专利名称：原胶原c端蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制原胶原C端蛋白酶的化合物，含有它们的药物组合物，它们的使用方法，和用于制备这些化合物的方法。
胶原为结缔组织的组成部分。目前已有19种类型的胶原被鉴定。间质胶原型I、II、III是主要的组织胶原组成。这些胶原由含氨基和羧基末端的肽延伸链的原胶原前体分子合成。含氨基和羧基末端肽链也称为前体区(pro-regions)。这些前体区的断裂是基于原胶原分泌产生成熟的胶原分子，能够参与胶原纤维高级结构的建立。(见如Fesslcr和Fcssler，Anna.Rev.Biochem.47，129，(1978)；Kivirikko等，Extrawellular MatrixBiochemistry(1984)及Kuhn，胶原类型的结构与功能(eds Mayne，R和Burgeson，R.E.)，Academic Press，Inc.，Orlando，Florida pp 1-42(1987)。
过量的胶原沉积与多种纤维变性疾病有关，如间质性肺纤维变性、中枢周围纤维化、Symmers’纤维变性、外周肌肉纤维变性，肾纤维变性，心内膜硬化、肝炎、急性呼吸窘迫综合症、关节炎、膀胱纤维变性、外科手术粘连、腱外科、角膜疤痕形成、硬皮病、慢性同种移植排斥反应、血液透析分流纤维变性和再狭窄。这些疾病特征在于对抗蛋白分解的原纤维间质胶原的过度沉积从而导致纤维变性症状。因此，抑制这些胶原沉积的病理变化将有助于治疗这些疾病。
最近研究表明原胶原C端蛋白酶是催化I、II、III型胶原C-原肽断裂的主要酶，从而有助于功能胶原纤维的形成。(见Fertala等，J.Biol.Chem.，269，11584，(1994))。因此，有必要提供原胶原C端蛋白酶抑制剂从而提供通过调节胶原过度沉积而战胜这些疾病的方法。因此，在第一个方面，本发明提供了选自下组由式(I)表示的化合物 其中，R1和R4相互独立，为氢或烷基；R2为(i)环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳烯基，杂环或杂环烷基；或(ii)-(亚烷基)-B-X其中B为-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n为0、1或2)、-C＝O-、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NR8SO2-(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基杂芳基，或杂芳烷基；或(iii)-(亚烷基)-B-X其中B为NR8CO(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；或(iv)R2和R3形成亚烷基或杂亚烷基链；R3为氢或烷基；R6为氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基或杂芳烷基；R5为(i)氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳烯基，杂环烷基，杂烷基，或-(亚烷基)-C(O)-X1，其中X1为烷基，羟基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、杂芳基，杂芳氧基，杂芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互独立为H或烷基，或R’和R”形成亚烷基链)；或(ii)R4和R5形成一条亚烷基链；或(iii)R5和R6形成一条亚烷基链；n为0或1；A为-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)m-N(R10)-，其中，m为0-5的整数；R9为氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳烷基，杂环烷基，杂烷基，或-(亚烷基)-C(O)-X1，其中X1为烷基，羟基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、杂芳基，杂芳氧基，杂芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互独立，为H或烷基，或R’和R”形成亚烷基链)；和R10为氢，烷基，芳烷基，或杂芳烷基；Z为Y-B其中，Y为亚烷基或单键；和B为-CO-，-C(O)O-，-CONR8-，-SO2-，或SO2NR8-(其中R8为氢或烷基)，亚烷基(任选被羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基取代)或单键；R7为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；条件是当n＝0和Z为SO2时，那么R2不含有咪唑基；和它们药物可接受的盐、前体药物、单独的异构体、异构体的混合物。
在第二个方面，本发明提供了通过服用选自式(I)表示化合物的原胶原C端蛋白酶抑制剂治疗哺乳动物可治疗疾病的方法在第三个方面，本发明提供了包括给药治疗有效量的式(I)化合物或其药物可接受的盐和药物可接受赋形剂的药物组合物。
在第四方面，本发明提供了通过给病人服用一种原胶原C端蛋白酶的选择性抑制剂而治疗疾病的方法。
在第五个方面，本发明提供了用于制备式(I)化合物的方法。
除非另有说明，用于本说明书和权利要求的下列术语具有下面给出的含义“烷基”指1-6个碳原子的直链饱和一价烃基，或3-6个碳原子的支链饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、戊基等。
