高强度的elf表达。周围组织，尤其是尾部肝胚芽区域没有显示存在银色颗粒。在下一阶段，第10.5天，银色颗粒清晰地突出了发育的肝脏，在这个部分显示为水平结构(L)。在这个阶段，在发育的心脏组织中的信号微弱。周围组织明显缺少银色颗粒。在第11.5天，elf明显标记在肝脏中变得显著，其尺寸变大。心脏显示非常微弱的信号仅在后部单一条纹中可见银色颗粒。在这个阶段，elf表达也在脐带中显示。作为对照，除了有义探针之外，对α-胎儿球蛋白的核糖探针概括出11-12天的发育胚胎肝。
比较第9.5天和10.5天的胚胎显示了，用表示elf核糖探针的银色颗粒染色的最大组织的清晰的时序和空间的梯度在心脏中elf表达升和降的时序梯度，可从第9天的发育心脏中的明显染色，和在下一阶段较弱染色中(第10.5天)推断出来。同时，肝的表达增加了。thesde组织的发育的模式空间变梯度是明显的，这说明银色颗粒密度增加，因为颗粒从发育的心脏向肝脏移动在第10.5天，由elfcDNA制备的反义RNA探针与第9.5天心脏间质组织特异杂交；第10.5天的表达对心脏和肝脏组织是限制性的；elf表达最终对第11.5天以后的胚胎中的肝脏是限制性的。值得注意的是，在后面的阶段(第12.5，14.5天p.c.)，elf表达在胚胎肝中可以看到，但其丰富度减当Northerns和原位检验在相当长的时间后被显影时，可测试出这些后面阶段的信息。elf的有义探针不与任何组织杂交。
α-胎儿球蛋白反义RNA探针与11.5、12.5、14.5天的胚胎鼠肝组织特异杂交，这与以前对从胚胎肝样品中分离的mRNA的研究是相符的(Tilghman et al.，P.N.A.S.79-5254-5257，1982)。通过原位杂交检测到α-胎儿球蛋白mRNA的最早阶段，是在妊娠第10.5-11.0天。对清蛋白mRNA(Cascio et al.，Development113217-225，1991)的同样试验显示，清蛋白在第9.5天在从前肠上皮细胞中培养的细胞簇中表达，和在开始侵入横膈的细胞簇中表达。在用α-胎儿球蛋白的试验中，将肝在随后所有阶段作上标记(第11天以后)，经过组织学检验，其显示主要在上皮细胞中出现。生血细胞出现收缩，但不含在α-胎儿球蛋白阳性细胞中可见的杂交颗粒。在中胚层组织中ElfmRNA分布与在内胚层中的α-胎儿球蛋白mRNA的比较因为Northern分析显示elf表达出现在第11.5天的心脏和肝组织中，所以我们研究elf表达是否对心脏和肝中胚层组织是特异限制性的，并将它与α-胎儿球蛋白的内皮细胞表达相比较。在发育的胚胎中，可以区分出中胚层的三个主要区域，即背部(体节)，中部，和侧部。具体地，侧板中胚层包括躯体组织(胸膜，心包膜，腹膜，肢体胚芽)，内脏组织(心脏，心外膜，心肌，结缔组织和内脏的平滑肌及血管，hemangioblastic组织，肾上腺皮层及脾)。发育的心脏在第9天(13-20个体节)时显示，跳动规律且有力。在这个阶段，在胚胎内，心脏是循环系统内皮细胞被管壁包围的唯一区域。普通心室和心房的壁表现出程度增加的横纹。值得注意的是，在内皮细胞和心肌细胞之间的空间里充满了称为心脏胶质的疏松间质。使用elf反义核糖探针进行的第9天和第10天胚胎心脏组织的原位杂交显示出了，心室和心房区域高含量的标记。
肝间质也是从侧板中胚层产生的。肝间质的横膈部分是从心前区域的内脏中胚层产生的。这一点认为是造成后来肝细胞分化的原因。然而，组织移植试验已显示，所有侧板衍生物可替换肝间质。虽然初始试验显示移植内皮层必须与前者的间质相互作用，以分化成肝细胞(Le Douarin，1975；Houssaint，Cell Differ.9269-279，1980)，但最近对清蛋白mRNA表达作为肝细胞分化的指示剂的研究已证实这些性质清蛋白mRNA最初表达出现在横膈侵入期间，在当肝先驱细胞明显接触心脏间质组织时。同样地，清蛋白转录的引物扩展分析显示，起始转录位置在10.5天出现，并有在肝器官形成的第12.5天的清蛋白mRNA的15-20倍的增加。