专利名称：鼠神经生长因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术制药领域，特别是一种鼠神经生长因子(NGF，NerveGrowth Factor)的制备方法。
现有技术中，鼠匀浆液经反复冻融去脂离心后，取上清液直接上柱。这样匀浆上清液因含脂较多，很容易堵塞柱介质，使得上样流速逐渐变慢，甚至堵塞，柱下部有被抽干现象，给层析和介质再生带来很大困难。另外，目前鼠神经生长因子的制备采用的是羧甲基纤维素阳离子层析介质(CM-52)，在使用过程中，此介质线性流速慢，一般使用的速度为20cm/h，这种速度在实验室制备中尚可使用，若用于规模化生产，就会使生产周期过长，而鼠神经生长因子的制备又受温度的限制，因此，过长的生产周期不但会影响生产效率，而且还会给生产过程带来很多难以克服的困难。
本发明的目的是针对现有技术中的不足而提供的一种采用细胞碎屑清除剂(CDR)去脂及高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)柱层析的方法来制备鼠神经生长因子，它可提高产品纯度和工效。
实现本发明目的的具体技术方案是鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，取上清用CDR去脂过滤，收集滤液对0.02mol/L PB透析24小时，透析液上CM-FF(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-FF(II)柱，解离收NGF样。
特点是冻融液经离心后采用CDR去脂，具体方法是取出经冻融的匀浆液，4℃8000rpm离心1小时，上清液用漏斗脱脂棉过滤，滤液加入CDR，100ml加入20g CDR，静置5分钟，布氏漏斗抽滤，收集去脂滤液包透析袋，4℃条件下对0.02mol/L pH＝6.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(PB)透析24小时，12小时换一次液，拆袋取透析内液置于烧杯内待用，透析液与滤液总量的比例为10∶1。
采用高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)进行两次柱层析。具体方法是I)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(I)柱层析(1)装柱装柱前应检查垫圈密封性，上下连接管完好，并用无热原水试柱。密封时上下流速应一致。将检查完好的柱子垂直固定于支架上，打开上盖，夹紧下管，倒入无热原水约10～15cm柱高，打开下管排出气泡至余2cm柱高，用两倍于装柱介质的无热原水将介质稀释成糊状，沿壁缓慢加入柱中自然沉降至所需高度。装柱后，先以约两个柱床体积无热原水洗涤，线性流速100ml/h.cm2，然后用约4倍柱体积的pH6.8的0.02mol/L PB在100ml/h.cm2的速度平衡层析柱。
(2)仪器调整与上样在层析柱用上样缓冲液平衡的条件下，打开紫外检测仪与记录仪，预热半小时。将层析柱出口管与紫外检测仪、记录仪相连，待检测仪基线走稳后调零点、量程、灵敏度、电压及走纸速度，调好后即可上样。以100ml/h.cm2的流速上样，待记录仪上有蛋白峰出现时，收集流出液。上样完毕，继用pH＝6.8的0.02mol/L PB流洗，直到流出液A280nm＜0.05为止(通常为下降至水平基线)。
(3)酸化解离CM-FF(I)柱的流出液用透析袋包袋，每袋90～100ml，以pH6.8，0.25mmol/L PB透析24h。流出液与缓冲透析液比例为1∶10，其间换液1～2次。收集透析袋内液体，按总量的1/9加入pH4.0，0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(AB)，同时加入干烤的分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0.4mol/L，4℃放置10分钟，8000rpm离心40分钟，取上层清液。
(II)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(II)柱层析装柱同CM-FF(I)柱，装柱量一般1000对鼠颌下腺装量100ml。水洗两个柱床体积后，以pH4.0，0.05mol/L AB加0.4mol/L NaCl(ABS)平衡后泵入酸解上清液，流速100ml/h.cm2，上样完毕，继用ABS洗柱至基线。再用两个以上柱床体积的pH4.0 AB洗柱。用pH＝9.0的0.05mol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-Cl)洗脱杂蛋白，待杂蛋白洗脱至基线后，用pH＝9.0的0.05mol/L Tris-Cl，并加入干烤NaCl至终浓度达0.4mol/L的缓冲溶液洗脱并收集目标蛋白峰即为NGF原液。