“亚烷基”指1-6个碳原子的直链饱和二价烃基，或3-6个碳原子的支链饱和二价烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基、亚戊基等。
“杂亚烷基”指一个亚烷基链中亚甲基被O，S或NR’取代(其中R’为氢或烷基)。
“烯基”指含有至少一个双键的2-6个碳原子的直链一价烃基，或3-6个碳原子的支链一价烃基，含有至少一个双键，例如乙烯基、丙烯基等。
“亚烯基”指含有至少一个双键的2-6个碳原子的直链二价烃基，或3-6个碳原子的支链二价烃基，例如亚乙烯基、2-亚丙烯基等。
“酰基”指基团-C(O)R，其中R为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳烯基，或杂环，例如乙酰基，苯甲酰基，噻吩甲酰基等。
“酰氧基”指基团-OC(O)R，其中R为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，或卤烷基，例如乙酰氧基，3，3，3-三氟乙酰氧基等。
“酰氨基”指基团-NRC(O)R’，其中R为氢或烷基，并且R’为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，杂烷基，卤烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烯基，或杂芳烷基，例如乙酰氨基，三氟乙酰氨基，苯甲酰氨基，甲基乙酰氨基等。
“磺酰氨基”指基团-NRSO2R’其中R为氢或烷基，并且R’为烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，杂烷基，卤烷基，氨基，单取代氨基，双取代氨基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳烯基，或杂芳烷基，例如甲基磺酰氨基，苯甲基磺酰氨基，N-甲基氨基磺酰氨基等。
“卤代”指氟代、氯代、溴代或碘代，优选氟代和氯代。
“卤代烷基”指被一个或更多的相同的或不同的卤素原子取代的烷基，例如-CH2Cl，-CF3，-CH2CF3，-CH2CCl3等。
“环烷基”指3-6个环原子的饱和单价环烃基，例如环丙基，环己基，环戊烷基等。
“碳环”指3-8个环原子的饱和环基，所有环原子为碳，如环戊基、环己基等。
“芳基”指6-10个环原子的单价单环或双环芳烃。该芳基任选稠合到碳环或杂环上，任选被一个或更多的取代基取代，优选一个或两个取代基，其中取代基选自烷基，杂烷基，卤代烷基，卤素，硝基，酰氧基，氰基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂芳烷基，-OR(其中R为氢，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，杂芳基，任选取代的苯基烷基，或任选取代的杂芳烷基)，-NRR’(其中R和R’相互独立为氢，烷基，烯基，卤烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，任选取代的苯烯基，杂芳基或杂芳烷基)，-C(O)R(其中R为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，任选取代的苯烯基，杂芳基，杂芳烷基或杂芳烯基)，-S(O)nR(其中n为0-2的整数，R为氢，(条件是n为0)，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，杂芳基，任选取代的苯基烷基，或杂芳烷基)，-SO2NRR’(其中R和R’独立选自氢，烷基，烯基，卤烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，任选取代的苯烯基，杂芳基或杂芳烷基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-COOH-(亚烷基)-COOH，-(亚烯基)-COOH，-COORa，-(亚烯基)-COORa，-(亚烷基)COORa(其中Ra为烷基，任选取代的苯烷基或杂芳烷基)，-CONR’R”，-(亚烷基)-CONR’R”(其中R’和R”独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代苯烷基，杂芳基和杂芳烷基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-NRC(O)R’(其中R为氢或烷基，R’为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，任选取代的苯烯基，杂芳基，杂芳烯基，杂芳烷基)，-NRSO2R’(其中R为氢或烷基，R’为烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，任选取代的苯烯基，杂芳基，杂芳烯基，杂芳烷基)，或-NRSONR’R(其中R为氢或烷基，R’和R”相互独立，为氢，烷基，烯基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，任选取代的苯烯基，或R’和R”同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)。更具体的术语芳基包括但不限于苯基，1-萘基，2-萘基，四氢萘基，亚甲二氧基苯基，2，3-二氢化茚基，四氢萘基，二氢吲哚基，苯并二氢吡喃基，异苯并二氢吡喃基等。