在我们使用α-胎儿球蛋白作为分化肝细胞的标记的试验中，高度放大后很显然的一点是，虽然α-胎儿球蛋白表达对于肝发育后期的内胚层组成是限制性的，elf表达似乎在疏松组织的轻度染色间质细胞中，和初始心脏间质中(在第9.5天)出现，然后在心脏和肝脏组织中出现(在第10.5天)，随后对肝组织是限制性的(在第11.5天以后)；然后，elf表达随着肝形成而降低。对后来的组织学部分试验显示出了颗粒的分散分布。尽管似乎与elf的杂交信号是位于外窦状细胞中，而不在肝细胞中，但得到的结果让人对杂交细胞的身份不能作出一个严格的结论。在成年组织中elf RNA的分布，在演变中的保留对elf进一步的特征化涉及成年鼠组织的RNA分析。elf与成年肝、肾和睾丸杂交，在肝和肾中为2.1 kb转录体，在成年睾丸中为2.6kb转录体，丰富度很低。对从人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，鸡，和酵母中获取的elfDNA进行基因组分析显示，elf保留在许多不同的物种中，在所有研究的物种中，除了兔子，都表现出了elfDNA(图18)。
在elf的体外转录和翻译中，后者使用了核酸酶处理的兔子网状细胞溶菌体(promega)，显示了34kb的蛋白质，其正如elf插入体尺寸所预计的，说明这种插入体对于特异蛋白质编码序列是框内的(图17)。胚胎肝移植培养物与本发明相关的一个研究目的是建立确定在肝形成中elf和ss3的发育作用的功能检测。当第10-10.5天肝脏胚芽为0.2mm时，为了克服解剖和分析极小的组织块，在我们的实验室中培养鼠胚胎肝移植体。当在完全没有中胚层衍生物存在的情况培养时，肝内胚层会很快恶化。15个这样的肝移植体中只有2个存活。苏木精和曙红染色显示，坏死的内胚层没有明显的肝分化迹象。当与周围的中胚层，尤其是心脏中胚层(整体解剖)相联合时，内胚层细胞繁殖扩增并侵入中胚层部分。可以看到肝细胞被组成棒状体，被窦状体分离，假性裂片形成。从整体解剖获取的全部15个培养物都完全存活了。这项研究肯定了阐述肝形成需要周围中胚层的先前移植体的研究。对elf、其他克隆体ss3、145、HNF3β，并用GAPDH和α-胎儿球蛋白作对照物的半量RT-PCR分析，证实了在中胚层-内胚层相互作用期间增长的表达。
在鸡胚(Douarin，1975，同上)中的早期试验显示，在初始条纹阶段，预期的肝区域位于亨森氏节(Hensen′s node)前的中部和侧部区域。在头部的形成阶段，预期的肝区域与心脏区域一致，集中在从头部的顶端向初始凹痕稍后的区域延伸的双边区域内。通过在绒膜尿囊膜上组织片的移植，检测潜在的肝区域；在这样的移植体中肝的分化取决于心脏组织的存在在附近没有心脏细胞的地方没有发现肝组织，但是一些移植体则含有心脏组织而又不含肝脏。在原肠胚阶段完成后，在体节阶段期间，肝脏和心脏部分分离-推测的心脏间质向前并有益的移入心脏折叠中，预期的心肌细胞开始合并到心房中。使用碳粒标记、放射性摧毁(radiodestruction)、和胎盘片的体腔移植的另一组试验显示，在早期胚胎阶段期间添加上的肝内胚层和中胚层区域，以后的发展是不同的。
组织移植研究显示在正常的肝发育中，肝细胞的分化和肝裂片的形成完全取决于逐渐被生长的肝棒状体内胚层占据的中胚层组成(参阅Douarin，1975，同上)。已经证实这些心脏和肝脏间质的刺激性特性，在5个体节阶段开始，并持续整个胚胎生命。这里所阐述的发现表明，elf在早期心脏中胚层中表达，后来的表达对肝中胚层是限制的，表明对于肝发育的中胚层组成，这是一个新标记。值得注意的是，在正常发育中，纯的肝间质从未被观察到。这些演示了elf表达的移植研究说明，elf蛋白质在确定和研究中胚层和前肠内胚层间相互作用是很有用的。在肝细胞形成期间事件的总结说明elf的作用胚胎Elf阶段内胚层细胞过度生长 表达第9.5天 细胞极性出现变化第10.5天侵入和移入周围间质第11.5天假性裂片形成，肝细胞棒状体，早期窦状体形成第14.5天生血位点和完全分化的胎儿肝细胞序列分析显示elf与β-胞衬蛋白(一种非红细胞β-血影蛋白)有80％的一致性。