专利名称：含3-邻位-脱酰基的单磷酰基脂质a的流感疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防人类流感传染的疫苗。
背景技术：
流感病毒的传染能够引起人，马和家禽的急性呼吸道疾病，有时会引起大流行。流感病毒属于RNA病毒的正粘液病毒家族，并且它本身带有直径为80到120纳米的包裹病毒粒子，具有两个外部糖蛋白刺突，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，和五个内部蛋白质，核蛋白质，基质蛋白和三种聚合酶。流感病毒的RNA也能编码两种在感染的细胞中产生的非结构蛋白质(NS1和NS2)，但却不将其结合到感染的病毒粒子中。
流感病毒的三种类型A型，B型和C型都能传染人类。在现代史上尽管也偶尔暴发B型传染病，但A型病毒是造成人类大多数流行病的原因。尽管也从猪分离出了C型病毒，但已知的猪，马和家禽的病毒大多数还是A型。
在病毒中，表面蛋白HA和NA的遗传性突变已产生了三个重要的亚型，称之为H1N1，H2N2和H3N2。在A型中，亚型H1(“猪流感”)，H2(“亚洲流感”)和H3(“香港流感”)是人类传染中最主要的。
流感病毒能够在其表面糖蛋白中连续经过能够影响抗原性变异的基因变异。在A型病毒中这是最明显的，其中在HA或NA蛋白中已经发生大多数基因变异(“抗原转变”)。这些新病毒亚型的出现已引起了导致显著死亡率和致病率的传染病的大范围传播。例如，在1957年之前流行的H1N1病毒已被H2N2病毒亚型所取代，并且一直流行到1968年，它们又接着被H3N2亚型所取代。目前，H3N2菌株仍在流行，但自1977年H1N1病毒又重新出现。在特定亚型中的HAs也能每年或每隔两年发生较小的基因变异(点突变)(“抗原性漂离”)。这些大都局限于HA1中唾液酸结合位点周围的抗原决定簇，并且引起新病毒菌株的出现。尽管这些抗原性漂离不能引起比抗原漂离所引起的程度更严重的死亡率和致病率，它还是造成每年流感流行的主要原因。
流感疫苗可分为三种，全病毒粒子型，分离型和亚单位型。尽管以完整病毒颗粒为基础的全病毒粒子型疫菌一般免疫原性较强，但它更趋向于反应原性，因此，它们被分离型和亚单位型的疫苗所取代，这种分离型和亚单位型疫苗是由用各种化学试剂处理破裂病毒后所获得的纯化的病毒组份来制得。分离型和亚单位型疫苗之间的区别在于亚单位型疫苗几乎只含有血凝素和神经氨酸酶，病毒的表面抗原，而分离型疫苗还含有不同量的病毒内部组份，如核糖核蛋白和基质蛋白。
通常可得到的商品流感疫苗是基于抗HA或NA的抗体能给予保护的原理。它们是由利用在鸡蛋胚胎中生长的病毒的无辅药的无活性的完整或分离的病毒产品组成的。所有的流感疫苗目前一般都含有H1N1，H3N2和B型病毒菌株的制剂。由于每年的抗原改变，按照WHO推荐的每年的基准对特定病毒的菌株要随时进行改变，其中WHO的推荐是基于流行病学监视下的当前流行的病毒菌株。
现在没有“通用”的流感病毒疫苗，即，一种非菌株特殊性疫苗。目前，人们已经进行这种尝试，即从杂交不同菌株制成的再相配(reassortant)病毒制备这种通用或半通用的疫苗。近来，这种尝试已涉及主要集中于HA蛋白上的重组DNA技术。
因为人们怀疑流感疫苗的功效，害怕其副作用，必需每年再接种和生产者缺少效益这些不同的原因，所以流感疫苗使用不足。已经证实本疫苗抗流感病毒传染的有效率约为60-80％范围，该流感病毒与这种疫苗中所用的病毒菌株在抗原上最相近。当流行菌株HA的HA抗原“漂离”疫苗菌株时，保护有效率趋于下降，如果亚型中发生“转变(shift)”，保护有效率将降为零。此外，在一些免疫妥协的人群中，如生活在疗养所的上了年纪的人中，这种保护也似乎减弱。
所以，造成目前可得到的疫苗的主要缺点的原因是，频繁的抗原漂离表明组成的病毒菌株每年都在改变，并且个体必须进行再接种。
在本领域中一直需求能够在动物体内激发对抗广泛的不同病原体的保护反应的疫苗制剂和组合物。
发明概要一方面，本发明提供了一种能够在接种动物体内激发抗流感的一种增强性免疫和保护反应的疫苗组合物，它含有一种选择的流感抗原或抗原性多肽以及一种有效量的3-邻位-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)。
另一方面，本发明也提供了一种疫苗组合物，它包含一种选择的流感抗原或抗原性多肽，一种有效量的3D-MPL以及一种脂质体制剂。这种脂质体制剂在此进行了定义，并且除了作为一种载体之外，还作为一种辅剂，并且具有明显的生产和配制优点。
还有一方面，本发明还提供了一种增强对选择的流感抗原的疫苗免疫反应的方法。该方法包括给一种哺乳动物，特别是人，施用一种上述疫苗组合物。
在下列详细描述的本发明的优选实施方案中将进一步说明本发明的其它方面和优点。
对附图的简要说明
图1是一幅直条图，它说明了用实施例18中所述的铝加3D-MPL中的流感D蛋白(SK & F106160)免疫接种的小鼠对H1N1和H2N2亚型流感病毒的交叉保护。
图2A是一幅直条图，它用来说明用流感D制剂免疫接种的小鼠和对照组在激发前的脾增生反应。见实施例20。
图2B是一幅直条图，它用来说明用流感D制剂免疫接种的小鼠和对照组激发后的脾增生反应。见实施例20。
图3A是一幅直条图，它用来说明用20μg铝中流感D(空心直条)或铝和3D-MPL(阴影直条)中的流感D免疫接种的小鼠第4天所获得的淋巴结增生反应。见实施例21。
图3B是一幅直条图，它用来说明用5μg铝中流感D(空心直条)或铝和3D-MPL(阴影直条)中的流感D免疫接种的小鼠第4天所获得的淋巴结增生反应。见实施例21。
图3C是一幅直条图，它用来说明用1μg铝中的流感D(空心直条)或铝和3D-MPL(阴影直条)中的流感D免疫接种的小鼠第4天所获得的淋巴结增生反应。见实施例21。
图4A是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠中免疫淋巴结第2天的增生。见实施例21。
图4B是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠中免疫淋巴结第3天的增生。见实施例21。
图4C是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠中免疫淋巴结第4天的增生。见实施例21。
图4D是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠中免疫淋巴结第2天IL-2的产量。见实施例21。
图4E是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠中免疫淋巴结第3天IL-2的产量。见实施例21。
图4F是一幅直条图，它用来说明用1μg D蛋白疫苗制剂免疫接种的小鼠免疫淋巴结第4天IL-2的产量。见实施例21。
图5A是一幅用来说明从按下列实施例24中所述方法免疫接种的小鼠中获得的抗原激发的培养物中干扰素的含量的图。
图5B是一幅用来说明从按下列实施例24中所述方法免疫接种的小鼠中获得的抗原激发的培养物中IL-2的含量的图。
图6A是一幅曲线图，它显示了用一种含铝和3D-MPL的对照物(……□……)和含有无佐剂的A/PR/8菌株的流感单价分离型疫苗(……▲……)以及含3D-MPL佐剂的A/PR/8菌株的流感单阶分离型疫苗(实线和固点)激发(每组5只小鼠)后第1，3，5，7和9天用MDCK显微测定法在鼻中测定的病毒效阶。见实施例28。
图6B是一幅曲线图，它显示了用一种含铝和3D-MPL的对照物(……□……)，含有无佐剂的Singapore菌株的流感单阶分离型疫苗(……▲……)以及含3D-MPL佐剂的Singapore菌株的流感单价分离型疫苗(实线和园点)激发(每组5只小鼠)后第1，3，5，7和9天用MDCK显微测定法在鼻中测得的病毒效价。见实施例28。
图6C是一幅曲线图，它显示了用与图6A中相同的三种疫苗制剂激发(每组5只小鼠)后第1、3、5，7和9天用MDCK显微测定法在气管中测得的病毒效价。
图6D是一幅曲线图，它显示了用与图6B中相同的三种疫苗制剂激发(每组5只小鼠)后第1，3，5，7和9天用MDCK显微测定法在气管中测得的病毒效价。
图6E是一幅曲线图，它显示了用与图6A中相同的三种疫苗制剂激发(每组5只小鼠)后第1，3，5，7和9天用MDCK显微测定法在肺中测得的病毒效价。
图6F是一幅曲线图，它显示了用与图6B中相同的三种疫苗制剂激发(每组5只小鼠)后第1，3，5，7和9天用MDCK显微测定法在肺中测得的病毒效阶。
本发明的详细描述本发明提供了能够激发接种的宿主包括人体中加强型免疫反应的疫苗组合物，以及制备和施用该疫苗组合物的方法。本发明的疫苗组合物的特征在于它含有一种有效量的选择的流感抗原或抗原性多肽以及3一邻位-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)。优选地，一种脂质体制剂也可以是本发明疫苗组合物的一种组份。
本发明人已经发现把3D-MPL和特定流感抗原结合起来能有效地获得抗流感的保护反应，这种保护反应由单一的流感抗原是不能获得的。例如，对下列所述的叫做流感D的抗原性多肽来说，这种反应比用纯化的流感D和一种对动物有毒的已知强烈佐剂弗氏完全佐剂(CFA)获得相同的结果所需的抗原量更低。
而且，当在本文所述的脂质体中包裹选择的流感抗原和3D-MPL时，所获得的保护性反应超过了由该抗原和任何其它佐剂组合所获得的保护性反应。
这里所用的术语“加强型免疫反应”意思是指接种的宿主能够对本发明的疫苗组合物产生强于宿主对无佐剂的选择抗原或用其它适合内服的常用佐剂辅助的选择抗原所产生或能够产生的细胞免疫反应(保护性T-淋巴细胞的产生)。这种加强型反应也能产生增加的抗体(B细胞)反应。
这里所用的术语“免疫有效量”或“有效量”是指能够诱发保护性免疫反应的抗原量。
这里所用的术语“选择的抗原”，“抗原性多肽或蛋白”或“免疫原”是指一种完整的或非活性病原体，该病原体中的一种免疫原性的蛋白，肽或片断，可以任选与同源或异源的其它肽或蛋白融合。这些术语也包括下列定义的一种分离型病毒。这些术语也可以包括来源于病原体的非蛋白生物物质。尽管为兽医目的所需在这些疫苗中也使用了动物病原体，但这些病原体还是优选能传染人类引起疾病的病原体。这些术语也指在一种接种宿主中这些完整型病原体，分离型病毒，肽或融合蛋白诱发保护性免疫反应的能力。
术语“单价疫苗”是指一种含有来自单一类型或亚型流感病毒如，A型、B型和C型的H1N1，H2N2，H3N2的抗原的疫苗。
术语“多价疫苗”是指一种含有来自多种类型或亚型流感病毒的抗原的疫苗，即，一种三价疫苗可含有来自任意三种流感类型或亚型，如A型、B型和C型的H1N1，H2N2，H3N2的抗原。
术语“分离型病毒”是指一种部分纯化和浓缩的流感病毒悬浮液，可由成批菌种物质接种的鸡蛋胚胎中获得。用一种洗涤剂，如脱氧胆酸钠，处理浓缩的病毒悬浮液来破裂病毒颗粒。在这步分离过程中除去病毒膦脂能产生一种无活性的流感抗原，这样大大降低了抗原的致反应能力。用洗涤剂和甲醛的结合作用可使分离的病毒悬浮液全部失活。
下面公开的本发明组合物和方法具体描述了疫苗组合物对流感病毒的预防用途。
在本发明的一个优选实施方案中，一种能够诱发抗流感病毒传染的加强型免疫保护反应的疫苗组合物，含有至少一种用3D-MPL辅助的选择的流感抗原性多肽，如NS11-81HA265-222(这里指流感D，D蛋白或流感D蛋白)。
目前，因为流感D蛋白是最容易纯化的含有血凝素区HA2部分完整羧基末端区的流感融合蛋白，所以它是用于本发明疫苗组合物的一种优选流感抗原性多肽。D蛋白含有与平端的HA2亚单位(氨基酸65-222)的氨基酸65融合的NS1的第一个81氨基酸。任意地，正如含有本文所公开的其它NS1-HA2融合蛋白那样，可在这两种融合序列之间接入一个人工接头序列。
在该优选实施方案中，按照EP 0366238中所述的方法，用PvuII限制HA2编码序列，并通过一种合成寡核苷酸人工接头在NS 1编码序列中氨基酸81和82之间连接NcoI位点的C-末端区，来制备流感D蛋白的DNA编码序列。这种人工接头序列能编码谷氨酰胺-异亮氨酸-脯氨酸。已达到90-95％纯度的D蛋白需要使用本文所述的纯化方法来基本除去宿主细胞(大肠杆菌)蛋白和其它污染物。
在共同未决美国专利申请SN 07/751,899及其1990年5月2日公布的相应的欧洲专利申请366,238和美国专利申请Sn 07/387，558以及1990年5月2日公布的欧洲专利申请366,239中详细描述了流感D蛋白及其重组表达和纯化方法。这些申请作为参考文献并入本文来描述这种蛋白，及其表达和纯化方法。