“杂芳基”指含有一、二或三个选自N、O或S的环杂原子并且其余环原子为碳的5-10个环原子的单价单环或双环芳基。杂芳环任选独立被一个或更多的取代基取代，优选一个或两个取代基，其中取代基选自烷基，卤代烷基，卤素，硝基，氰基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，-OR(其中R为氢，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基或任选取代的苯基烷基)，-NRR’(其中R和R’分别独立为氢，烷基，烯基，卤烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，或任选取代的苯烯基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-C(O)R(其中R为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，任选取代的苯烯基)，-S(O)nR(其中n为0-2的整数，R为氢(条件是n为0)，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，或任选取代的苯基烷基)，-SO2NRR’(其中R和R’分别独立为氢，烷基，烯基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯烷基，或任选取代的苯烯基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-COOH，-(亚烷基)-COOH，-(亚烯基)-COOH，-COORa，-(亚烯基)-COORa，-(亚烷基)COORa(其中Ra为烷基，或任选取代的苯基烷基)，-CONR’R”或-(亚烷基)-CONR’R”(其中R’和R”独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代苯基，任选取代的苯基烷基，或R和R”同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-NRC(O)R’(其中R为氢或烷基，R’为氢，烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，或任选取代的苯烯基)，-NRSO2R’(其中R为氢或烷基，R’为烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，或任选取代的苯基烯基)，-NRSONR’R(其中R为氢或烷基，R’和R”分别独立为氢，烷基，烯基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，任选取代的苯基，任选取代的苯基烷基，或任选取代的苯烯基，或R’和R”同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，或氨基保护基团。更具体的术语杂芳基包括但不限于呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡啶基，嘌呤基，嘧啶基，吡唑基，噻唑基，咪唑基，噻唑基，噻二唑基，吲哚基，氮杂吲哚基，苯并呋喃基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，喹啉基，异喹啉基，苯并三唑基，苯并吡喃基，和它们的衍生物。
“任选取代的苯基”指独立被一个或更多的取代基任选取代的苯环，优选一个或两个取代基，其中取代基选自烷基，卤代烷基，卤素，氰基，硝基，-NRR’(其中R和R’分别独立选自氢或烷基，或R’和R同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，-OR(其中R为氢，烷基或卤烷基)，-COORa(其中R为氢或烷基)，或-CONR’R”(其中R’和R”分别独立选自氢和烷基，或R’和R”同时与氮原子相连，形成环氨基环)。具代表性的例子包括但不限于4-氟苯基，3，4-二溴苯基，4-氯-2，5-二甲基苯基，2，4，5-三氯苯基，4-溴-2-三氟甲氧苯基，2-氯-4-三氟甲基，4-四丁基苯基，4-甲氧苯基，3-硝基苯基等。
“杂环”或“杂环基”指具有3-8个环原子的饱和或不饱和环基，其中一个或两个环原子选自N、O或S(O)n(n为0到2的整数)的杂原子并且其余环原子为碳，其中一个或两个碳原子可以任选被羰基取代。杂环可以任选独立被一个、两个或三个取代基取代，其中取代基选自烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳烷基，卤素，氰基，酰基氨基，氨基，一取代氨基，二取代氨基，-OR(其中R为氢，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，芳基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基)，S(O)nR[其中n为0到2的整数，R为氢(条件是n为0)，烷基，卤代烷基，烯基，环烷基，环烷基烷基，氨基，一取代氨基，二取代氨基，芳基，杂芳基，芳基烷基，或杂芳基烷基]，-COOH，-(亚烷基)-COOH，-COORa，-(亚烷基)-COORa，(其中Ra为烷基，杂烷基，芳基烷基，或杂芳基烷基)，-CONR’R”，-(亚烷基)-CONR’R”(其中R’和R”独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，或一个氨基保护基团。更具体的术语杂芳基包括但不限于四氢吡喃基，哌啶酮，哌嗪酮，吗啉代和硫代吗啉代，硫代吗啉代-1-氧化物，硫代吗啉代-1，1-二氧化物，以及他们的衍生物。