β-血影蛋白有许多功能，包括维持细胞的细胞表面极性(Nelson et al.，J.Cell.Biol.108893-902，1989)；维持细胞-细胞的结合(Thomas et al.，Development 1202039-2050，1994，Luna et al.，Science 258955-964，1992)；β-血影蛋白含有与其他蛋白质结合的位点，如锚蛋白和肌动蛋白(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992；Speicher et al.，Nature311177-180，1980)。较小的异构β-血影蛋白也已充分地被描述过了。例如，4.0kb的肌肉组织转录体被认为是从群集的乙酰胆碱受体中编码一种以前报道的β-血影蛋白。同样地，对elf而言，缺少的区域可通过使用其他的外显子来替换，产生功能独特的蛋白质。这样，Elf的一种功能是对在细胞表面的特异区域的装配和维持，迈向肝细胞极性的建立，以及随后的肝细胞分化。
血影蛋白还显示保留在整个演化中，并随发育被调节。这些结果说明，与脑的β-血影蛋白(β-G血影蛋白)一起，elf也以组织和阶段特异方式表达并保留在整个演化中(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992；Zimmer et al.，Brain Res.594-75-88，1992；Leto et al.，Mol Cell Biol.81-9，1988)。Elf表达是以类梯度的方式进行的，在对脑β-G血影蛋白的精密检测显示了类似的梯度模式，表明在特异时间点的突然开闭现象是过于简单化了。Elf最大的表达在第10-11天表明，它在这个时间起着重要的作用，在随后的阶段仍持续着，尽管程度较小。例如，可以认为elf通过授予细胞极性，标记肝细胞分化的最初的明显迹象。因此，象果蝇β-H血影蛋白一样，elf在促进周边细胞膜在它们延伸时的“尼龙拉链式”的连接中可能起到作用(Thomas etal.，Development 1202039-2050，1994)。以这种方式，elf可标记环境中胚层细胞的极化，使得前肠内胚层细胞侵入这个区域并分化成肝细胞。在胚胎学研究中的诱导事件的解剖中，分子标记具有不可估量的价值(New et al.，Curr.Opin，Genet，Dev.1196-203，1991;Sive，Genes Dev.71-12，1993)。例如，在Xenpous中，Epi1，对上皮特异的抗体，已用来阐明胚孔唇缘在神经中枢诱导过程中的作用(Savage et al.，Dev.Biol.133157-168，1989)。同样，活化素(调节角蛋白)(Asashima et al.，P.N.A.S.886511-6514，1991)，vg-1(Thomsen et al.，Cell 63485-493，1990)，和其他属于TGF-β家族的基因，连同wnt和bFGF家族代表了导致特定中胚结局的各阶台的组成。例如，vg-1，最初是通过分化筛查而分离的，它是作用于细胞诱导的胚胎中胚层的，对胚胎未来一侧的vg-I前体蛋白的翻译后的处理是在非洲爪蟾的背中胚层和体轴的产生中的重要步骤(Thomsen et al.，Cell74433-441，1993)。同样地，在分离肝发育所需的假定诱导剂中的关键步骤是，对位于心脏/肝间质的mRNA的确定elf和它的调节基因对阐明这个区域是很有帮助的。