在本发明的疫苗组合物中除可以使用流感D外，可以使用其他的合适流感抗原性多肽，包括欧洲专利申请366,238和EP 366,239(二者均于1990年5月2日公布)以及共同未决的美国专利申请SN07/751,898,07/751,896和07/837,772中所描述的那些合适的流感抗原性多肽。这类蛋白包括ΔM，ΔM+，A，C，C13，C13短肽，和ΔD。其它适合的还包括Cys-less D，HA266-222，和NS1H3HA2构建体，如本文引用作为参考文献的共同未决美国专利申请序列号07/751，898，07/751，896和07/837，772以及WO93/15763中所述的那些。特别理想的是上述引用的H3HA2构建体。本发明者近来的研究已经表明用含NS1-H1HA2和NS1-H3HA2融合蛋白的“合剂”给小鼠免疫接种可保护其不受H1和H3两种病毒亚型的致命攻击。
用公知技术合成制备HA2，NS1和流感病毒的其它病毒蛋白的编码序列或者从病毒RNA制备，或者如上述引用的公开的欧洲申请中所描述，从可得到的含cDNA质粒制备。例如，除上述引用的参考文献外，Gething等Nature，287301-306(1980)报道并克隆和测序了一种来源于A/Japan/305/5 菌株的HA的DNA编码序列；按Sleigh等和Both等二者在Developments in Cell Biology，Elsevier Science Publishing Co.，第69-79和81-89页，(1980)中所报道，克隆A/NT/60/68菌株的HA编码序列，按Davis等Gene，10205-218(1980)和Hiti等Virology，111113-124(1981)所报道克隆菌株A/WSN/33的HA编码序列，按Porter等和Fmtage等二者在上述引用的Developments inCell Biology，第39-49和157-168页中所报道，克隆家禽瘟疫(plague)病毒的HA编码序列。
在各种微生物和细胞中克隆和表达该疫苗多肽的系统包括，例如，大肠杆菌，杆菌属，链霉菌属，酵母属，哺乳动物和昆虫的细胞，是公知的，并可由私人和公共实验室和保藏中心以及商业卖主处获得。
可用下面实施例13中所述的方法纯化D蛋白。尽管这类其他方法对于获得高纯度的药物等级产品是非必须的，但可以使用与本发明组合物的蛋白纯化有关的常规技术，在上述方法步骤之前、之后或之间可以使用这类步骤。这类任选步骤中的一种是透析过滤方法，它是一种连续透析方式，对完成许多缓冲液的相互交换非常有效。优选通过一种纤维素膜或超滤器来进行透析过滤。合适的膜/滤器是能截止约1000分子量(MW)的那些到具有孔隙大小最大为2.4μm直径的那些。适合透析过滤法的许多不同系统都是商业上可获得的，如10KAmicon双螺旋药筒系统。在本发明方法中，能够有效地使用以pH约为8的20mM Tris缓冲液进行的透析过滤来纯化并随后浓缩本发明疫苗组合物中所用的多肽。
在其它优选实施方案中，本发明疫苗组合物中所用的抗原是一种完整的失活病原体，如在实施例25中详细描述的一种分离型病毒。也可以用3D-MPL辅助含有一种分离型病毒的单价分离型流感疫苗或含有一种以上分离型病毒的多价(如三价)分离型流感疫苗。在一种制剂中，该疫苗含有由一种H1N1菌株，如Singapore/6/86，制得的分离病毒[Sachsisches Serumwerkl GmbH(SSW)，Dresden，German and the National Institute for Biological Standardsand Control(NIBSC，London，England)]，目前它常用于一般流感疫苗中。另一方面，其它H1N1分离型病毒也可由A/PR/8/34(也叫A/PR/8)(T.Francis，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，321172(1935))中制得，并可从美国典型培养物保藏中心Rockville，Maryland，USA以ATCC No.VR-95获得。单价疫苗含有流感型病毒的一个菌株的抗原。另一方面，该疫苗可以是多价含有一种流感抗原以上的，如两种或三种分离的病毒，来增加对一种以上流感型病毒的反应性。三价疫苗的一个例子包括如，H1N1Singapore/6/86菌株，一种H3N2菌株Beijing/32/92[SSW，Dresden，Germany]和一种B型菌株，Panama/45/90[SSW，Dresden，Germany]。
如实施例25中所述用公知方法能够制备作为分离型病毒的流感病毒，包括任意菌株，亚型和类型，特别是WHO推荐的那些，它们中的大多数可由临床样本和公共保藏中心，如美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockyille，Maryland，20852，USA(ATCC)和NIBSC获得。例如，其它合适的H3N2病毒菌株包括(不作限定)，Fiers等，Cell，19683-696(1980)中所述的A/victoria/H3/75；在C.J.Lai等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77210-214(1980)；Palese和Schulman，Virol.57227-237(1974)中所述的A/Udorn和在WHO Weekly Epid.Record，vol.43401(1968)中所述的A/HK/8/68，它可由ATCC以保藏号No.VR-544获得。以及Beijing/32/92。其它适合的B型菌株包括(不作限定)叫做B/Lee/40的那些，如Krystal等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，794804-4900(1982)所述，和B/Taiwan，它可由ATCC以No.VR-295获得，Panama/45/90以及B/Yamaghta菌株。H2N2病毒也可用于这些疫苗中。
应当理解为除其它流感病毒或失活病毒制剂外，按照本文所教导，除举例所用的抗原外，还可以使用来自其它病原体的其它抗原物质。
本发明疫苗组合物的其它组份是佐剂，3D-MPL。在本文引用的参考文献美国专利4,912,094中详细描述了3D-MPL，并且从RIBI Immunochem Research Inc.，Hamilton，Montana可买到它。简要地说，3D-MPL是内毒素单磷酰基脂质A(MPL)的一种衍生物，单磷酰基脂质A(MPL)是一种由无庚糖的，革兰氏阴性细菌如Salmonella minnesota的RE突变体中分离得到的脂质A类似物。MPL在葡糖胺的C-1位置上没有磷酸基。处理MPL分子，在葡糖胺的3位上除去酰基链获得3D-MPL。3D-MPL与其它肠细菌脂多糖相比没有毒性，但却保留着亲本内毒素的抗原活性。该分子可用于预防革兰氏阴性脓毒病和内毒素血症。
可把3D-MPL溶于水得到囊泡聚集物的溶液，该聚集物可能是由脂质双层膜组成。所以，免疫系统不可能把3D-MPL当作是单个分子对待，而是由膜-膜的接触包括细胞表面和泡表面的接触而相互作用。
在优选的实施方案中，MPL颗粒大小“较小”，并且一般不超过120nm。
制备一般不超过120nm的小颗粒的3-脱酰基的单磷酰基脂质A.可以使用GB 2220211中所述的方法(或从Ribi Immunochem可买到大颗粒的商用MPL)，并且然后把产物超声波处理直到悬浮液变清。用下文所述的动态光散射测定颗粒大小。
颗粒大小优选在60-120nm内。
最好的颗粒大小在100nm以下。
按照本发明，发明者已测得一种流感抗原性多肽，如流感D蛋白，当高度纯化时，没有佐剂存在下既无免疫原性又无保护性。但是，如本文所述并在下文实施例14-24中详细说明的，当用3D-MPL辅助时，该蛋白就能诱发抗流感传染的保护反应。当选择抗原是一种存在于单价或三价组合物中的分离型病毒时，本发明的组合物证实其免疫原性和交叉反应性有所增加。
而且，发明人还发现当用3D-MPL辅助一种流感抗原性多肽例如，流感D蛋白时，只需要较低剂量的流感D蛋白就可达到与只用铝佐剂辅助该蛋白时所获得的相同水平的免疫反应。当选择的抗原是一种单价或三价组合物中的分离型流感病毒时，在本发明此实施方案中使用少量抗原将会降低该组合物的致反应性。
本发明的疫苗组合物中还可以包括其它佐剂。一种理想的其它佐剂是明矾或氢氧化铝或磷酸铝。当用铝和3D-MPL的组合物辅助流感D蛋白时，能达到等同于用完全弗氏佐剂(CFA)所观察到的效能水平，这种传统的完全弗氏佐剂可支持T细胞反应，但不适合人内服。
为制备含有一种抗原性多肽如流感D蛋白和3D-MPL的本发明优选疫苗组合物，把所需用量的流感D蛋白与一种合适用量的3D-MPL混合，如下文更详细地描述。任选地，在加入抗原之前也可把冻干的脂质A与下文详述的前脂质体凝胶混合。磷脂与脂质A的摩尔比最优选为66∶1。但是，试剂密度可根据所需水平而有所不同。
加到该疫苗组合物中的其它适合的试剂包括，如IL-2，QS21[C.R.Kensil等，J.Immunol.，146(2)431-437(1991)]和胞壁酰二肽(MDP)。此外，也能把上述其它水溶性或不溶于水的化学品或药物和/或佐剂掺入本发明的疫苗组合物中。例如，也可以使用如上所述或所需的相似比例的胞壁酰二肽。可构成该疫苗一部分的其它药物可包括加入该疫苗时能改良其一种或多种功能的物质，如在官方药典上所列的那些物质，或者用于治疗或预防传染的物质。
本发明的疫苗组合物还可以含有在疫苗领域中熟练技术人员所公知的并能容易选择的适当载体。举例的载体有无菌生理盐水，乳糖，蔗糖，磷酸钙，明胶，糊精，琼脂，果胶，花生油，橄榄油，芝麻油，角鲨烯和水。此外，载体或稀释剂还可包括一种缓释的物质，如单硬脂酸甘油酯，双硬脂酸甘油酯或含蜡的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。可以任选使用合适的化学稳定剂来提高该药剂的稳定性。合适的化学稳定剂对本领域熟练技术人员来说是公知的，它包括如调pH值的柠檬酸和其它试剂，螯合剂或多价螯合剂以及抗氧化剂。另一方面，当脂质体释放系统是该疫苗组合物的一部分时，就不需载体。
本发明的另一种优选的疫苗组合物含有一种选择的抗原，如上述流感D蛋白和3D-MPL，把这些组份包裹或添入一种脂质体制剂中。含有脂质体，流感D蛋白和3D-MPL的疫苗组合物还可任选含有一种或多种其它流感抗原或其它抗原或上述所需的佐剂和试剂。在一种优选制剂中，该疫苗含有置于一种载体脂质体中的抗原性多肽流感D蛋白和3D-MPL。在另一种制剂中，该疫苗含有类似地包裹在一种载体脂质体中的一种单价或多价流感抗原。
本发明入已发现本文所述的脂质体制剂不仅能够作为载体，也可作为佐剂，并且具有特殊的优点，这是因为其制备不需要有机溶剂或高剪切范围，而这对蛋白药物来说却是明显有利的，并且脂质体的所有成分是内服安全的。由于这种制备方法的简单性和灵活性，所以这些脂质体制剂适合于大规模生产。
本发明者还发现能够很容易地把3D-MPL与流感抗原结合掺入本文所述的脂质体结构中，获得的结果优于流感抗原与公知常规佐剂结合所得到的结果。很明显，在3D-MPL和脂质体制剂中含有D蛋白的疫苗组合物比CFA中的D蛋白具有更好的功效，参见下文的实施例20和22。
在本文引作参考文献的共同未决美国专利申请序列号07/714，984，(US 5230899)中描述了本发明的疫苗组合物和方法中所用的脂质体制剂。一般，该术语“脂质体”被作为一种在科技文献中用于描述合成的寡层脂质载体的术语而提出和被接受。这种载体一般在内部含水相周围含有一种或多种浓缩的天然或合成脂质双层。
如本文具体定义的和按照所引用的参考文献，在一种含水介质中以足以形成脂质体的方式分散一种含有脂质体形成物质的组合物来制备本发明疫苗组合物所用的脂质体制剂，其中所说的含脂质体形成物质的组合物含有长链脂肪族或芳香族酸或胺；一种与该酸或胺电荷相反的水和剂(hydrating agent)，该水合剂以相对于该酸或胺1∶20到1∶0.05的摩尔比的量存在；以及相对于固体最高达300摩尔量的水。
用于本发明的脂质佐剂载体制剂如下。形成脂质体的物质例子包括可皂化的和不能皂化的脂质类，如酰基甘油类，磷酸甘油酯类，神经鞘脂类，糖脂等。脂肪酸包括饱和或不饱和的烷基(C8-C24)羧酸，C4-C10二羧酸单烷基(C8-C27)酯(如氨基酸的胆甾醇半琥珀酸和脂肪酸衍生物，其中也包括任何N-酰基羧酸(如，N-油酰基苏氨酸，N-亚油酰基丝氨酸等)。单-或双烷基(C8-C24)磺酸酯和单-或双烷基(C8-C24)磷酸酯能够取代脂肪酸。而且，磷酸的单-或双酰基(C8-C24)甘油衍生物和硫酸的单-或双酰基(C8-C24)甘油衍生物能够用来替代脂肪酸。
此外，也能用胺(如，C8-C24NH2)，胺的C8-C24脂肪酸衍生物(如，C8-C24CONH～NH2)，氨基酸的C8-C24脂肪醇衍生物(如，C8-C24OOC～NH2)，和胺的C8-C24脂肪酸酯(如，C8-C24COO-NH2)替代该脂肪酸。