“环氨基”指一个杂环基团，其中至少一个环原子为氮原子。具体的例子包括哌啶，哌嗪，吗啉代，硫代吗啉，硫代吗啉亚砜，硫代吗啉砜。
“杂烷基”指如上所定义的烷基，环烷基，环烷基烷基，带有含有选自-NRaRb、-ORc或-S(O)nRd，其中n为0-2的整数，Ra为氢，烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，或酰基；Rb为氢，烷基，芳基烷基，酰基，-SO2R(其中R为烷基，卤代烷基，氨基，一取代氨基或二取代氨基)，-COOR(其中R为烷基，芳基烷基，或杂芳基烷基)，-CONR’R”，-(亚烷基)CONR’R’(其中R’和R”分别独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基及杂芳基烷基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)；或Ra和Rb同时与其相连的氮原子，形成环氨基环。
Rc为氢，烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，杂芳基，杂芳基烷基，乙酰基，-CONR’R”(其中R’和R”分别独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基及杂芳基烷基，或R和R’同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)。一为氢，烷基，卤代烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，芳基烯基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基烯基，酰基，并另外当n＝0时，-CONR’R”(其中R’和R”分别独立选自氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基及杂芳基烷基，或R’和R”同时与其相连的氮原子，形成环氨基环)，及当n＝2时，NR’R”，其中R和R’与以上刚括号中陈述的内容相同。
杂烷基有代表性的例子包括但不仅限于2-甲氧基乙基，苯甲氧基甲基，硫代苯基-2-基-硫代甲基等。
“环烷基烷基”指基团-RaRb，其中Ra为亚烷基，Rb为如前所述的环烷基，如环丙基甲基，环己基丙基，3-环己烷-2-甲基丙基等。
“芳烷基”指-RaRb，其中Ra为烯基，Rb为如上所定义的芳基，例如苯甲基，苯基乙基，3-(3-氯苯基)-2-甲基苯基等。
“芳烯基”指-RaRb，其中Ra为烯基，Rb为如上所定义的芳基，例如3-苯基-2-丙烯基等。
“杂芳基烷基”指-RaRb，其中Ra为烯基，Rb为如上所定义的杂芳基，例如吡啶-3-基甲基，3-(苯并呋喃-2-基)-丙基等。
“杂芳基烯基”指-RaRb，其中Ra为烯基，Rb为如上所定义的杂芳基，例如3-吡啶-3-基丙烯基-2-基等。
“杂环烷基”指-RaRb，其中Ra为亚烷基，Rb为如上所定义的杂环基，例如四氢吡喃-2-基甲基，4-甲基哌嗪-1-基乙基等。
“烷氧基”，“芳氧基”，“杂芳氧基”，“芳烷基氧基”，或“杂芳基烷基氧基”指-OR，其中R分别为上所定义的烷基，芳基，杂芳基，芳基烷基，或杂芳基烷基，例如甲氧基，苯氧基，吡啶-2-基氧基，苯甲氧基等。
“任选的”或“任选地”指随后描述的事件或情况可以但不是必须发生，该描述包括事件或情况发生的情形与其不发生的情形。例如，“任选被烷基一或二取代的杂环基”指烷基可以但不是必须存在，该描述包括杂环基被烷基一或二取代的情况，和杂环基不被烷基取代的情况。
术语“保护基团”指一组原子，当以分子遮盖物形式连接到一个活性基团上，减少或阻止反应活性。这些保护基团可在T.W.Greene和P.G.Futs，有机化学保护基团(Wiley，第二版，1991)，以及Harrison和Harrison等，有机合成方法概述，1-8卷(John Wiley and Sons.1971-1996)中查到。具代表性的氨基保护基团包括甲酰基，乙酰基，三氟乙酰基，苯甲酰基，苯甲基，苯甲氧基羰基(CBZ)，叔-丁氧基羰基(Boc)，三甲基甲硅烷基(TMS)，2-三甲基甲硅烷基-乙磺酰基(SES)，三苯甲基和取代的三苯甲基，烯苯氧基羰基，9-芴甲氧基羰基(FMOC)，硝基-3，4二甲氧苯甲基氧基羰基(NVOC)等。具代表性的羟基保护基可将羟基乙酰化或烷基化，例如苯甲基和三苯甲基醚及烷基醚，四氢吡喃醚，三烷基硅烷基醚和烯丙基醚。
术语“可被保护的羟氨基衍生物”指改性的羟氨基，其中氮和/或羟基可被保护，例如氮可被选择性的单酰基化。
具有相同的分子式、但其原子结合的性质或顺序、或其原子空间排列不同的化合物被定义为“异构体”。其原子空间排列不同的异构体被定义为“立体异构体”。
不互为镜像的立体异构体被定义为“非对映异构体”，互为非可叠加的镜像的立体异构体被定义为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心，例如碳原子被四个不同的基团结合，可成为一对对映异构体。对映异构体的特征在于其不对称中心的绝对构型，其被描述为Cahn和Prelog的R-和S-顺序规则，或者特征在于分子旋转偏振光平面的方式，其被定义为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可以以单独的对映异构体存在，或以它们的混合物形式存在。含有对映异构体相等比例的混合物被称为“外消旋混合物”。