本发明通过使用CDR去脂，既提高了层析介质的使用效率，又提高了蛋白收量。采用CM-FF柱层析，线性流速可达200cm/h，流速快，大大缩短了生产周期，适用于规模化生产。
下面详细描述一下鼠神经生长因子的制备过程鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，取上清用CDR去脂过滤，收集滤液对0.02mol/LPB透析24小时，透析液上CM-FF(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-FF(II)柱，解离收NGF样。
1 NGF的粗制1.1鼠颌下腺匀浆液的制备取出冷冻的颌下腺，融化后，加入5～7倍预冷的灭菌无热原水，放入匀浆器中匀浆，放入量随匀浆器容积大小而定，一般为容积的1/3，30秒/次，转速为10000转/分(rpm)，间隔30秒，共3次，匀浆后的悬液分装入处理好的塑料瓶，在-20℃以下低温与室温反复冻融3～4次。
1.2 NGF的粗制取出经冻融的匀浆液，4℃8000rpm离心1小时，上清液用漏斗铺脱脂棉过滤去脂，滤液加入CDR(100ml加入20g CDR)静置5分钟，布氏漏斗抽滤，收集去脂滤液包透析袋，4℃条件下对0.02mol/L pH＝6.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(PB)透析24小时，12小时换一次液，拆袋取透析内液置于烧杯内待用，透析液与滤液总量的比例应为10∶1。
2.NGF的精制2.1高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(I)柱层析(1)装柱装柱前应检查垫圈密封性，上下连接管完好，并用无热原水试柱。密封时上下流速应一致。将检查完好的柱子垂直固定于支架上，打开上盖，夹紧下管，倒入无热原水约10～15cm柱高，打开下管排出气泡至余2cm柱高，用两倍于装柱介质的无热原水将介质稀释成糊状，沿壁缓慢加入柱中自然沉降至所需高度。装柱后，先以约两个柱床体积无热原水洗涤，线性流速100ml/h.cm2，然后用约4倍柱体积的pH6.8的0.02mol/L PB在100ml/h.cm2的速度平衡层析柱。
(2)仪器调整与上样在层析柱用上样缓冲液平衡的条件下，打开紫外检测仪与记录仪，预热半小时。将层析柱出口管与紫外检测仪、记录仪相连，待检测仪基线走稳后调零点、量程、灵敏度、电压及走纸速度，调好后即可上样。以100ml/h.cm2的流速上样，待记录仪上有蛋白峰出现时，收集流出液。上样完毕，继用pH＝6.8的0.02mol/L PB流洗，直到流出液A280nm＜0.05为止(通常为下降至水平基线)。
(3)酸化解离CM-FF(I)柱的流出液用透析袋包袋，每袋90～100ml，以pH6.8，0.25mmol/L PB透析24h。流出液与缓冲透析液比例为1∶10，其间换液1～2次。收集透析袋内液体，按总量的1/9加入pH4.0，0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(AB)，同时加入干烤的分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0.4mol/L，4℃放置10分钟，8000rpm离心40分钟，取上层清液。
2.2高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(II)柱层析装柱同CM-FF(I)柱，装柱量一般1000对鼠颌下腺装量100ml。水洗两个柱床体积后，以pH4.0，0.05mol/L AB加0.4mol/L NaCl(ABS)平衡后泵入酸解上清液，流速100ml/h.cm2，上样完毕，继用ABS洗柱至基线。再用两个以上柱床体积的pH4.0 AB洗柱。用pH＝9.0的0.05mol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-Cl)洗脱杂蛋白，待杂蛋白洗脱至基线后用pH＝9.0的0.05mol/L Tris-Cl，并加入于烤NaCl至终浓度达0.4mol/L的缓冲溶液洗脱并收集目标蛋白峰即为NGF原液。