也能包括光聚合性脂质类和/或脂肪酸(或胺)(如，二炔脂肪酸)，一旦起始光聚合作用它就能提供一种用交联的双层膜密封的脂质体。
长链脂肪族和/或芳香族酸或胺包括具有一个开链结构并由链烷烃、链烯烃和炔烃及其衍生物组成的一种酸或胺，即饱和和不饱和烃或这类链的骨架含有一个芳香取代基。这种酸和胺可以具一个以上这种官能团。术语“长链”是指该酸或胺的脂肪族链的骨架有十个或十个以上的碳原子。如果这链含有一个芳香基团，如苯基，那么该链将含有至少5个碳原子骨架与芳香族基团连接。含有该骨架的碳原子链可以用饱和或不饱和脂肪族或芳香族官能团进行各种取代。
术语“酸”或“胺”是传统定义的化学官能度。例如一种酸官能团可以是一种羧酸或磷或硫衍生的酸官能团如磷酸盐，亚磷酸盐或焦磷酸盐或硫酸盐，亚硫酸盐，硫代硫酸盐，或者相似构成的以磷或硫为基础的酸。胺必须有足够的碱性，从而具有一个可离子化的氢或能形成季盐，这种盐具有一个电解常数，能使其形成所需的水合物复合物。
如本发明疫苗组合物中所用的和相对于本发明脂质体组合物中所用的水量，术语“固体”是指形成脂质体的物质和酸或胺组份，水合剂，3 D-MPL，明矾以及所包裹的选择的抗原物质。
对本发明目的来说，水合剂是指具有至少两个可离子化基团的化合物，优选具有相反电荷，其中之一能够形成容易离解的离子盐，该盐能够与脂质体形成物质中酸或胺的离子官能度络合。该水合剂本身不能形成自己的脂质体。这类试剂也应当是生理上可接受的，即，在本发明使用它情况下把它给宿主施用后不应当对宿主有任何不适当或有害的生理作用。
优选的水合剂是具有一个可离子化ω取代基例如羧酸盐，氨基和胍基官能团的α-氨基酸和由下式I所表示的那些化合物或其可药用盐X-(CH2)n-YI其中X是H2N-C(NH)-NH-，H2N-，ZO3S-，Z2O3P-，或ZO2C-，其中Z是H或无机或有机阳离子；Y是-CH(NH2)-CO2H，-NH2，-NH-C(NH)-NH2-COOH，CH(NH2)SO3Z或ZH(NH2)PO3Z2，其中Z如上所定义；和n是1-10的整数。其中烷基链长是可变的N，N′-二烷基取代的精氨酸化合物和类似化合物也包括在优选化合物之列。
更优选的水合剂是ω-取代的α-氨基酸，如精氨酸，其N-酰基衍生物，高精氨酸，γ-氨基丁酸，天冬酰胺，赖氨酸，鸟氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或用下式表示的一种化合物H2NC(NH)-NH-(CH2)n-CH(NH2)COOH IIH2N-(CH2)n-CH(NH2)COOH IIIH2N-(CH2)n-NH2IVH2NC(NH)-NH-(CH2)n-NH-CH(NH)-NH2VHOOC-(CH2)n-CH(NH2)COOH VIHOOC-(CH2)n-COOH VIIHO3S-(CH2)n-CH(NH2)COOH VIIIH2O3S-(CH2)n-CH(NH2)COOHIXHO3S-(CH2)n-CH(NH2)SO3H XH2O3S-(CH2)n-CH(NH2)PO3H2XI其中n是2-4。
最优选的化合物是精氨酸，高精氨酸，γ-氨基丁酸，赖氨酸，鸟氨酸，谷氨酸或天冬氨酸。本发明的水合剂可以单独使用或以混合物形式使用。使用这些水合物质的混合物并没什么限制。
本发明的水合剂在许多化学生产厂家的目录中可以找到，可以是由这些厂家生产定制或可用本领域公知方法制得。用水解蛋白和分离各个氨基酸或由细菌来源中可获得精氨酸，高精氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸以及其它天然存在的氨基酸。
用Eisele，K.等Justusliebigs.Ann.Chem.，P.2033(1975)的方法能制得式II化合物。有关这些化合物的几个典型例子的其它信息可通过其各自的化学文摘号获得，文摘号如下非精氨酸，CAS #14191-90-3；精氨酸，CAS #74-79-3；和高精氨酸，CAS #151-86-5。对式III的典型例子，可参见2，4-二氨酸丁酸(butonicacid)CAS #305-62-4而对赖氨酸参见CAS #56-87-1。制备式IV典型化合物方法可由《化学文摘》如下获得乙二胺，CAS #305-62-4；丙二胺-54618-94-9；和1，4-二氨基丁烷，CAS #52165-57-8。具体参见Johnson，T.B.，J.Am.Chem.Soc.，381854(1916)。
式VI的化合物中，谷氨酸是本领域中公知的并可由许多商业渠道获得。在现有文献中包括了怎样制备其它典型化合物的描述，如2-氨基己二酸-CAS #62787-49-9和2-氨基庚二酸-CAS #32224-51-0。谷氨酸，式VII的化合物，其中n是2，在本领域中是公知的，并能用Maryel和Tuley，Org.Syn，569(1925)的方法制得。按照现有技术中下列CAS号作参考己二酸，CAS #123-04-9和庚二酸，CAS #111-16-0能够制得该组中的其它典型化合物。高磺基丙氨酸在现有技术文献参照CAS #56892-03-6中是已知的。在现有文献中参考文献CAS #23405-34-2描述了化合物3-磺基缬氨酸。
水合剂的混合物，形成脂质体的物质以及个别量的水形成一种类凝胶团。在这种凝胶形式中，水合剂和酸或胺与所有形成脂质体的物质一起排列成一种“水合物复合物”，这是一种高度有序的液体晶体。水合物复合物是指在脂质体形成物质中的酸或胺和水合剂之间所形成的复合物。本文中的复合是指形成了可离解的离子盐，其中一种官能度与该脂质体形成物质的离子官能度相关而其它官能度具有亲水特性，使所得到的复合物具有水溶性。当该水合物复合物的液晶结构随pH和水合剂的量改变时，该液晶结构仍然保持。NMR光谱证实这种晶体结构是以交替方式堆积在一起的多层脂质双层和亲水层组成。31P-NMR光谱有一个各向异性峰，表明了多层状双层的存在。
尽管这些脂质体的主要组份是类脂类，磷脂类，其它脂肪酸，但也可以加入各种其它组份以改良该脂质体的渗透性。例如，可以加入非离子脂类组份如多氧醇(polyaxy alcohol)化合物，聚甘油化合物或多羟基化合物的酯，聚氧醇亚油酸化(polyoxyalcolinolated)醇，多羟基化合物的酯和合成脂类脂(lipolipids)，如脑苷脂类。其它物质，如长链醇和二醇，甾醇，长链胺及其季胺衍生物；聚氧乙烯化脂肪胺，长链氨基醇的酯及其盐和季铵衍生物；脂肪醇的磷酸酯，多肽和蛋白质。脂质体组合物能够由各种脂质，脂肪酸，烷基胺等中一种以上组份和水合剂制成。
如果所包裹的疫苗组合物中加入的脂质组份本身或者抗原物质和任何其它物质具有上述特性，则该脂质组合物就不需要包括脂肪酸(或胺)或水合剂来形成“前脂质体凝胶”或脂质体。例如，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的混和物形成含有谷氨酸水溶液的“前脂质体凝胶”或脂质体，DPPC和油酸及肾上腺素水溶液的混和物形成“前脂质体凝胶”和脂质体。
为在疫苗组合物中使用一种佐剂物质，该脂质体制剂最好包括磷脂，油酸(或磷脂酰乙醇胺)和精氨酸或赖氨酸(或谷氨酸和/或天冬氨酸)。
水合剂与脂质体形成物质摩尔比约为1∶20，上限约为1∶0.05时将产生本发明的有益作用。对水合剂来说水合剂相对于脂质体形成物质的优选浓度范围是1∶2至1∶0.5摩尔比。
作为一种实用物质，也可以说是一种优选物质，如果脂质体是用一种长链脂肪族或芳香族酸制得的，则优选使用的水合剂含有至少一种可离子化的氮，如精氨酸，高精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸等。反之，如果用于形成脂质体的两亲性物质含有长链脂肪胺或芳香胺，优选使用象谷氨酸，天冬氨酸类的二酸；象戊酸，辛酸，己酸，癸酸等简单二酸类的任意烷基二酸；或具有两个磷酸盐或硫酸盐官能度的那些二酸；或者具有混合的-COOH/-SO3H或-COOH/-PO3H2官能团的那些二酸。
在实施本发明过程中某些脂肪族和芳香族酸和胺是优选的。这些化合物可以具有多种官能团如含有两种或更多种酸或胺基或其组合。例如，可以使用一种二酸，一种二胺或一种具有酸和氨官能团的化合物。优选的化合物是那些具有一个或两个酸或胺官能团的物质。更优选的是含有10至20个碳原子的饱和和不饱和一元脂肪酸。最优选的是含10至20个碳原子的烷基酸和链烯基酸，以油酸为最佳。
由脂质体形成物质，一种长链脂肪族或芳香族的酸或胺，一种或一种以上含相对于总固体不超过300摩尔水的水合剂，含或不含一种选择量的抗原物质组成的混合物，可形成一种凝胶，向该凝胶中加入一种水溶液可直接形成脂质体。这种凝胶可称作一种前脂质体凝胶，因为它的结构特点基本上和脂质体相同，这种凝胶用一种水溶液稀释后很容易转变为脂质体。当水溶液超过约300摩尔当量时，脂质体便开始形成。
这种凝胶的结构是一种高度有序的液晶，能形成一种光学透明溶液。液晶的X、Y和Z方向尺度随着恒定pH值的水合剂的浓度和溶液的pH值而改变。通过改变恒定pH值的水合剂的浓度或改变pH值，同时维持水合剂的百分比，随之而产生的脂质体囊的脂质双层的层状结构的大小和数量便可以得到控制。
凝胶结构本身每摩尔固体中可容纳最多达约300摩尔的水而不会破坏凝胶结构的稳定性。凝胶的结构通过质子核磁共振(NMR)光谱测定发现是由多层状的脂质双层和亲水层以交替的方式聚集在一起的。同一凝胶的31P-NMR光谱显示出各向异性的峰，进一步证实凝胶含有一个多层状双层。这种凝胶可用一种简便的灭菌法进行高压灭菌。而且，高压灭菌后的凝胶在室温条件下至少一年不变色并保持澄清。如需要且可行的话，凝胶可通过一种适当的灭菌滤器过滤而任意地进一步灭菌。将凝胶分散至一种水溶液中，就自发地有效地生成脂质体。
即使长期储存以后，对于有或没有包裹的3D-MPL和抗原物质的前脂质体凝胶来说，也可以经脱水(如冷冻干燥)，然后粉末再经水化而自动形成脂质体。这一功能使得该疫苗组合物尤其适用于在使用前需要长期储存的水敏感性抗原物质的给药。
前脂质体凝胶是按如下方法制备的。即，称作前脂质体凝胶的半固体的液状晶体凝胶是通过将以下三种基本成份结合制备的磷脂，脂肪酸和水中的一种水合剂。依据所需的脂质组合物，可以选用凝胶-液体转换温度(Tm)范围内的不同的磷脂或其混合物。脂肪酸可以根据饱和度或链长而选择，然后与磷脂混合成一种稠的糊剂。可以将胆固醇加入到脂质混合物中以控制双层的特性。(胆固醇在某些情况下可增加膜的Tm从而影响到它对捕获试剂的通透性)。
将水合剂，优选α-氨基酸，例如精氨酸，作为一种水溶液以慢速加入到脂质混合物中直到产生一种均匀的糊剂为止。一种理想的配方为卵磷脂与油酸之摩尔比为1∶1.2。以磷脂与精氨酸的摩尔比约为1比1.2的比例将精氨酸加入水中。
凝胶的水相组分中L-精氨酸的浓度控制着最终形成的稳定的脂质体颗粒的直径。此颗粒的大小依赖于给药途径和是否需要以巨噬细胞为靶细胞。例如，对于口服，脂质体颗粒的大小需要约1-约5微米。以淋巴细胞为靶细胞时，颗粒的大小应优选约200-500nm。作为储存之用时，脂质体颗粒的大小需要约5-约10微米。本技术领域熟练人员可容易地测试和选择不同大小的颗粒。
最终的前脂质体凝胶可含有最高达约65-约70％重量的水，它具有软膏的稠度，在偏振光学显微镜下观察时可见典型的液晶的外观。前脂质体凝胶可在惰性气体中储存或冷冻干燥成干燥粉末而长期保存。
本发明的疫苗组合物的形成过程中，使用上述制备脂质体制剂的相同步骤，然后加入一种免疫学上有效量的选择的抗原，如一种抗原多肽，特别是流感D蛋白和3D-MPL，还可任选加入一种或多种附加的免疫原性蛋白、肽或选择的病原体的断片，与脂质体制剂相混合。为制备这种疫苗组合物，通过将其混合使选择的抗原被包裹和嵌入在脂质体制剂中。
有两种方法可使3D-MPL和选择的抗原与脂质体组合物相结合来制备本发明的疫苗组合物。一种方法是通过使前脂质体凝胶，或水化的冻干粉末与一种抗原溶液在适当的缓冲液中发生水合作用而使抗原与脂质体结合。另一种方法是将前脂质体凝胶与抗原的冻干制剂进行物理混合。接着使这种混合物发生水合作用从而自动地形成脂质体。
所选择的方法是一种能得到最大量的抗原-脂质体结合和最少量的未结合部分的抗原损失的方法，这有赖于抗原在脂质存在下的物理-化学性质。然而一般地，这种疫苗组合物的各组分的比例为20mg抗原蛋白2mg 3D-MPL300mg脂质体凝胶。例如，当抗原为流感D时，可采用第二种方法，因为抗原具有显著的疏水性和弱水溶性，如下所述，为制备本发明的流感-D组合物，需将300mg前脂质体凝胶与20-30mg流感-D蛋白和0.5-2mg 3D-MPL相混合。
一般认为从本发明中得到教导的本领域的熟练人员可容易地决定实施本发明所用的抗原物质的选择量。
