专利名称：细菌菌毛纯化新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生化工艺，确切地说是一种细菌菌毛纯化新工艺。
注射疫苗是预防致病细菌感染的有效手段。有些疫苗可以由该致病细菌的菌毛来制备。纯净的菌毛自人工培养的细菌上收集后经纯化而得。整个生化工艺包括细菌的培养和收集，然后用高速搅拌机使菌毛自菌体上脱落，离心分离，保留含有菌毛的上清液，加入硫酸铵使菌毛沉淀，最后纯化。
目前公知的菌毛纯化方法是将沉淀的菌毛悬浮在氯化铯溶液中，用超速离心机离心分离8小时，利用氯化铯溶液所独具的浓度梯度分布这一特定的性质来纯化菌毛。该工艺不仅需要贵重的仪器超速离心机和昂贵的氯化铯试剂，而且制备的菌毛纯度不高，其中混有杂质蛋白，尤其是菌毛自菌体脱落时所粘附的细菌外膜蛋白难以除去。
本发明所提供的纯化工艺可以有效地除去细菌外膜蛋白等杂质蛋白，旨在为制备疫苗提供高纯度的细菌菌毛。
本发明所提供的纯化工艺基于以下两个思路。一、菌毛也是一种蛋白质，但分子量较大，一般超过1千万道尔顿(10,000KD)，而菌毛中混杂的杂质蛋白分子量较小，一般只有数万道尔顿，因此可以使用超滤器，选择适当的超滤膜就可以分离、去除杂质蛋白。一般情况下选择10万道尔顿的超滤膜就可满足纯化要求，为节省超滤时间也可以选择20万、30万道尔顿等较大滤孔的超滤膜。二、选择恰当的去垢剂，在搅拌条件下去除菌毛粘附的细菌外膜蛋白，最后分离得到高纯度的菌毛。这种去垢剂应选择PH值接近中性的表面活性剂，如月桂醇硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基苯磺酸钠、去氧胆酸盐、甜菜碱衍生物等。
本工艺操作简单，使用的超滤器比超速离心机要简单、廉价得多，所用的表面活性剂也比氯化铯容易得到且价格便宜，制备成本可大幅度降低，而且可以大批量制备高纯度的菌毛，用这种菌毛制备的疫苗特异性强。
非限定实施例一、阴沟杆菌菌毛的纯化
阴沟杆菌(如
图1所示)是住院的病人很容易感染的条件性致病菌。它对多种抗生素如青霉素类、头孢类、氨基糖苷类和大环内酯类等均呈现耐药性。患者一旦被感染很难控制。若利用该菌的菌毛制备疫苗，可使患者获得免疫力，从而预防由该致病菌所引起的感染。
1、阴沟杆菌的培养与收集用液体培养基(CB或BBL)培养阴沟杆菌，然后离心收集阴沟杆菌。
2、菌毛的收集将阴沟杆菌悬浮在三羟基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，浓度10毫摩尔/升、PH7.2)缓冲溶液中，用高速搅拌机搅拌3-5分钟，停3-5分钟，防止温度过高引起菌体破裂。如此重复搅拌若干次，离心分离，弃去沉淀的菌体，保留上清液。
用饱和的硫酸铵溶液等体积加入上清液中，搅拌均匀，4℃条件下静置4小时。30000g低温离心分离15分钟，弃去上清液，保留沉淀的菌毛。
3、菌毛的纯化(1)超滤将收集的菌毛再次悬浮在Tris-HCl缓冲溶液中，使用超滤器进行超滤，选择10万道尔顿的超滤膜，使溶液中分子量小于10道尔顿的杂质蛋白被除去，而菌毛被截留。
(2)向悬浮有菌毛的Tris-HCl缓冲液(即超滤截留液)中加入月桂醇硫酸钠，使每升截留液中含25-55克，同时加入二硫苏糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩尔，搅拌2小时，离心分离，弃去上清液，将保留在沉淀中的菌毛反复处理三次，便得到高纯度的阴沟杆菌的菌毛。
去垢剂除了月桂醇硫酸钠外，还可使用月桂醇聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基苯磺酸钠、去氧胆酸盐、甜菜碱衍生物等。其使用浓度亦为每升截留液中含25-55克。
图2所示是各种方法纯化的阴沟杆菌菌毛用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法测定得到的电泳图。
A行是标准分子量，自上而下依次为97KD、66KD、45KD、30KD、20KD、14KD。KD为千道尔顿。
B行是硫酸铵沉淀得到的菌毛电泳图谱。
C行、D行是氯化铯溶液纯化得到的菌毛电泳图谱。
E行是本工艺得到的菌毛电泳图谱。
从以上图谱中可以看到，杂质蛋白B行最多，E行最少。在E行中清楚地显示主亚基分子量1.8万道尔顿(18KD)，其中含量较少被称之为粘附蛋白的亚基为3.5万道尔顿(35KD)。此粘附蛋白起识别粘膜组织特异性受体的作用。
二、致病大肠杆菌菌毛的纯化1、致病大肠杆菌的培养、收采及菌毛的收集同实施例一。
2、菌毛的纯化(1)超滤将沉淀的菌毛悬浮在Tris-HCl缓冲溶液中(浓度同实施例一)，使用超滤器进行超滤，选择20万道尔顿的超滤膜，除去杂质蛋白，截留菌毛。
(2)向截留液中加入去氧胆酸盐，使每升截留液中含25-55克，同时加入二硫苏糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩尔，搅拌2小时，离心分离，弃去上清液，将保留在沉淀中的菌毛反复处理三次，便得到高纯度的致病大肠杆菌菌毛。
去垢剂还可以使用甜菜碱衍生物，月桂醇硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸钠、烷基苯磺酸钠等，其使用浓度亦为每升截留液中含25-55克。
权利要求
1.一种细菌菌毛纯化新工艺，包括细菌的培养和收集以及菌毛的收集和纯化，其特征在于所述的纯化为(1)将收集的菌毛悬浮在Tris-HCl缓冲溶液中，使用超滤器选择等于或大于10万道尔顿的超滤膜进行超滤，保留含有菌毛的截留液；(2)向截留液中加入PH值接近中性的去垢剂月桂醇硫酸钠或者月桂醇聚氧乙烯醚硫酸钠或者烷基苯磺酸钠或者去氧胆酸盐或者甜菜碱衍生物，使每升截留液中含去垢剂25-55克，同时加入二硫苏糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩尔，充分搅拌，离心分离，收集沉淀的菌毛。
全文摘要
一种细菌菌毛纯化新工艺,包括细菌的培养和收集以及菌毛的收集和纯化,所述的纯化是将采集的菌毛悬浮在Tris－HCl缓冲溶液中,使用超滤器进行超滤以去除杂质蛋白,再使用去垢剂去除菌毛粘附的细菌外膜蛋白。本工艺简单,低成本,可大批量制备高纯度的菌毛,用这种菌毛制备的疫苗特异性强。
文档编号C07K1/36GK1228439SQ9910384
公开日1999年9月15日 申请日期1999年3月24日 优先权日1999年3月24日
发明者徐斌, 熊祖应 申请人:徐斌, 熊祖应