最近，细胞-细胞间的相互作用已经显示是对几种细胞的归属决定是很重要的。如在C.elegans中，lin-12和glp-1已经显示编码了调节细胞间通讯的跨膜蛋白质，并对几种先前的结局的特异性为必需的。在果蝇中，作为间质-上皮细胞转换的结果的次级上皮细胞的产生，被认为是取决于两个独立的粘着体系一方面是发育中肠内胚层和内脏中胚层之间的直接相互作用，另一方面是上皮细胞自身彼此的粘着相互作用。虽然后者的细胞-细胞相互作用被认为是通过鸟枪法控制的，顶基(apicobasal)极性的控制被认为是由基因如cnambs和stardust实施的(Tepass etal.，Cell 61787-799，1990)。尽管已知在肝细胞形成中，细胞表面极性的生原是早期事件，暗示原生质膜分子分类的机理在早期是功能性的，但在肝发育中涉及细胞信号导致细胞结局的基因迄今还没有确定。对这样的基因的确定，将对深入了解涉及前肠内胚层细胞迁移和随后肝作为器官的形态形成的细胞-细胞的相互作用给予极大的帮助。这些研究建立了一个理论特异中胚层mRNA是以确保它们随后与特异中胚层组织分离的方式定位的，在这种情况下，指的是假设的肝脏中胚层组成，正如胚胎移植研究中所显示的(Le Douarin，1975)。Elf的克隆和测序所有胚胎肝是从随机喂养的ICR鼠(Harlan)的交配中获得的。交配日定为第0天，收集交配后第10.0、11.5、12.5天的胚胎；用形态形成原则分阶段(Theiler，The House Mouse，New YorkSpringer-Verlag，1989)。将肝脏进行解剖，收集，和溶胞。为了制备cDNA文库，将RNA分离(Chomczynski et al.，Analyt.Biochem.162156-159，1987)及用oligo(dt)-纤维素(CollaborativeResearch Type3)选取poly(A)+RNA。在制备oligo(dt)-灌注的cDNA文库中使用1到5mg的poly(A)+RNA。第11.5和12.5天胚胎肝cDNA文库的建立用传统的技术实施(Gubler et al.，Gene25263-269，1983)，第10.0和成年鼠肝cDNA文库的建立使用Stratagene Unizap cDNA文库试剂盒。然后建立两个相减文库(Schweinfest et al.，Genet.Anal.Tech.Appl.764-70，1990)。得到的相减文库含有64个克隆体(11.5-12.5)，和110个克隆体(10.5-11.5)。过程包括(a)生物素化(biotinylation)50毫克的从第12.5天的肝文库获取的cDNA，10mg/ml，在HE缓冲液(10mM Hepes，PH7.5，1mM EDTA，Clontech Labs.)中生物素化；(b)通过链霉抗生物素蛋白-苯酚提取来进行相减过程链霉抗生物素蛋白-生物素杂交复合体表示，选择性地分开进入苯酚界面的共有基因产物，在水相中留下独特的被相减的单链cDNA。第二条链DNA合成及过夜沉淀后，十分之一的DNA用来转换感受态XL Blue细胞。使用所有相减DNA的转换可以确定174个重组菌落。噬菌体提纯、DNA的制备可通过Stratagene的体内切除方案实施。使用77DNA聚合酶对DNA质粒测序(Sanger et al.，J.Mol.Biol.143161-178，1980)。序列分析用blastp2和blastn2程序搜索NCGI无多余(nr)和EST数据库，这些程序允许有间断的对比(Aleschul et al.，Methods inEnzymology 256460-480，1996)，用默认参数和elf蛋白质或核苷酸序列作为检索命令。RNA制备和分析收集交配后第10.0、11.5和12.5天的胚胎。在Dulbecco改性Eagle培养基(高含量葡萄糖)和20mM Hepes PH7.3中解剖胚胎肝。将特异阶段的肝收集并分离全部的RNA(Chomcaynskiet al.，同上)。采用标准工艺(Smbrook et al.，1989，同上)将10毫克的RNA在1％甲醛凝胶上进行电泳，并转移到高结合(Hi-bond)尼龙膜上(Amersham)。用随机引物法(Feinberg etal.，Analyat.Biochem.137；266-267，1984)合成32P-标记的放射性的探针并与尼龙滤膜杂交。将滤膜高度严谨冲洗，最后在65℃的0.2×SSC(30mM NaCl，3mM柠檬酸钠，PH7.4)0.5％十二烷基硫酸钠中冲洗60分钟。