可以任意选择加入与选择的抗原共同包裹的其他试剂，如流感D蛋白和脂质体组合物中的3D-MPL。其他合适的试剂上文已述。
一旦在有3D-MPL、选择的抗原和任意附加的组分存在时生成脂质体，可通过不同的方式去除任何未结合的抗原。有代表性的，脂质体以近100,000×g的条件连续离心，再去掉上清液。将最终的脂质体颗粒再在可接受的液体中，如5％右旋糖、生理盐水或缓冲溶液中以所需的脂质或抗原浓度制成注射液。另一种本技术领域熟练人员都熟知的方法，如凝胶过滤或透析，可以用来去除未结合的抗原。
以上所述的选择的抗原、3D-MPL和脂质体制剂也包括这里所述的分离病毒的使用，以它代替或加入流感D。
本发明还提供了一种可增强人体或其他哺乳动物对疫苗组合物中的选择抗原的免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的方法。这种方法是给人体或其他哺乳动物施用本发明中含3D-MPL和选择的抗原的疫苗组合物。任选一种脂质体制剂也可以是上述组合物的一部分。本方法并不局限于任何此处举例说明的特殊抗原。在一个优选的实施方案中，本方法对于激发抵抗流感感染有效的加强保护作用是很有用的。在这种实施方案中，疫苗组合物包括如上所述的有效量的流感D和3D-MPL。在另一实施方案中，疫苗组合物包括上述的有效量的一种或多种分离的流感病毒和3D-MPL。其他的疫苗可以用同样的方式制备并按有效量施用。
正如实施例，特别是实施例25至30所指出的，包含3D-MPL佐剂的分离病毒的疫苗组合物可导致特别是肺内的多数病毒被清除，较高的中和抗体效价的产生，缺少中和活性时异体亚型(H1N1)交叉反应性的出现；以及从上到下整个呼吸道(气管)疾病的不断改善。
可根据标准的疫苗接种实践对这些疫苗组合物的剂量和给药方案尽可能的最佳化。典型地，疫苗可肌内给药，尽管其他的给药途径也可使用，如皮下的、结肠的、口服的、肺的、真皮内的、腹膜内的或静脉内的给药途径。所选用的途径可依所需的免疫应答类型而定。例如，皮下途径具有传统的“储存效果”或较之其他途径更能延长刺激作用。也有可能所给出的用药途径会产生比细胞应答更强的抗体反应，反过来亦如此。例如，口服的给药途径可以产生一种可用于局部免疫的增强的IgA应答。
根据所知的其他多肽疫苗的情况，可以预期用于一般成年人的一种流感抗原多肽疫苗，例如包含本发明疫苗的流感D蛋白的有效的单一剂量，其D蛋白约在1至1000μg范围内，优选约为50至约500μg蛋白，最优选约为100μg，与适当数量的3D-MPL佐剂相混合。当使用这些剂量的流感D蛋白时，疫苗组合物中3D-MPL的用量约为1-500μg 3D-MPL/μg病毒蛋白，更优选约为10-50μg3D-MPL/μg病毒蛋白，最优选约为50μg 3D-MPL。
如本文所述通过脂质体载体施用流感D和3D-MPL时，疫苗组合物中的D蛋白优选量约为50-500μg，3D-MPL的量约为10-50μg。这种以3D-MPL辅佐的流感D疫苗组合物大约每0.2mg抗原蛋白含有约1-10mg，优选约3mg的脂质体物质。
当流感D和3D-MPL疫苗的制剂任意地包含另一种佐剂，如铝或氢氧化铝时，D蛋白的优选剂量约为10-500μg蛋白；铝或氢氧化铝的优选剂量约为10-500μg。
同样地，根据所知的其他的分离病毒疫苗，可以预计到一种用于一般成年人的流感单价或多价分离病毒疫苗(如本文所述的那些)的有效的单一剂量是每个菌株约15μg血凝素(HA)，总蛋白约为80-300μg/ml，并与适当数量的3D-MPL佐剂相混合。当使用这些剂量的分离病毒时，疫苗组合物的3D-MPL量优选每次剂量约为50μg 3D-MPL。当然，本领域熟练人员可以改变病毒蛋白和3D-MPL的所述用量。
当通过一种如本文所述的脂质体载体而给药一种或多种分离病毒和3D-MPL时，疫苗组合物中每种分离病毒的优选用量可能少于每个菌株约15μg血凝素，3D-MPL的用量约为10-50μg。这种3D-MPL辅佐流感分离病毒疫苗组合物大约每0.2mg病毒蛋白含有约1-约10mg，优选约为3mg的脂质体物质。
分离病毒和3D-MPL疫苗制剂可任意包含另一种佐剂，如铝或氢氧化铝时，疫苗组合物中每一分离病毒的优选剂量可以向下调整。铝或氢氧化铝的优选剂量与上述的抗原多肽中的相似。
本发明所述的任何疫苗最初可在夏末秋初使用(优选0.5mls剂量单位)，2至6周后可再次给药，如需要，或当周期性的免疫衰退时，例如每2至5年再使用。
下面的实施例是举例说明制备本发明疫苗组合物的优选方法。这些实施例仅仅是举例说明而并不限定本发明的范围。实施例1-凝胶制备称取3克二棕榈酰磷脂酰胆碱放入一个50ml的烧杯中。加入1.2克油酸共同混合形成一均匀糊剂。
将30ml去离子蒸馏水中的0.72g精氨酸一同加入二棕榈酰磷脂酰胆碱油酸糊剂中，并加热至45℃。不断用手混合，混合物便形成一透明稳定的凝胶。储存凝胶，通过用磷酸盐缓冲盐水稀释凝胶而后便形成脂质体。实施例2-脂质体的制备将120mg二棕榈酰磷脂酰胆碱和24mg油酸加在一起，彻底混合直至看到白色均匀的糊剂。
然后将20mg精氨酸溶解在60ml的磷酸盐缓冲盐水中(离子强度＝0.15，pH＝7.4)。再将精氨酸-盐水溶液加入糊剂中，并加热至40℃半小时，或直到看见轻微混浊的溶液。实施例3-大量凝胶和脂质体的制备i)凝胶制备将20g油酸N.F.加入到50g 20型卵磷脂粉末(Asahi Chemicals)中。混合物成一白色糊剂，将它冷却至4℃并研磨成很细的粉末。把此粉末加入到一种含20g精氨酸和500g去离子蒸馏水的水溶液中。当溶液加热至35℃左右时，用药刀搅和混合物以帮助水化磷脂。形成一种均匀微黄的凝胶。这种凝胶可用高压灭菌并于4℃储存，也可冷冻，以后再恢复。ii)脂质体的制备从冷藏中取出前面所制备好的凝胶重新置室温中。然后用2升的pH7.4的磷酸盐缓冲盐水混合。形成一种白色的不透明脂质体溶液。实施例4-从凝胶形成脂质体由1.0g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和400mg油酸生成一种均匀糊剂。然后将300mg精氨酸混合于10ml磷酸盐缓冲盐水中，加热至45℃，再加入到BPPC/油酸糊剂中，从而生成脂质体。实施例5-前脂质体凝胶将1g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPL)与400mg油酸混合形成均匀糊剂。于45℃时将300mg精氨酸与2ml水混合直至溶解。精氨酸溶液与DPPC/油酸糊剂在大约45℃混合，得到稠的凝胶。当用磷酸盐缓冲盐水稀释此凝胶则可形成脂质体。实施例6-不同脂质体的制剂A.含胆固醇的脂质体将15mg胆固醇与100mg二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)混合形成均匀粉剂。然后将23mg油酸加入粉剂中，彻底混合从而形成均匀糊剂。为了制备脂质体，将30mg精氨酸加入到10ml磷酸盐缓冲盐水中，加热至40℃，再加入至DPPC/胆固醇/油酸糊剂中。混合此组合物40℃时可得到脂质体。B.含棕榈酸的脂质体将二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)250mg与25mg棕榈酸混合生成均匀的粉剂。然后将80mg油酸与此粉剂相混合并加热至45℃，不断搅拌直至生成均匀的糊剂。将100mg精氨酸溶解于25ml去离子蒸馏水中并加热至45C。45℃时将精氨酸溶液加入糊剂中混合直至均匀的凝胶生成。用磷酸盐缓冲盐水将此凝胶稀释十倍便形成脂质体。C.含异硬脂酸的脂质体将100mg二棕榈酰磷酯酰胆碱与50mg异硬脂酸混合形成均匀的糊剂。制备一种2.0ml去离子蒸馏水中含50mg精氨酸的精氨酸溶液，然后加入至异硬脂酸糊剂中，并加热至45℃。混合此混合物直至形成透明凝胶。用磷酸盐缓冲盐水稀释便可形成脂质体。D.含油酰苏氨酸的脂质体将125mg二棕榈酰磷酯酰胆碱与75mg油酰苏氨酸加在一起并加热至40℃而生成糊剂。然后在40℃时再加入2ml去离子蒸馏水不断混合。形成透明的凝胶，用pH为5的磷酸盐缓冲盐水稀释该凝胶便得到脂质体。E.含肉豆蔻胺的脂质体将192mg二棕榈酰磷酯酰胆碱加入到72mg肉豆蔻胺中并加热不断混合直到形成均匀的糊剂。将溶于5ml去离子蒸馏水中的谷氨酸65mg加入糊剂中，加热直至凝胶生成。将磷酸盐缓冲盐水加至此凝胶中生成脂质体。F.含DLPC的脂质体将50mg二月桂基磷脂酰胆碱(DLPC)与20mg油酸混合生成均匀的糊剂。将20mg精氨酸加入10ml磷酸盐缓冲盐水中，再加入至糊剂中，并用手混合直到形成混浊的脂质体溶液。G.磷脂酰乙醇胺-谷氨酸脂质体将32mg L-谷氨酸溶解在2.0ml去离子蒸馏水中，并用1.0N氢氧化钠将pH调至5.2。将此溶液加热至60℃，并加入100mg磷脂酰乙醇胺。此溶液保持60℃并不断混合直至可见到均匀的粘性凝胶。
将磷脂酰乙醇胺-谷氨酸凝胶用磷酸盐缓冲盐水稀释1/10。在位相光显微术下可观测到多孔结构。实施例7-精氨酸浓度对脂质体粒度的影响在502mg二棕榈酰磷酯酰胆碱(DPPC)中加入10微升(2-棕榈酰-1-C14)(0.1mCi/ml)二棕榈酰磷酯酰胆碱。加入氯仿以达到放射性物质的完全混合，然后蒸去氯仿。195mg油酸(OA)与脂质混合形成一种糊剂。在45℃下加入5ml含有119mg精氨酸的蒸馏水溶液并混合而形成一透明凝胶。
称重1g凝胶分入不同的四个管形瓶，加入的精氨酸如以下表1所示。
表1样品组分样品IDDPPC∶OA∶Arg管1＋1ml 水(1∶1∶1)管2＋1ml50mg/ml精氨酸水溶液 (1∶1∶3)管3＋1ml84mg/ml精氨酸水溶液 (1∶1∶5)管4＋1ml192mg/ml精氨酸水溶液(1∶1∶10)0.5(one-half)g的每份溶液用50ml pH7.8的磷酸盐缓冲盐水稀释。
通过Sephracyl S-1000柱层析分析获得所估计的平均直径，该柱层析分析使用14C同位素标记的DPPC(即，根据使用光子关联能谱法(PCS)获得的散射密度而测定直径)。结果见以下的表2。
表2精氨酸浓度对孔径大小的影响体系 比率 pH估计的直径(nm)DPPC∶OA∶Arg1∶1∶17.8 ～220DPPC∶OA∶Arg1∶1∶37.8 ～140DPPC∶OA∶Arg1∶1∶57.8 ～90DPPC∶OA∶Arg1∶1∶10 7.8 ～20实施例8-pH值对孔径大小(vesicle size)的作用另外，孔径大小随缓冲水溶液的pH值的改变而改变。
在100mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中加入25微升(2-棕榈酰-1-C14)(0.1mCi/ml)二棕榈酰磷脂酰胆碱。加入氯仿使放射性物质完全混合，然后蒸去氯仿。将40.1mg油酸(OA)与脂质混合形成一糊剂。在45℃下向脂质混合物中加入1ml含24mg/ml精氨酸的水溶液并混合而形成一透明凝胶。
两份100mg等份的这种凝胶分别用10ml pH值为9.0和7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释。
再有，使用14C-同位素标记的二棕榈酰磷脂酰胆碱通过Sephracyl S-1000柱层析分析法获得所估计的平均直径。结果如以下的表3。
表3pH值对孔径大小的影响体系 比率 pH 估计的直径(nm)DPPC∶OA∶Arg1∶1∶17.4 ～＜300DPPC∶OA∶Arg1∶1∶17.8 ～220DPPC∶OA∶Arg1∶1∶19.0 ～25.4因此，通过改变精氨酸浓度或缓冲水溶液的pH值可获得理想大小的脂质体囊泡。实施例9-脂质体的稳定性可由加热灭菌的前脂质体凝胶制备无菌脂质体。或者，可以通过一适当的消毒滤器对脂质体凝胶或脂质体进行灭菌过滤。
从DPPC∶OA∶Arg(1∶1∶2)和pH值为8.0条件下制备的脂质体通过加热灭菌，并可在室温下无需加抗菌剂和抗氧化剂而保藏近一年。没有观察到细菌生长、脱色以及沉淀现象出现。使用阴离子染色剂进行一年的电子显微检测，旧的脂质体显示出脂质体多孔结构是稳定的。实施例10-蔗糖的潜伏性(Latency)使用DPPC∶0A∶Arg(1∶1∶1)脂质体体系包裹的C14蔗糖在pH值为7.8的磷酸盐缓冲水溶液中来测定包裹的蔗糖的潜伏性。结果如以下的表4。
表4天数 ％蔗糖的潜伏性0 1001 97.43 93.47 91.4因此，目前的脂质体体系在药物的转运方面有极好的潜伏性。实施例11-冷冻干燥的脂质体30.0gm由酸与7.5gm胆甾醇U.S.P.混合。然后将75.0gm磷脂的20号粉(Asahi Chemical Co.)与油酸/胆甾醇混合物混合，直到形成一均匀的糊剂。
而后将15.0gm精氨酸(自由碱基)溶于183gm蒸馏过的去离子水中。这一精氨酸溶液缓慢地与脂质糊剂混合而形成一均匀的凝胶。该凝胶的pH值用5.0N HCl调整至7.4。