权利要求
1.一种神经生长因子(NGF)的制备方法，具体步骤为鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，收集上清对0.02mol/L PB透析24小时，透析液上CM-52(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-52(II)柱，解离收NGF样。其特征在于，具体步骤改为鼠颌下腺经匀浆后，匀浆液反复冻融，冻融液8000rpm离心1小时，取上清用CDR去脂过滤，收集滤液对0.02mol/L PB透析24小时，透析液上CM-FF(I)柱，收集流穿液透析，酸解液上CM-FF(II)柱，解离收NGF样。具体方法a.采用细胞碎屑清除剂(CDR)介质去脂具体方法取出经冻融的匀浆液，4℃ 8000 rpm离心1小时，上清液用漏斗脱脂棉过滤，滤液加入CDR，100ml加入20g CDR，静置5分钟，步氏漏斗抽滤，收集去脂滤液包透析袋，4℃条件下对0.02mol/L pH＝6.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(PB)透析24小时。12小时换一次液，拆袋取透析内液置于烧杯内待用，透析液与滤液总量的比例为10∶1；b.采用高流速琼脂糖阳离子(CM-FF)进行两次柱层析I)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(1)柱层析(1)装柱装柱前应检查垫圈密封性，上下连接管完好，并用无热原水试柱；密封时上下流速应一致；将检查完好的柱子垂直固定于支架上，打开上盖，夹紧下管，倒入无热原水约10～15cm柱高，打开下管排出气泡至余2cm柱高，用两倍于装柱介质的无热原水将介质稀释成糊状，沿壁缓慢加入柱中自然沉降至所需高度；装柱后，先以约两个柱床体积无热原水洗涤，线性流速100ml/h.cm2，然后用约4倍柱体积的pH6.8的0.02mol/L PB在100ml/h.cm2的速度平衡层析柱；(2)仪器调整与上样在层析柱用上样缓冲液平衡的条件下，打开紫外检测仪与记录仪，预热半小时；将层析柱出口管与紫外检测仪、记录仪相连，待检测仪基线走稳后调零点、量程、灵敏度、电压及走纸速度，调好后即可上样；以100ml/h.cm2的流速上样，待记录仪上有蛋白峰出现时，收集流出液；上样完毕，继用pH＝6.8的0.02mol/L PB流洗，直到流出液A280nm＜0.05为止(通常为下降至水平基线)；(3)酸化解离CM-FF(I)柱的流出液用透析袋包袋，每袋90～100ml，以pH6.8，0.25mmol/L PB透析24h；流出液与缓冲透析液比例为1∶10，其间换液1～2次；收集透析袋内液体，按总量的1/9加入pH4.0，0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(AB)，同时加入干烤的分析纯氯化钠(NaCl)至终浓度为0.4mol/L，4℃放置10分钟，8000rpm离心40分钟，取上层清液；(II)高流速琼脂糖阳离子交换剂(CM-FF)(II)柱层析装柱同CM-FF(I)柱，装柱量一般1000对鼠颌下腺装量100ml；水洗两个柱床体积后，以pH4.0，0.05mol/L AB加0.4mol/L NaCl(ABS)平衡后泵入酸解上清液，流速100ml/h.cm2，上样完毕，继用ABS洗柱至基线。再用两个以上柱床体积的pH4.0 AB洗柱；用pH＝9.0的0.05mol/L三羧甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-Cl)洗脱杂蛋白，待杂蛋白洗脱至基线后，用pH＝9.0的0.05mol/L Tris-Cl，并加入干烤NaCl至终浓度达0.4mol/L的缓冲溶液洗脱并收集目标蛋白峰即为NGF原液。
全文摘要
本发明公开了一种鼠神经生长因子(NGF)的制备方法,它将传统工艺中的层析介质CM－52改为CM－FF。线性流速可提高到200cm/h,流速快,大大缩短了生产周期,适用于规模化生产。在颌下腺匀浆液离心后,使用CDR去脂,既提高了层析介质的使用效率,又增加了蛋白收量,此工艺的改进较适用于规模化生产。
文档编号C07K14/48GK1271736SQ99103800
公开日2000年11月1日 申请日期1999年4月24日 优先权日1999年4月24日
发明者沈心亮, 应莲芳, 卜晓萍, 蒋琳, 翟雷, 周敏毅 申请人:卫生部兰州生物制品研究所