将每个探针的滤膜作成条并与其他探针再杂交，以证实在初始筛查情况下不获得交叉杂交信号。然后，用加强筛在-70℃对这些滤膜进行放射自显影。原位分析对elf实施原位分析(Cox et al.，Dev.Bio.100197-206，1989)。合成RNA探针，并通过RNA聚合酶的T7或SP6启动子用35S-UTP标记(100Ci/mmol)。将有义或反义探针加到适当的部分，制作好，用橡胶粘合剂密封，在50℃温育过夜。温育后，将各部分用50％甲酰胺/5×SSC/10mM DTT(50℃；2×30分)冲洗，接着用4×SSC/TE冲洗，用RNase A(20mg/ml)和RNase TI(500U/ml；37℃30分钟)温育，再用4×SSC/TE(37℃30分钟)，两次用2×SSC(25℃15分钟)，两次用0.1×SSC(25℃15分钟)冲洗，用乙醇系列(含0.3M醋酸铵)脱水，在空气中干燥。作放射自显影，将底片浸入到用2％甘油水溶液1∶1稀释的NTB2乳液中，干燥。曝光时间为0周到四个月。依据制造商的说明使乳液显影。Elf的体外翻译使用体外Eukaryotic Translation Kit和MCAP mRNA CappingKit(Stratagene)，将含有elf的Bluescript用T7RNA聚合酶转录。在〔35S〕蛋氨酸存在下，使用核酸酶处理的兔子网状细胞溶胞体(Promega)中，将RNA转录体进行90分钟体外翻译成为蛋白质，并且在4％改性的聚丙烯酰胺凝胶上走胶。肝移植培养物从Harlan ICT鼠获取鼠胚胎。通过出现阴道栓(plug)(0天)后的天数确定胚胎的年龄。胚胎可进一步用体节数表征。分离鼠肝内胚层、肝胚芽和中胚层(整体解剖)如下在妊娠第10天，肝胚芽开始变得明显，是一厚层前肠的腹部壁，靠近卵黄蒂的起源。然后，这种腹部内胚层或者单独取出培养，或者与周围中胚层在听泡和脐带起源之间的胚胎部分一起取出培养。器官培养在如所述的湿润舱室内(Houssaint，1980，同上)，将胚胎放进核孔滤膜中，培养48小时或96小时。显微镜法将移植体如在原位方案中固定，并按如上所述分离RNA。用苏木精，曙红和高碘酸[periodic acid schiff(PAS)]对7mm切片的糖原进行染色，指示分化的肝细胞。为作RNA分析，如在图19和20中所述，实施半量RT-PCR。本发明已经考虑到的是，使用这种肝移植培养物作为组织修复的合成物，作为肝修复疗法的一种形式。免疫组织化学描述将对应于praja1(COVANCE)的第145-157号的氨基酸(CLRRKYRSREQPQS)的肽的抗体，用作肝移植培养物中免疫组织化学定位。将胚胎固定并嵌入石蜡中，进行切片后，依据常用方案使用间接免疫组织化学进行免疫染色(Schevach，Currentprotocols in immunology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，1991)。在二甲苯中将8μm的切片脱去石蜡，将组织在酒精梯度中再水合，用PBS冲洗。首先用蛋白酶处理切片(0.1％Trypsin在0.5M的PBS中)，并在37℃温育30分钟。用3％过氧化氢去除内生过氧化物。将切片在室温下用含有5％山羊血清的PBS封闭30分钟。然后，在4℃将切片在Humidor中，用针对PRAJA1肽的兔子抗鼠抗体的稀释液温育过夜。所有后面的步骤都在室温下进行。在每个后续的步骤之后，用PBS-S冲洗六次5分钟。在初级抗血清中温育后，将切片在室温下用1×PBS冲洗6次5分钟。将切片用二级抗体(在0.05M PBS1％血清中稀释的)室温下温育30分钟。