将每份10.0gm等分的这种前脂质体凝胶转移至10ml管形瓶中并冷冻干燥。所得粉末用5ml磷酸盐缓冲盐水稀释时形成脂质体。实施例12-流感D表达质粒的构建质粒pAPR701是一种来源于pBR322的克隆载体，它带有M1和M2流感病毒蛋白质(A/PR8/34)的编码区。记载此质粒的文献是Young等人的The Origin of Pandemic Influenza Viruses，1983，由W.G.Laver，Elsevier Science Publishing Co.编辑出版。
质粒pAPRS01是一种来源于pBR322的携带有NS1编码区(A/PR/8/34)的克隆载体。以上援引Young等人的上述文献对此有描述。
质粒pAS1是一种来源于pBR322的表达载体，它包含PL启动子，一个N利用位点(在N蛋白质存在下缓解转录极性效应)和cII核糖体结合点，该结合点又包括后面紧连着BamHI位点的cII翻译起始密码子。Rosenberg等人的Methods Enzymol.，101123-138(1983)对此有所描述。
质粒pASldeltaEH是通过从pAS1中缺失非必需的pBR322来源的EcoRI-HindIII区而制得。将一个在病毒来源的861碱基对和pBR322来源的375碱基对中含有NS1编码区的pAPR801的1236碱基对BamHI片段插入到pASldeltaEH的BamHI位点。所得质粒pASldeltaEH/801表达真正的NS1(230个氨基酸)。该质粒在对应于第81位和第82位氨基酸的密码子之间带有NcoI位点，并在NS序列的3’方向具有NruI位点。在氨基酸1和2之间保留了BamHI位点。
用BglII切割质粒pAS1ΔEH/801，用DNA聚合酶I(DNApolI；Klenow)填充末端并且紧密连结，因而除去了BglII位点。用NcoI消化所得质粒pBgl-，用DNApolI(Klenow)填充末端，并且与BglII人工接头连结。所得质粒pB4在NS1编码区内含有BglII位点。用BglII消化质粒pB4，并且与EP 0366238的实施例4中所述的合成DNA人工接头连结。
所得到的质粒，pB4+，允许在人工接头内插入DNA片段，它紧跟NS1的第一个81氨基酸的编码区，并后续连接所有三个阅读框架的终止密码子。用XmaI消化质粒pB4+(在接头内切割)，填充末端(Klenow)，并连接到来源于HA2编码区的520碱基对PvuII/HindIII，已填充末端的片段上。所得到的质粒，pD，编码一种蛋白质，它含有NS1的第一个81氨基酸，来源于人工DNA接头的三个氨基酸(Gln-Ile-Pro)，后面接HA2的氨基酸65-222，如欧洲专利申请No.366,238所公开的图2所示。
为促进在生产发酵中的质粒选择，将一个来源于编码重组流感D蛋白质的pD表达质粒的BamHI片段连接到含有来源于Tn903的卡那霉素抗性基因的pAS1质粒衍生物的BamHI位点，以便进行选择[Berg等人，Microbiology ed，D.Schlessinger，PP.13-15，AmericanSociety for Microbiology(Washington，DC 1978)；Nomura等人，The Single-Stranded DNA Phages，ed，D.Denhardt等人，PP.467-472，Cold Spring Harbor Laboratory(New York 1978)；Castellazzi等人，Molecul.Gen.Genet.，117211-218(1982)]。结果形成载体pC13(H65-222)Kn。
如上Shatzman和Rosenberg，Meth.Enzymol.，152661-673(1987)所述，pOTS207是一种来源于克隆载体的pAS，这种载体可携带来自Tn903的卡那霉素抗性基因[Berg，引用文献同上；Nomura，引用文献同上；Castel lazzi，引用文献同上]。它是通过用BamHI消化质粒pUC8[Yanisch-Perron等人，Gene，33103-119(1985)]和与含有来源于Tn903的卡那霉素基因的-BclI片段连结而构建的。用EcoRI和PstI消化所得质粒pUC8-Kan，且将含有卡那霉素基因的片段插入pOTSV的EcoRI和PstI位点之间[Shatzman和Rosenberg引用文献同上]。所得质粒为pOTS207。
从pJZ102[一种pBR322来源的克隆载体，它携带有完整HA蛋白的编码区(A/PR/8/34)，(由Young等人描述，The Origin ofPandemic Influenza Virusas，ed.W.G.Laver，Elsevier SciencePublishing Co.(1983)]分离一种编码HA2编码序列的520bp片段，并将其插入到用XmaI切割并填充末端的pB4+中。用BamH1消化所得到的质粒pC13H65-222，并将从此片段分离的编码流感D蛋白的片段连接到pOTS207的BamH1位点以产生质粒pC13(H65-222)Kn[SmithKline Beecham]。
卡那霉素抗性C13(H65-222)Kn质粒的序列来源如下1-31，3136-3964，4021-4343，4533-7166位的核苷酸来源于pBR322[Young等人上文]；32-1879，4344-4532位置的核苷酸来源于入噬菌体，1880-2122，2682-3135位的核苷酸来源于NS1基因，2123-2132，2660-2681位的核苷酸来源于合成人工接头，2133-2659位的核苷酸来源于HA2基因，3965-4020位的核苷酸来源于pCV1人工多聚接头，7167-8601位的核苷酸来源于pUCKan12(Tn903Knr)。通过双脱氧链终止法测定DNA序列来确定流感D蛋白质衍生物编码区的DNA序列[Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(1977)]。
这种C13(H65-222)Kn质粒与在未决美国专利申请序列号No.07/387,200，及其相应的公开的欧洲专利申请No.366,238和未决美国专利申请序列号No.07/387,558，及其相应的公开的欧洲专利申请号No.366,239中所述的质粒基本相同，其不同之外是去除了β-内酰胺标记并以卡那霉素标记替代。对描述其他合适载体的上述申请进行了引用作为参考。
将pC13(H65-222)Kn质粒转化到大肠杆菌表达菌株AR58[SmithKline Beecham]中；由免疫印迹分析确定流感D蛋白质的产生[Towbin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，764350(1979)]，这种免疫印迹分析揭示出一种在所预测的27.7KD分子量位置的主要免疫活性品种。实施例13-D蛋白质的纯化按照欧洲专利申请公开说明书No.366,239及其相应的美国专利申请序列号No.07/387,558中所详细描述的纯化NS11-81-HA265-222或D蛋白(MW27.7KD)。
使用实施例12所述的pCl3(H65-222)Kn体系由任何大肠杆菌宿主菌株AR58[SmithKline Beecham]诱导合成D蛋白质后，用离心法收集细菌细胞并在-70℃下冷冻直到使用。将这种沉淀物解冻后在50mM Tris，2mM EDTA，0.1mM二硫苏糖醇(DTT)，5％甘油中、pH值为8时重新悬浮。所得悬浮液在环境条件下用溶菌酶(终浓度至少约为0.2mg/m1)处理大约一小时。
然后这种悬浮液在Manton Gaulin匀浆器[APV Gaulin，Inc.，Everett Massachusetts]上以8000psi在两个通道内进行溶解。所得悬浮液用Triton X-100(1％终浓度)和脱氧胆酸盐(DOC，0.1％终浓度)处理。将含有D蛋白质的沉淀物在含2mM EDTA和5％甘油的50mM Gly-NaOH缓冲液中悬浮，此时pH值为10.5，使用仪器是Turrax匀浆器。所得悬浮液在加入Triton X-100(1％终浓度)后置于4℃的冷室内搅拌大约1小时，而后离心。将含D蛋白质的沉淀物在pH值为8.0下溶解在8M脲，50mM Tris中，并在4℃下放置过夜。上清液含有D蛋白质。
这一上清液在加入DTT(至50mM的终浓度)后，在环境条件下搅拌大约1小时，然后上DEAE Fast Flow Sepharose[Pharmacia]柱，该柱已用pH值为8的8M脲和50mM Tris缓冲液平衡。D蛋白质在平衡缓冲液中以0至0.3M NaCl的梯度(超过5个柱体积或更大)进行洗脱。
含D蛋白质的馏分在Minisette切向流动仪[Pharmacia]上浓缩，用每mg蛋白质10mg的SDS和DTT[Sigma](至终浓度50mM)进行处理，而后在环境温度下搅拌约1.5小时。
所得溶液上Superose-12柱[Pharmacia]，该柱用含1％SDS、pH值为8.6的25mM三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液平衡。在平衡缓冲液中以同溶剂(isocratic)梯度在其预测的单体M处洗脱D蛋白质。收集含适当纯度的D蛋白质的部分，将其浓缩，并且用每mg蛋白质10mg的SDS与DTT(至50mM的终浓度)进行处理，然后在前面刚提到的同样条件下使用Superose-12柱进行层析分析。
收集含最高纯度D蛋白质的部分，将其浓缩，并上G25Sephadex凝胶细柱[Pharmacia]，该柱用含8M脲的pH值为8.0的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行平衡。 D蛋白质以同溶剂(isocratically)的平衡缓冲液洗脱，收集合有无SDS的D蛋白质部分，并将其浓缩。这种高纯度的D蛋白质样品继续浓缩，并以20mM Tris，1mM EDTA在pH8.0下透析，进行无菌过滤。实施例14-流感D疫苗组合物的评价在文献S.B.Dillon等人，Vaccine，10309(1992)中，介绍了有关D蛋白质的具体内容，用于体外T细胞检验的方法和预防性研究，本文引用作为参考。
如前述的方法进行CTL和增殖试验[S.B.Dillon等人，引用文献同上文]。在IL-2依赖的CTL系(CTLL)上测定IL-2，而IFNγ由市售的ELISA药盒测定。
根据本发明的疫苗组合物，它含有在氢氧化铝佐剂中的superose纯化D蛋白，含有或不含有3D-MPL，它可由下述方法制备将3D-MPL(RIBI Immunochemical，Hamilton，MT)在无菌水中再配制成注射剂直到工作浓度为1mg/ml。用声波处理这一原液30分钟，将这种在5％葡萄糖中制备的稀释液再用声波处理10分钟，然后加入D蛋白质与氢氧化铝的混合物中，该混合物是按照前述的方法制备的[Dillon等人，Vaccine，10(5)309-318(1992)]。
抗原剂量由0.01，0.1，1.0，10，20，至100μg/注射剂量进行滴定；并且3D-MPL剂量由0.025，0.25，2.5，25，至50μg/注射剂量进行滴定。除去100μg剂量外，3D-MPL与抗原之比对于所有抗原剂量来说均可保持在2.5∶1(W/W)，见下面的表5。在所有例子中氢氧化铝均为每个剂量含100μg。对照组疫苗组合物中含20μg抗原，并与CFA混合，如Dillon等人，Vaccine，10(5)309-318(1992)所述。最后的注射体积为每只小鼠0.2ml。
为进行这些保护性研究，在0周和3周时给小鼠(CB6F1；H-2d×b)皮下注射所选择的疫苗剂量，在7周时使用2至5倍LD50剂量的A/Puerto Rico/8/34[A/PR/8/34(流感A型病毒，H1N1)]病毒对小鼠进行鼻内激发(在甲氧氟烷麻醉下)。
对用于保护性研究的方法的具体论述见S.Dillon等人，Vaccine，10(5)309-313(1992)，本文引用作为参考。对激发后21天的存活百分数用Fischers精确概率检验进行组间比较。
表5抗原剂量(μg)3D-MPL剂量(μg)％存活(21天)10050 27100 0 53+20 50 86+，++20 0 40**10 25 67+10 0 40**1.0 2.5 80+，++1.0 0 70.1 0.25 200.1 0 200.010.025 200.010 130.050 130.0 0 0+相对于佐剂对照组P≤0.003**相对于佐剂对照组P≤0.01++相对于同等抗原剂量下的铝制剂P≤0.01表5结果显示当疫苗组合物中含有3D-MPL时，达到对致死性激发具有显著保护作用所需的流感D抗原的最小剂量将从10μg(仅用铝)减至1μg。再有，当20μg(P≤0.01)，10μg(P≥0.05；NS)和1μg(P≤0.01)抗原剂量与3D-MPL和铝制剂一起给药时，受激发小鼠的成活百分率比在疫苗组合物中仅有铝佐剂的成活百分率有所增加。在本实验中，CFA对照组在20μg抗原时的存活率为73％。实施例15-流感D疫苗组合物的评价本实验基本上以上述实施例14所述的方式进行，不同的是滴定3D-MPL剂量并分别单独给药，与最小有效剂量的流感D抗原(1μg)和铝佐剂(100μg)一起给药，或与流感D抗原(10μg)以及铝佐剂(100μg)一起给药。表6中报告的结果证明2μg 3D-MPL为最小有效剂量。
表6抗原剂量(μg)3D-MPL剂量(μg) ％存活(21天)10 10 80+10 2.0 73+10 0.4 53+10 0.0 53*110 80+，++12.0 87+，++10.4 33*10.0 33010 002.0 000.4 000.0 7+相对于佐剂对照组P≤0.001。*相对于佐剂对照组P≤0.02。++相对于同等抗原剂量下的铝制剂P≤0.01。实施例16-流感D疫苗组合物的评价在本实验中，通过测定在分别使用2，10或50倍LD50剂量病毒激发后所观察的保护水平，来将脂质体加3D-MPL的效能分别与不加3D-MPL[Ribi Immunochem]的脂质体(Lipo)和Al(OH)3或CFA进行比较。所使用的疫苗与下面表9中的相同。
在0周和3周时给小鼠注射并在7周时用APR/8/34激发。到第21天的存活率见下面的表7。
表7％ 存活剂量激发剂量 (LD50)抗原(μg) 佐剂 2 1050D蛋白质 50 Lipo 5353b70Lipo 270 0D蛋白质 50 Lipo/3D-MPL2100b73b，c47b，c0Lipo/3D-MPL130 0D蛋白质 50 Al3+86b20130Al3+7 130D蛋白质 50 CFA86b80b，c130CFA330 0a.每份脂质体含3D-MPL的量没有确定。b.相对于佐剂对照组P≤0.003。c.相对于同等抗原剂量下的氢氧化铝制剂P≤0.003。
结果显示使用脂质体/3D-MPL制剂可获得抗50倍LD50激发的显著保护作用，而用任何其它所测试的佐剂制剂不能获得保护(表7)。用所有制剂拮抗2倍LD50的激发，有效保护是成功的。除铝制剂外所有制剂均可保护性地拮抗10倍LD50的激发剂量。因此，3D-MPL/脂质体制剂中的D蛋白质能构成一种甚至比在CFA中的D蛋白质具有更大效能的疫苗，CFA是一种典型的支持T细胞反应的佐剂，但它不适合人类使用。实施例17-流感D疫苗组合物的评价在本实验中，本发明的一种疫苗组合物，它含有流感D蛋白质、3D-RPL和脂质体，通过与另一种含有流感D、3D-MPL和铝佐剂的疫苗组合物比较而对本发明疫苗组合物进行评价。测定加入到脂质体中的3D-MPL的实际量。
以20mM pH值为8的碳酸氢铵透析pH值为8的25mM Tris/1mM EDTA中总蛋白浓度为2.49mg/ml的流感D蛋白质(superose纯化的)，并冷冻干燥成20mg等份的粉末。
卵磷脂(Asahi Type 5)与油酸(Sigma)按大约1∶1.2的摩尔比进行混合。0.38M左旋精氨酸水溶液(自由碱基)加入(磷脂∶精氨酸的摩尔比为1∶1)到磷脂/脂肪酸混合物中，并混合至一种光滑而均质的凝胶形成。这种凝胶即为前脂质体凝胶。
使冷冻干燥的蛋白质与前脂质体凝胶(0.06-0.08蛋白质/凝胶(W/W)比值)结合，并在室温下混合至形成一种均匀的糊剂。以1μmole脂质A比66μmole磷脂的比率加入单磷酰脂质A(Ribi/Immunochem)。这是一种无色透明的体系，它由毫微粒子(亚微粒直径)结构的聚合3D-MPL单体组成。所得脂质体悬浮液进一步用25mM Tris/1mM EDTA、pH值为8.0的缓冲液稀释，并使其分布均匀。该脂质体制剂连续进行离心(3×)以去除非结合的蛋白质和3D-MPL。每次的沉淀小丸用Tris/EDTA缓冲液再悬浮。对最终的脂质体悬浮液进行分析，并且在不使用时在5℃ N2下保存。
用修改的Lowery比色法进一步检测脂质体以测定蛋白质的含量，用Barlett法[Bartlett，G.R.，J.Biol.Chem.，234466-468(1959)]测定磷脂浓度，并用光子相关色谱法[Malvern Model4700]测定脂质体的粒度。所有检测都用标准操作法进行操作完成。没有分析脂质体中脂质A成分的含量，然而，极有可能的是所有脂质A都留在最终的脂质体部分中。
在下面的表8中，将固体脂质A与脂质相结合而制备D蛋白质LA和对照组的LA-I。通过用一种需结合的脂质A溶液水合而制备对照组的LA-II。
表8脂质体样品 磷脂 蛋白质 3D-MPL 直径z-(μmole/mL)(mg/mL)(μg/mL)平均值(nm)对照组 4.37未检测 未测定 200.8对照组+3D-MPL 7.87 0.02 未测定 201.3流感D21.8 4.89 未检测 487.0流感D+3D-MPL 14.8 4.06 270502.4在0周和3周时给小鼠皮下免疫接种0.2ml的抗原/载体/3D-MPL制剂，并在7周时用5倍LD50的A/PR/8/34病毒进行鼻内激发。这种“载体”或者是氢氧化铝(Al)或者是脂质体(Lipo)。对存活的小鼠监测21天。这些结果在下面的表9中进行了说明。除非另有说明，p值是相对于3D-MPL对照组测定的。
表9抗原剂量载体3D-MPL剂量％存活 p值1.0μg Al -330.0841.0μg 2.5μg 800.000/0.001a0.1μg Al -330.0840.1μg 2.5μg 930.000/0.001a0μg Al 2.5μg 7-1.0μg Lipo -730.0011.0μg 0.05μg 800.0000.1μg Lipo -460.0540.1μg 0.005μg870.000/0.020a0μg Lipo0.05μg 13-a相对于不含3D-MPL的同源剂量的p值。
这一数据说明用脂质体作为载体，所需3D-MPL(0.005-0.05μg)的剂量相对于用铝制剂所需的量(约2μg)显著减少。(见上面的表6)。实施例18-疫苗组合物的评价给CB6F1小鼠(每组12R)在0周和3周时皮下注射含有存在于铝(100μg)和3D-MPL(10μg)中的100μg流感D的疫苗组合物。在7周时，用3～5倍LD50剂量的如表1所示的病毒激发小鼠。监测激发21天后的存活率。
表1的结果证明该疫苗的抗原特异性相当于以前用Al+3佐剂证明抗原特异性[S.B.Dillon等人，引用文献同上文](即对H1和H2亚型均有交叉保护作用，而对H3或B型缺乏效能)。尽管结果没有显著性差异，P＜0.09，但在用异源性H1N1病毒，A/Tai/86激发的疫苗接种组中，存活率依然较高。(见图1)。实施例19-流感D疫苗组合物的评价在0周和3周时给CB6F1小鼠皮下(SC)注射含1μg D蛋白和铝(100μg)及3D-MPL(2.5μg)的疫苗组合物或注射只含铝的疫苗组合物。在7周时对18只小鼠用5倍LD50剂量的A/PR/8/34病毒激发。处死5只激发7天后的小鼠以测定肺的效价(7天时对照组的死亡率为Al/3D-MPL组的60％，为CFA组的40％)。从每个激发前的组中取2只小鼠，并在激发后第6天从每组中取3只小鼠，分别摘除它们的脾脏，进行增生和细胞激动素的检测(见下面的表15)。表10报告了用5倍LD50激发后的存活率(n＝10/组)和肺病毒的清除率(n＝5/组)。7天时记录的肺病毒的效价列在表10的第四栏中。
表10的结果表明，尽管在这些组中存活率是相同的，但给予了5倍LD50激发的小鼠的肺病毒效价的减少在3D-MPL组比CFA组有更大的数量级(2.4log10对0.9log10)。
表10抗原(μg)佐剂 存活率 log10TCID50/肺1.0 Al/3D-MPL 86％*4.41±0.83+0 Al/3D-MPL 0％ 6.80±0.451.0 Al 33％ 6.39±0.41+0 Al 0％ 7.39±0.411.0 CFA86％**6.00±0.50++0 CFA26％ 6.90±0.72*相对于佐剂对照组P≤0.001。**相对于佐剂对照组P≤0.01。+相对于佐剂对照组P≤0.003。++相对于佐剂对照组P≤0.03。实施例20-流感D疫苗组合物的评价为了检测脾脏的T细胞增生，γIFN的产量是否与保护作用有关，对用Al和Al/3D-MPL(2.5ng 3D-PL)佐剂(来源于表10所示的研究)中的1μg D蛋白免疫的小鼠激发前和激发后脾脏中的这些反应进行检测，在第7周，在病毒激发后的6天处死两只小鼠。将脾脏与D蛋白质共同培养，并在3天时用3H-胸苷脉冲作用。8小时后收集培养上清液。
总之，对于用Al或Al/3 D-MPL制剂中的D蛋白疫苗接种的组来说其激发前和激发后的脾脏增生反应是相似的(未激发的培养物中最大的cpm是2750cpm)(图3)。增生反应的量也类似于使用最高刺激指数为3.0或更低(图2)的佐剂组。在抗原刺激的培养上清液中激发前的γ-干扰素水平仅是中等程度地(约2倍)升高，并且两个佐剂组中的激发前γ-干扰素水平相等，如表11所示。
然而，比较来说，在来源于激发后的Al/3D-MPL组的抗原激发培养物中γ-干扰素的产生增加了7倍；而在仅用Al+3(表11)接种的组中，激发后的γ-干扰素水平没有升高。因此这些结果证实了γ-干扰素的产生与减少的肺效价和激发后的存活率相关，并且进一步表明T细胞增生本身并不反映两个佐剂组之间的差异。
表11ng/ml IFN-γ注射 μg/ml抗原 剂量佐剂体外 激发前激发后D1μgAl+3/3D-MPL 0 ＜0.9 ＜0.91 1.0 ＞7.010 1.8 ＞7.0-- Al+3/3D-MPL 0 ＜0.9 ＜0.91 ＜0.9 1.010 0.94＜0.9D 1μg Al0 ＜0.9 ＜0.91 1.9 1.010 1.9 1.0- -Al0 ＜0.9 1.21 ＜0.9 1.710 1.1 1.0实施例21-流感D疫苗组合物的评价为了进一步研究对CD4+细胞的作用，对接种了含有流感D和铝佐剂(Al)的疫苗组合物的小鼠和接种了含有流感D和Al/3D-MPL制剂的疫苗组合物的小鼠中的抗原特异性增生与细胞因子的产生进行比较。
在7天前给小鼠单次注射1，5或20μg含D蛋白质的Al/3D-MPL(3D-MPL与抗原比为2.5∶1W/W)或Al+佐剂(100μg)，将来源于这些小鼠的淋巴结与0-30μg/ml纯化的D蛋白质一起培养。
这些结果在图3和4中进行了说明。在接受Al/3D-MPL佐剂的组中，增生明显增加，并且在最低体内抗原剂量(1μg)时差异最大。图3中非刺激培养液内最高cpm为1368cpm。图4中非刺激培养液内最高cpm为1600cpm；并且用来源于非刺激的培养物的上清液培养的CTLL(IL-2依赖性CTL细胞系)细胞的最高cpm为195cpm。尽管在所有的培养物(图4)中IL-2活性水平一般都低，但在接种Al/3D-MPL制剂的组中IL-2活性峰值(48小时)较大。
表12提供了来自相同抗原刺激培养物的上清液中的γ-干扰素的分析结果。来自佐剂对照组培养液上清液中的干扰素水平均＜1ng/ml。用Gibco-BRL ELISA药盒测定γ-干扰素。这种细胞，因子在4天的培养液中含量最高，在Al/3D-MPL组中高出5倍。
表12μg抗原 体外抗原γ-干扰素(ng/ml)(体内)佐剂 第2天 第3天 第4天(μg/mL)1.0 Al+0 ＜1 ＜1 ＜11 ＜1 ＜1 ＜110 ＜1 ＜1 1.11.0 Al/3D-MPL0 ＜1 ＜1 ＜11 ＜1 ＜1 1.910 1.1 2.9 4.9表11和12中的结果共同证明了γ-干扰素在MPL佐剂作用机理中的作用。实施例22-流感D疫苗组合物的评价鉴于以上实施例表明3D-MPL可以增强疫苗的效力，所以进行一项研究来确定加强注射对保护是否必要。给小鼠用皮下注射50μgD接种一次，并且在7周后用2倍LD50的A/PR/8/34激发。或者，在第三周的时候给第二组加强注射一次相同抗原剂量。3D-MPL的剂量为125μg。流感D可以用氢氧化铝，铝加3D-MPL，或者CFA作佐剂。对每一个佐剂均设对照组。
下面表13(在实施例23中描述)的结果显示出将3D-MPL(125μg)加入到具有50μg抗原的疫苗制剂中，与吸收于铝上的相同剂量的疫苗蛋白相比，无论注射一次或者两次，均可以显著地延长小鼠的存活率。将Al/MPL组的存活率与CFA组观察到的存活率进行比较。实施例23-细胞毒性T淋巴细胞的测定上面引用的S.Dillon et al中详细描述了用于体外T细胞测定的方法。如前所述[参见，F.Ennis et al，Lancet，II887-891(1981)；A.Yamada et al.J.Exp.Med.，162663-674(1985)；和K.Kuwono et al，J.Exp.Med.，1691361-1371(1989)]用病毒体外第二次刺激之后，进行检测记忆CTL的试验。简言之，将免疫或对照小鼠的脾或淋巴结细胞，以6∶1的比例，与感染流感病毒的同基因的脾细胞一起培养五天。培养基是用10％胎牛血清[Hyclone Laboratories，Logan，UT]，2mM谷氨酰胺，5×10-5M 2-ME，10mM HEPES，青霉素和链霉素补充的RPMI1640。