冲洗后，按如下加入底物不溶的过氧化酶底物DAB(SigmaFast)。加入100-150微升的底物溶液，覆盖切片上的全部组织。在显微镜下监测显色。在用蒸馏水冲洗5分钟后，用Harris苏木精改性溶液(Sigma)染色1分钟，接着用蒸馏水冲洗5分钟。将切片经过蒸馏水、然后是酒精浓度梯度、最后是二甲苯来脱水。在观察前，用DPX(Fluka labs)或Permount(Fischersceientific)将盖玻片安装上。对于阴性对照物，仅加入初级抗体的稀释溶液，没有任何抗体。抗体的产生针对elf3 C-终端和N-终端中的序列的肽特异性兔子抗鼠多克隆抗体的产生，按照Porter等人[Porter et al.，J.Cell.Biol.117997-1005(1992)]所述进行。合成肽的序列，对于EL-1制备是ELQRT SSVSG PLS(在N-终端上的2-14个残基)，对于EL-2制备是FNSRR TASDH SWSGM(在C-终端上的残基2140-2154)。用蛋白质A/G柱(Pharmacia)从抗血清中分离IgG，并加到亲和柱上，盖亲和柱已经用适当的合成肽与其共价结合了(Pharmacia)。将柱用几个体积的缓冲的生理盐水冲洗，然后用Elution缓冲液(Pharmacia pH2.8)洗脱。洗脱的各部分收集在含有足够的1M Tris-HCl且pH8.0的试管中，调节pH到7.2。将亲和提纯的抗体和没有与亲和柱结合的抗体部分用含10mM NaN3的缓冲盐液透析，保存在4℃。
抗体的特异性的检测是，通过酶连免疫吸附测定法(ELISA)并随后进行Engvall法(Methods Enzymol.70419-439，1980)，或通过由SDA-PAGE分离的合成肽的免疫印迹法测定。从ELISA测得的结果证实了抗体对它们相应抗源的特异性，与在免疫印迹所测的一样。
权利要求
1.一种核酸序列，其编码早期肝发育蛋白质，选自包括基因20、36、41、112、114、118、129，和编码elf蛋白质1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白质106和praja-1的基因的组中。
2.权利要求1的核酸序列，其中所述的核酸编码elf蛋白质，并且其中的序列从含有图2a、图2b、和图2c所示的序列中选取。
3.权利要求1的核酸序列，其中所述的核酸编码liyor-1(145)，并且其中的序列如图1所示。
4.权利要求1的核酸序列，其中所述的核酸编码pk，并且其中的序列如图4所示。
5.权利要求1的核酸序列，其中所述的核酸编码蛋白质106，并且其中的序列如图5所示。
6.权利要求1的核酸序列，其中所述的核酸编码praja-1，并且其中的序列如图3所示。
7.一种被分离的早期肝发育蛋白质，选自包括elf、liyor-1(145)、pk、蛋白质106和praja-1的组中。
8.权利要求7的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是elf蛋白质。
9.权利要求8的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是从含有图2a、图2b、图2c所示的序列中选取的核酸序列编码的蛋白质。
10.权利要求7的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是liyor-1(145)。
11.权利要求10的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是由如图1所示的核酸序列编码的蛋白质。
12.权利要求7的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是pk。
13.权利要求12的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是由如图4所示的核酸序列编码的蛋白质。
14.权利要求7的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是蛋白质106。
15.权利要求14的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是由如图5所示的核酸序列编码的蛋白质。