在7周时取出皮下注射过50μg D蛋白一次或两次(0和3周)的小鼠脾脏，并且如上述进行体外再刺激。一个溶解单位(LU35)定义为在铬释放试验中达到35％溶解(通过回归分析确定)所需的效应细胞的数量。表13报告了这些用氢氧化铝和3D-MPL中的SK &F106160(D蛋白)免疫的小鼠脾脏H1N1-特异性CTL活性的结果。
表13每个培养的LU35A/PR/R/34 A/Taiwan/86对照组靶器官靶器官 靶器官 存活百分比#注射次数1 2 1 2 1 2 1 2制剂D/Al+3+＜1 1953 5651 69 7 33D/Al+3/3D-MPL*＜1 ＜1 41 4364 53 40+，++73+，++D/CFA*＜1 ＜1 1298898 13153+，++93+，++Al+3＜1 ＜1 ＜1 ＜135 35 未测得 7Al+3/3D-MPL 18 18＜1 ＜129 29 未测得 0CFA ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1＜1 未测得 0*＝抗原量是50μg流感D蛋白+＝与佐剂对照组相比P＜0.05++＝与Al3+佐剂组相比P＜0.05
在此实施例的实验中，3D-MPL不能增强与用如表13中所报告的氢氧化铝(用Al+3表示)产生的应答有关的I级限制记忆CD8+CTL。另外，表13的结果显示将接受过1次皮下注射的小鼠的脾CTL与接受过2次的可相比，就保护力而言接受过第二次注射的小鼠的保护力明显增强。
因而表明当含有抗原肽和铝佐剂的疫苗组合物中加入了3D-MPL时，或给小鼠进行一次加强注射时，所观察到的免疫功能改善是由于除CD8+CTL以外的机制所引起的。实施例24-清除研究为了进一步确定哪一种T细胞亚群与3D-MPL佐剂的活性最为相关，用抗-CD-4或抗-CD-8单克隆抗体(Mabs)进行了清除研究。在下面的T细胞亚群清除中，用接种后的数据进行最初研究。在第0和第21天对小鼠(15/组)皮下注射2次含50μg流感D(SK & F106160)的Al/3D-MPL，使其产生免疫。并且在第42天用5倍半数致死量(5LD50)的A/PR/8/34激发。在接种后在激发前的第32，第33，第34，第39，第40天和第41天和激发后的第43，第48，第53天，腹膜内给药抗体(300μg/小鼠)。在另一项研究中，在第一次注射疫苗前三天，前二天，前一天，用Mabs处理小鼠以清除T细胞亚群(接种前的数据)，在第0天接种疫苗，在接种疫苗后的第7天，第14天，第18天，第19天和第20天用Mabs进一步处理小鼠，然后在第21天用疫苗加强。在用病毒激发前的第28天，第35天，第39天，第40天和第41天用Mabs再进一步处理小鼠，在第42天用病毒激发。在激发后的第43天，第49天和第54天用Mabs再进一步处理小鼠。这些T细胞亚群清除试验的结果在下面表14中显示。这些结果表明不论是清除小鼠的CD4+还是CD8+T细胞亚群时，疫苗接种的效力减弱，当接种疫苗前用Mab处理时，这种效果更加明显。因而，这些结果明确地说明在Al/MPL制剂中的流感D疫苗的作用机理是T细胞介导的，并且两个T细胞亚群对此疫苗的活性都是需要的。
因为γ干扰素的产生与保护有关(表11)，所以进行一项研究以确定引起接种后小鼠产生此种细胞因子的T细胞的表型。通过每天腹膜内注射抗-CD4或抗-CD8 Mabs三天(300μg/注射)，来清除小鼠的CD4+或CD8+T细胞亚群。最后一次Mab注射的4天后，用含20μg流感D蛋白的氢氧化铝(100μg)和3D-MPL(20μg)制剂给小鼠免疫接种，并且在7天后取出小鼠的淋巴结。在体外用0，1或10μg/ml D蛋白再刺激淋巴结细胞，并且收集1-4天的上清液以测定干扰素和IL-2。图5的结果表明通过抗-CD4处理，完全清除了IL-2的产生，在抗-CD-8处理过的小鼠中也部分地减少了IL-2的产生(如图5B)。在抗-CD4或抗CD8处理的小鼠中，IFNγ的产生峰值(第4天上清液中)减少大约50％(图5C)。因此，CD4+和CD8+T细胞亚群都产生IL-2和IFNγ。
表14％存活率 ％存活率抗原 3D-MPL 单克隆(单克隆抗体- (单克隆抗体(μg) (μg) 抗体处理 接种后) 接种前)50 10无 70*80*50 10抗-CD4 30 20+50 10抗-CD8 50**0+50 10抗-CD4+抗-CD8 30 10+0 10无 0 0*相对于佐剂对照组(第5组)P≤0.002**相对于佐剂对照组(第5组)P≤0.02+相对于未处理对照组(第1组)P≤0.01以上提供的实施例说明，使用铝加3D-MPL制成的重组流感H1N1疫苗，可以促进病毒清除，增加存活率，并且减少为有效抵抗致死性激发，达到用CFA所观察到的相当水平的效力所需的抗原量。目前收集的资料证实3D-MPL能够增强这种重组流感疫苗活性的作用机理是通过选择性增强CD4+T细胞的应答而发生作用的。并且可能局限于产生IL-2和IFNγ的TH1型细胞。实施例25-分离型病毒的制备分离型病毒，如由Sachsisches Serumwerkl GmbH(SSW)(Dresden，Germany)生产的，可以用熟知的方法制备，例如在欧洲药曲PA/PH/Exp 3(1992)；DAB 10“Vaccines Influenzae exvirorum fragmentis praeparatum”和世界卫生组织草订的流感疫苗(灭活的)要求(1990)中公开的方法。这种分离型病毒用一个或多个流感病毒菌株制备，这些菌株是WHO和EEC所推荐的，如A/Singapore/6/86，A/Beijing/32/92和B/Panama/45/90。这些菌株可以随流行年的流行菌株而改变。
如其它文献所详细描述的那样，可从接种过种批物质的受精鸡蛋中获得流感病毒。不完全地提纯和浓缩这些病毒悬浮液。用一种洗涤利，脱氧胆酸钠，处理此浓缩的病毒悬浮液以分裂(或“分离”)病毒颗粒。随着分离过程中病毒磷脂的去除，致反应性潜力大大地减少。通过此洗涤剂和甲醛的联合作用可使此分离病毒悬浮液完全灭活。
本发明分离病毒的制备过程，更加详细地描述如下。A.单价完整病毒接种物的制备在给受精鸡蛋接种的当天，通过将作为种批的流感病毒和一种磷酸盐缓冲液相混合而制备出新鲜的接种物，此缓冲液每毫升含有0.5mg硫酸庆大霉素和25μg氢化可的松。此病毒接种物在2～8℃下保存。
将9～11天的旧的受精鸡蛋用于病毒复制。在到达工厂和进入生产车间前，在饲养场清洁外壳后孵育这些鸡蛋。在一种自动鸡蛋接种器上用0.2ml的病毒接种物接种鸡蛋。以±0.03MPa的压力注射接种物。在适宜的温度下(病毒株依赖的)孵育此被接种的鸡蛋50到96小时，在孵育期结束时通过冷却杀死这些胚胎并在2-8℃下贮存12-60小时。
通过适宜的鸡蛋采集机采集这些冷却鸡蛋的尿囊液。通常，每个鸡蛋可采集到8～10ml尿囊液粗品。向粗品单价病毒群中加入0.100mg/ml硫汞撒。
以流量为100～200升/小时和离心力为10～17,000g的条件进行流动离心澄清这些已采集的尿囊液，这种预澄清的液体可在6～8μm滤过膜上进一步澄清。
为在已澄清的病毒收集液中获得CaHPO4凝胶，加入0.5MNa2HPO4和0.5M CaCl2溶液以使CaHPO4的最终浓度为1.5～3.5g/L，此浓度随病毒株而定。沉淀至少10小时后，去掉上清液，向含有流感病毒的沉积物中加入0.26M EDTA溶液以再溶解，EDTA的浓度在4.5～10g/L原始采集量之间变化。
这种重新悬浮过的沉积液通过一个6～8μm滤膜过滤。
通过在线性蔗糖梯度(0～55％)下以90,000g进行等密度离心浓缩流感病毒。流量为8～12升/小时。在离心分离结束时，通过四种不同馏分(在折光仪中测定蔗糖)回收转子内容物。
-馏分155～52％蔗糖-馏分252～38％蔗糖-馏分338～20％蔗糖-馏分420～0％ 蔗糖为了进一步制备疫苗，仅用第2和第3馏分。为将蔗糖含量减至6％左右，稀释第3馏分。以53,000g离心力将此稀释馏分中的流感病毒沉淀为丸状物以除去可溶解的杂质。将沉淀小丸再悬浮并完全混合以获得均匀的悬浮液。收集第2馏分和第3馏分的再悬浮丸状物，并加入磷酸盐缓冲液，以获得30升体积。此步骤中的产物称为“单价完整病毒浓缩物”。B.分离型病毒单价物质通过含有线性分布为1.2～1.5％的脱氧胆酸钠的梯度为0～55％的Nadoc线性蔗糖以70,000离心力离心，使选择的流感病毒，最好是上述部分A中的单价完整病毒浓缩物，分裂。在此梯度中含有0.1％的吐温80，以5升/小时的速度泵出病毒浓缩物。在离心分离结束时，将转子内容物收集在3种不同的馏分中。
馏分155～40％蔗糖馏分2 40～13％蔗糖馏分3 13～0％ 蔗糖在第2馏分中浓缩血凝素，加入含0.01％硫汞撒和0.01％吐温80的磷酸盐缓冲液，将此馏分稀释四倍(5升左右)。
将稀释的第2馏分在滤膜上过滤，最后用0.2μm滤膜过滤，在过滤结束时，用含0.01％硫汞撤和0.01％吐温80的磷酸盐缓冲液冲洗滤器。结果，过滤后的第2馏分的最终体积是原来体积的5倍。根据病毒株的不同，可以对分离病毒物质进行短暂声波处理以促进无菌过滤。
将此过滤的单价分离型物质在22±2℃下孵育至少84小时，以通过脱氧胆酸钠的作用使病毒和支原体灭活。孵育时间过后，加入含0.01％硫汞撒和0.01％吐温80的磷酸盐缓冲液以使总蛋白含量降至最多为250μg/ml。以50μg/ml的比例加入甲醛，在4℃±2℃下至少72小时以进行灭活。
通过平均孔径大小为20,000道尔顿的滤膜超滤灭活的分离型病毒物质。在超滤期间，甲醛、NaDOC和糖类的含量大大减少。通过加入含0.01％硫汞撒和0.01％吐温80的磷酸盐缓冲液，保持超滤期间的体积不变。
通过滤膜过滤超滤分离型病毒物质，最后用0.2μm的滤膜，根据病毒株，最终的滤膜可以是0.8μm。在此步骤中产物称为“单价最终物质”。将单价最终物质在2～8℃下贮藏最多18个月。实施例26-分离型病毒疫苗组合物(a)颗粒大小为60～120nm的MPL的制备将注射用水用注射器注入含有购自Ribi Immunochem，Montana的冻干3脱酰基单磷酰脂质A(MPL)的小瓶中，使其浓度达到每ml1～2mg，通过使用涡流器混合获得预备悬浮液。然后将小瓶内容物移入25ml圆底Corex试管(每管10ml悬浮液)，并且用水浴声处理器处理此悬浮液。当悬浮液变得澄清时，用动态光线散射(Malvern Zetasizer 3)估计颗粒的大小。继续处理直到MPL颗粒的大小在60～120nm范围内，优选100nm以下。
在某些情况下，可将悬浮液在4℃下贮藏5个月而没有明显的凝聚。等渗NaCl(0.15M)或等渗NaCl加10mM磷酸盐可引起快速凝聚(大小＞3～5μm)。(b)本发明分离型病毒疫苗组合物制备如下通过向注射用水中加入含NaCl 4mg；Na2HPO40.52mg；KH2PO40.19mg；KCl 0.1mg；和MgCl20.05mg，和硫汞撒50μg的浓缩盐溶液，制备最终缓冲液原液。在下一步使用前搅拌所得溶液15分钟。
然后将单价分离型病毒物质(15μg HA)与50μg 3D-MPL混合，在室温下(或环境温度下)搅拌所得混合物约1小时。
然后将缓冲液混合物与病毒物质混合物混合在一起，在室温下搅拌30分钟后，将pH调至7.15±0.1。将所得最终疫苗在+2～+8℃下贮藏。
为制备多价分离型病毒疫苗，如三价疫苗，混合如上所述制备的选择毒株的单价分离型病毒物质而构成最终多价疫苗。在室温下(pH为7.15±0.1)搅拌所得混合物30分钟。所得的最终疫苗可在约2℃～约8℃的温度下贮藏。此疫苗是纯化的分离型流感病毒的无色，浅乳光水悬浮液。
制备一种未加佐剂的疫苗制剂，与下面的实施例中的实验相比较。为了制备此对照疫苗，通过向注射用水中加入浓缩盐溶液NaCl4mg；Na2HPO40.52mg；KH2PO40.19mg；KCl 0.1mg；MgCl20.05mg和硫汞撤50μg而制备最终单价缓冲液原液。在下一步使用前，搅拌所得溶液15分钟。在室温下搅拌混合物15分钟。加入单价分离型病毒物质(15μg HA)，在室温下(pH为7.15±0.1)搅拌30分钟。将所得最终疫苗在+2℃～+8℃下贮藏。
使用H1N1毒株，A/PR/8和Singapore与50μg 3D-MPL相混合(颗粒大小＜100nm，按实施例26(a)获得)，制备用于下面实施例的本发明2种单价疫苗组合物和单价对照疫苗。实施例27-小鼠的致死性激发通过小鼠的致死性流感激发评价本发明单价疫苗制剂的免疫原性，并与单价无佐剂制剂和无抗原3D-MPL佐剂的免疫原性对比。
对于每种疫苗，用含5μg指定株±5μg 3D-MPL的制剂给CB6F1小鼠(每组30个)皮下注射2次使其产生免疫，其2次注射间隔3周。首次注射后7周，用5倍半数致死量(5LD50)的A/PR/8在甲氧氟烷麻醉下，鼻内激发小鼠。激发后监测15个小鼠最多至3周的存活率和患病临床指征。通过MDCK显微测定[A.L.Frank et al，J.Clin.Microbiol.，12426-432(1980)]确定存活动物(每组5个小鼠)的肺病毒效价。
结果报告于下面表15中。
表15小鼠致死激发存活率和肺病毒效价
*log TCID/肺病毒(几何平均数±S.E.)#无明显临床症状此两种病毒株(A/PR/8和Singapore)诱导一定程度的保护。两组存活率都明显高于无抗原的对照制剂(铝＋3D-MPL)，并且肺病毒清除也较快。并不奇怪，A/PR/8疫苗组(就激发而言是同源的)比Singapore疫苗组(就激发而言是异源的)表现更好。此外，补充有3D-MPL的两种病毒株都产生100％存活率，基本上无肺病毒效价，而且无临床症状。很明显，本发明3D-MPL佐剂疫苗可以针对下呼吸道感染和由此而来的严重临床表现(如病毒性肺炎)产生更强保护。由此实验可见3D-MPL佐剂可改善此分离型病毒疫苗的同源亚型和异源亚型的活性，而且，因此针对抗原转变和漂离，可望提供比无佐剂疫苗更广泛的保护。实施例28-小鼠非致死性激发除了小鼠在鼻内激发前未经麻醉外，实施方案与上面实施例25相同。进行呼吸道病毒滴定，病毒中和测定和气管电子显微镜扫描。
在激发后第1，5，9天进行对A/PR/8病毒的病毒中和滴定实验(表16)。
表16病毒中和测定
*log10的平均数(5个小鼠)两个A/PR/8组都产生中和抗体，并且含3D-MPL的组的滴度一律都较高。相反，含Singapore疫苗未产生中和抗体，甚至加入3D-MPL也未产生。这表明在以前用Singapore和3D-MPL观察到的异源亚型活性不是由抗体产生的，并且有力证明了是由细胞介导的免疫产生的。
对第3天和第5天收集的样品进行气管电子显微镜扫描(SEM)。对气管严重的纤毛上皮细胞的病理组织学变化，特别是脱屑(desqumation)，进行评价。这些变化表明了流感病毒持续感染的严重程度或感染后的恢复(看下面表17)。
表17小鼠的非致死性激发气管的电子显微镜扫描
>*半量表示，双盲评估。
再定义1严重损害2部分损害3正常组织**综合评分，从0(无保护)到4+(完全保护)SEM的结果显示只带有A/PR/8或者Singapore毒株的疫苗可提供保护；在这两种情况下加入3D-MPL可增强这种阳性作用。由此说明带佐剂的分离型疫苗可以改变流感疾病的发展过程。
通过激发后第1，3，5，7和9天的(每组5个小鼠)MDCK显微测定，确定鼻、气管和肺中的病毒效价。结果在下面图6A至6F中显示。并不奇怪，鼻中效价高于气管或肺中的效价。但是，被测定的各种处理均未引起鼻中或气管中效价的明显不同。相反，肺中效价是不同的A/PR/8＋3D-MPL和Singapore＋3D-MPL的效价总低于或等于单独抗原，或者单独3D-MPL的效价(图6A至6F)。这表明3D-MPL佐剂可以给予小鼠较高的肺保护。
两组小鼠试验(致死性激发或非致死性激发)表明通过按照本发明将3D-MPL作为一个佐剂加入，可以改善带有两种H1N1毒株亚型(Singapore和A/PR/8)和随后的同型激发的流感疫苗接种。实施例29-疫苗的免疫原性对于每种疫苗，用含十分之一人剂量的常规无佐剂Singapore单价分离型疫苗制剂或含有3D-MPL佐剂的SingaPore毒株的本发明疫苗组合物制剂，通过2次皮下注射对CB6F1小鼠(每组15个)进行免疫，其2次注射间隔3周。人剂量定义为0.5ml注射液含15μg每种病毒株的HA。此处所用制剂含血凝素(HA)与3D-MPL的比例为1.5μg HA/5μg 3D-MPL～5μg HA/5μg 3D-MPL。对照组仅接受3D-MPL(5μg)。第二次注射的3周后，给小鼠抽血，通过抑制血红素凝集反应逐个测定血清抗体。与一个标准参考值相比计算效价。如果小鼠的抗体效价高于截止值，则被认为是应答者。
在表18中报告结果。两种制剂在所有动物中均产生抗血红素凝集抗体，因而血清反应率是最高的。但是，含3D-MPL的本发明疫苗制剂明显增强了免疫应答，这一点已通过其几何平均效价高于仅含Singapore毒株疫苗的效价5倍多而得到证实。
表18
*截止值低于25此试验表明通过应用本发明3D-MPL佐剂疫苗增强了小鼠的抗体应答。实施例30-在荷兰猪中的过敏性研究对荷兰猪进行过敏性研究，以确定向一个三价分离型疫苗中加入3D-MPL(颗粒大小＜100nm，实施例26)是否可以改变过敏反应。如实施例25所述制备一种三价疫苗，命名为Trivalent Influsplit，它含有一个H1N1毒株Singapore/6/86，一个H3N2毒株Beijing/353/84和一个B型株，B/Yamaghta/16/88。
分别在第0，3，5，7，10和12天腹膜内注射致敏剂6次[致敏剂为尿囊液0.5或2.5mg±3D-MPL 50μg；一个人剂量(0.5ml注射液含15μg每种流感病毒株的HA)的TrivalentInflusplit±3 -MPL 50μg]。使荷兰猪静养4周，然后在麻醉下，用激发剂(尿囊液0.45mg；一个人剂量的Trivalent Influsplit±3D-MPL 50μg)静脉内激发。在激发后30分钟观察动物，并且在2或3小时后再观察一次。记录观察到的症状(搔抓，呼吸异常，惊厥，死亡)。第一次激发没有症状出现的动物，在24小时后用尿囊液(1.3mg)再激发。
测定结果在下面表19A和19B中显示。
表19A-Influsplit±3D-MPL的过敏性研究
表19B-Inflsplit±3D-MPL的过敏性研究
第1到第3组(阴性对照组)没有作用表明过敏反应需要事先腹膜内致敏。第5组没有致敏作用表明流感分离病毒(Influsplit)不能对尿囊液致敏。从第6组(对尿囊液致敏并且用流感分离病毒(Influsplit)激发)可以得出相似的结论。事实上，第5和第6组的结果也表明疫苗不包含尿囊液蛋白的残余物。无论向致敏剂加入3D-MPL(第7，8组)，还是向激发剂加入3D-MPL(第9组)都不能改变这种应答(将第7组与第4组相比；第8组与第5组相比；第9组与第6组相比)。
实验表明三价流感分离病毒疫苗作为致敏剂，有或无3D-MPL均不会产生过敏反应。三价流感分离病毒疫苗作为激发剂，有或无3D-MPL都不会在事先用尿囊液致敏过的动物中激发任何过敏反应，并且在实验条件下，3D-MPL在过敏反应方面没有任何可观察到的作用。因而，本发明疫苗组合物对哺乳动物给药是安全的。
如上的说明书中包括了本发明为数众多的修改和变异，并且它对于此领域的一般技术人员是显而易见的。相信，本组合物以及本发明的方法的修改和变化都包括在所附带的权利要求的范围之内。
权利要求
1.一种能够激发对流感抗原的加强免疫反应的疫苗组合物，它包含有效量的所述流感抗原和3D-MPL。
2.按照权利要求1的疫苗组合物，其中所述的流感抗原是一种抗原性多肽。
3.按照权利要求1的疫苗组合物，其中所述的抗原性多肽选自于下列一组D蛋白NS11-81HA265-222，NS11-81HA21-222，HA266- 222，ΔM，ΔM+，A，C，C13，C13短肽，AD，Cys-less D，HA266-222，和NS1H3HA2构建体。
4.按照权利要求1的疫苗组合物，其中所述的组合物包含至少一种分离的流感病毒。
5.按照权利要求4的疫苗组合物，其中所述的组合物包含具有抗至少三种流感病毒菌株活性的三种分离病毒。
6.按照权利要求4的疫苗组合物，其中所述的菌株选自于H1N1，H3N2，H2N2和B型流感菌株。
7.按照权利要求6的疫苗组合物，其中所述的分离病毒来源于下列一组流感菌株A/PR/8，A/Singapore，A/Udorn，A/Victoria，A/Texas，A/Beijing，A/Puerto Rico，B/Panama，B/Yamaghta，B/Lee/40，和B/Taiwan。
8.按照权利要求1的疫苗组合物，还含有一种含铝佐剂。
9.按照权利要求8的疫苗组合物，其中所述的佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
10.按照权利要求9的疫苗组合物，其中流感抗原是NS11-81HA265-222，D蛋白。
11.按照权利要求10的疫苗组合物，它是由约1μg至约1000μg的D蛋白和约1μg到约50μg的3D-MPL组成的。
12.按照权利要求11的疫苗组合物，其中所述的D蛋白用量是2μg左右而所述3D-MPL用量是20μg左右。
13.按照权利要求3的疫苗组合物，其中所述的抗原是D蛋白，所述的组合物包含约50μg到约500μg的D蛋白，约10μg到约50μg的3D-MPL和约100μg到约500μg的铝佐剂。
14.按照权利要求1到13中任一项的疫苗组合物，还包含一种脂质体制剂，其中所述的脂质体制剂包含含有一种长链脂肪族的或芳香族酸或胺的脂质体形成物质；以相对于酸或胺为1∶20到1∶0.05的摩尔比存在的，与酸或胺电荷相反的一种水合剂；相对于存在于组合物中的固体以最多达300摩尔用量的水。
15.按照权利要求14的疫苗组合物，是由约50μg到约500μg的D-蛋白，约10μg到约50μg的3D-MPL，和约1mg到约10mg的脂质体制剂组成。
16.按照权利要求14的疫苗组合物，其中所述的抗原是流感D，它由约50μg到约500μg的D蛋白，约10μg到约50μg的3D-MPL，约1mg到约10mg的脂质体制剂和约100μg到约500μg的铝佐剂组成。
17.按照权利要求14到16中任一项的疫苗组合物，其中水合剂是一种带有羧酸酯、氨基或胍基官能团的ω-取代基的α-氨基酸或其可药用的盐，或式I的化合物或其可药用盐X-(CH2)n-YI其中X是H2N-C(NH)-NH-，H2N-，ZO3S-，Z2O3P-，或ZO2C-，其中Z是H或无机或有机阳离子；Y是-CH(NH2)-CO2H，-NH2，-NH-C(NH)-NH2-COOH，CH(NH2)SO3Z或ZH(NH2)PO3Z2，其中Z如上所定义；和n是1-10的整数；和该酸或胺是10到20个碳原子的烷基或链烯基酸或胺。
18.按照权利要求17的疫苗组合物，其中所述的水合剂是精氨酸，高精氨酸，它们的N-酰基衍生物，γ-氨基丁酸，天冬酰胺，赖氨酸，鸟氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或下列化学式的化合物H2NC(NH)-NH-(CH2)n-CH(NH2)COOHIIH2N-(CH2)n-CH(NH2)COOH IIIH2N-(CH2)n-NH2IVH2NC(NH)-NH-(CH2)n-NH-CH(NH)-NH2VHOOC-(CH2)n-CH(NH2)COOHVIHOOC-(CH2)n-COOH VIIHO3S-(CH2)n-CH(NH2)COOH VIIIH2O3S-(CH2)n-CH(NH2)COOH IXHO3S-(CH2)n-CH(NH2)SO3H X，或H2O3S-(CH2)n-CH(NH2)PO3H2XI其中n是2-4，或其可药用的盐。
19.按照上述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中3D-MPL的颗粒大小不超过120nm。
20.按照权利要求19的疫苗组合物，其中所述的颗粒大小在60-120nm范围内。
21.按照权利要求19或20的疫苗组合物，其中所述的颗粒大小小于100nm。
22.一种增强对流感抗原的免疫反应的方法，包括给哺乳动物内服权利要求1的疫苗组合物的步骤。
23.权利要求1疫苗组合物用于生产增强对流感抗原的免疫反应的药物的用途。
24.一种制备权利要求1疫苗组合物的方法，包括混合所述的抗原和3D-MPL。
全文摘要
本发明涉及能够增强对选择的流感抗原的保护反应的疫苗组合物。该组合物至少含有抗原和3D-MPL。还涉及用这些组合物增强对流感的免疫反应的方法。
文档编号A61K39/39GK1124013SQ94191720
公开日1996年6月5日 申请日期1994年2月15日 优先权日1993年2月19日
发明者S·迪龙, H·西川, P·D·蒙蒂, R·J·基里克, N·M·J·C·加康-约翰逊 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司, 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司