16.权利要求7的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是praja-1。
17.权利要求16的分离的早期肝发育蛋白质，其中所述的蛋白质是由如图3所示的核酸序列编码的蛋白质。
18.一种治疗肝疾病的方法，所述的肝疾病选自包括胆汁郁积，胆结石，肝阻塞，肝狭窄，原发性胆硬化，和原发性硬化性胆管炎的一组，所述的方法包括给患有一种这些病况的患者服用有效量的elf蛋白质。
19.一种治疗肝疾病的方法，所述的肝疾病选自包括晚期肝疾病，肝细胞癌，缺水性外胚层发育异常，衰退性神经病学上的病变，贫血，共济失调和血色沉着病的一组，所述的方法包括给患有一种这些病况的患者服用有效量的从praja-1、liyor-1(145)、和pk组中选取的肝细胞形成蛋白质。
20.权利要求19的方法，其中治疗的疾病是铁粒细胞性贫血(Sideroblastic anemia)。
21.权利要求19的方法，其中治疗的疾病是脊髓小脑共济失调。
22.一种检测结肠癌的方法，该方法包括从患者获取结肠细胞，测试细胞中praja-1的存在，然后根据在测试细胞中对praja-1的检测，确定细胞是否是癌化的。
23.一种分离编码早期发育肝蛋白质的基因的方法，该方法包括的步骤为建立交配后e9到e14.5各阶段内的发育鼠的cDNA文库，分离编码在至少一个这些阶段期间表达的肝蛋白质的cDNA。
24.权利要求23的方法，其中所述的cDNA文库建立的各阶段包括(1)交配后约e9-e10天，(2)交配后约e10.5-e11天，(3)交配后约e11.5-e12天，(4)交配后约e13-e14.5天。
25.权利要求23的方法，其中分离的cDNA编码阶段特异性早期发育肝蛋白质。
26.一种编码早期发育肝蛋白质的分离的基因，由权利要求23的方法制备。
27.一种分离的早期发育肝蛋白质，由权利要求26的分离的基因表达制备。
28.一种针对权利要求7的蛋白质而培养的抗体。
29.一种培养的肽的抗体，所述的肽选自如下所述的一组在鼠elf基因N-终端aa2-14上的肽，其序列为5-ELQRTSSVSGPLS-3；在鼠elf基因C-终端aa2140-2154上的肽，其序列为5-FNSRRTASDHSWSG-3；在鼠praja-1基因中部aa144-156上的肽，其序列为5-LRRKYRSREQPQS-3；来自基因145(Cded)C-终端的145肽-A，其序列为5-SAQSLVVTLGRVEGGIRV-3或5-CSAQSLVVTLGRVEGGIRV-3；来自基因145(Cded)中部的145肽-B，其序列为5-KIEGSSKCAPLRPASRL-3或5-CAPLRPASRLRASQTLG-3；来自基因G59(Praja1)N-终端的g59肽-A，其序列为5-PPREYRASGSRRGMAY-3或5-PPREVYASGSRRGMAYC-3；来自基因G59(Praja1)中部的g59肽-B(15-mer)，其序列为5-CKVPRRRRTMADPDFW-3，和包括itih-4d两个EF-手生基元序列的融合蛋白质。
全文摘要
提供分离和测序的早期发育阶段特异肝蛋白质和其编码基因。这些基因和蛋白质可用来诊断和/或治疗多种肝病变和其他疾病。本发明确定和分离的蛋白质包括elf1－3、liyor－1(145)、pk、蛋白质106、和praja－1,以及编码这些和其他蛋白质的核酸序列,并且可以培养从这些蛋白质衍生的肽的抗体。因为本发明的早期发育肝蛋白质是在当肝和其他器官从无分化到分化转变的胚胎期间产生的,所以这些蛋白质与组织分化有关,因此,它们可被用于诊断和治疗多种肝疾病和其他病变,如那些涉及肿瘤生成和组织修复的疾病。因此,依据本发明分离的蛋白质应与诊断和治疗从晚期硬化到肝细胞癌及许多其他疾病状况有关。
文档编号C07K16/18GK1254290SQ98804664
公开日2000年5月24日 申请日期1998年4月30日 优先权日1997年4月30日
发明者洛帕·米莎瑞 申请人:洛帕·米莎瑞