本发明的化合物可以具有一个或更多的不对称中心；因此这些化合物可以作为单独的(R)-或(S)-立体异构体或作为它们的混合物制备。例如式(I)化合物中的R1和R2取代基不同，那么它连接的碳原子为不对称中心，因此，式(I)化合物可以以(R)-或(S)-立体异构体形式存在。除非另有说明，在说明书和权利要求书中具体化合物的描述和命名包括单独的对映异构体和混合物，外消旋体或其它们的混合物。立体化学的测定和立体异构体的分离方法为本领域公知技术(参见J.March，John Wiley和Sons的“高级有机化学”(第4版)第4章的讨论，纽约，1992)。
“药物可接受的赋型剂”指用于制备药物组合物的赋型剂，即通常为安全、无毒，不在生理、或其它方面引起不必要的作用，包括兽用药及人用药可接受的赋型剂。用于本说明书和权利要求书的“药物可接受的赋型剂”包括一种和超过一种的这些赋型剂。
化合物的“药物可接受的盐”指药物可接受的并具有母体化合物所需药理活性的盐。这些盐包括(1)酸加成盐，与无机酸形成的盐，无机酸例如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或与有机酸形成的盐，有机酸例如乙酸，丙酸，己酸，环戊丙酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，丁二酸，羟基丁二酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，安息香酸，3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1，2-乙烷-二磺酸，2-羟基乙烷磺酸，苯磺酸，4-氯苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲苯亚磺酸，樟脑磺酸，4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4，4’-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，十二烷醇硫酸，葡萄糖酸，谷氨酸，羟萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，已二烯二酸等；或(2)当母体化合物中存在酸质子时可形成盐，其或被金属离子取代，例如碱金属离子、碱土碱金属离子或铝离子；或与有机碱配位，如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨基丁三醇(tromethamine)，N-甲基葡糖胺等。
“前体药物”指当这些前体药物给药哺乳动物受试者，在体内能释放按照式(I)的活性母体药物的化合物。式(I)化合物的前体药物的制备是通过以某种方式修饰式(I)化合物存在的官能团，以使该修饰在体内断裂，释放母体化合物。前体药物包括式(I)化合物的羟基、氨基或巯基结合到任何基团上的式(I)化合物，其在体内断裂，重新分别生成游离羟基、氨基或巯基。前体药物的例子包括但不限于式(I)化合物中羟基官能团的酯(例如乙酸酯，甲酸酯，苯甲酸酯衍生物)，氨基甲酸酯(例如N，N-二甲基氨基羰基)等。
疾病的“治疗”包括(1)预防疾病，即哺乳动物中未发展到引起疾病的临床症状，疾病可以被暴露或预先处理，但还没出现或显示出疾病的症状，(2)抑制阻止或减少疾病或其临床症状的发展，或(3)减轻疾病，即使疾病或其临床症状减弱。
“治疗有效量”指当给哺乳动物治疗疾病给药的化合物的量，足以有效治疗疾病。该“治疗有效量”会根据化合物、疾病及其严重程度、治疗哺乳动物的年龄、体重等而改变。
本发明的化合物引用的氨基酸组成可按照肽领域传统命名法则命名。
例如一个二肽，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H，R2为4-噻唑甲基，R5为(S，S)-1-甲基丙基，ZR7为苯甲氧基羰基，可命名为CBz-Ile-4-Taz-NHOH。关于后述的合成方案A和B，4-Taz(4-噻唑丙氨酸)表示AA1，Ile表示AA2。
一个三肽，n＝1，m＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝R9＝H，R2为4-噻唑甲基，R5为(S，S)-1-甲基丙基，ZR7为4-氯苯甲酰基，R10为4-氟苯甲基，被命名为4-氯苯甲酰基-(4-氟苯甲基)Gly-Ile-Taz-NHOH.关于后述的合成方案A和B，4-Taz(4-噻唑丙氨酸)表示AA1，Ile表示AA2，(4-氟苯甲基)Gly表示AA3本发明最广的限定在本发明第一方面给出，优选某些式(I)的化合物。
化合物的一类为二肽异羟肟酸，相应的式(I)为n＝0。另外一类为三肽异羟肟酸，相应的式(I)为n＝1，对于本发明的二肽和三肽异羟肟酸，尤其首选R2为杂芳烷基，尤其为4-噻唑甲基，R5为(S，S)-1-甲基丙基。R2，R5和R9优选氨基酸的天然构象，例如(L)氨基酸。
式(I)的另一类首选化合物为Z为C(O)O。另一类首选化合物为Z为S(O)2。每一类化合物首选R7为烷基，芳基烷基，或杂烷基，尤其为卤代苯基(例如3，4-二溴苯基，2，5-二氯苯基，2，4，5-三氯苯基)，苄基(任选被取代)(例如苄基或3，4-二氯苄基)，或卤代噻吩基(例如4，5-二溴mothien-2-基)。当Z为C＝O，也首选R7为芳基烷基或杂烷基，尤其为被卤代(优选一个或两个氯)的苄基或杂芳基甲基。
另一类首选化合物为R2为芳基烷基或杂芳基烷基，在这一类中更优选R2为3-吲哚基甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑基甲基或4-噻唑基甲基，尤其为4-噻唑基甲基。
另一类首选化合物为R2为(亚烷基)-B-X，其中B为-O-，NR8-，-S-，-C＝O，-CONR8-，NR8SO2或C(＝NR8)NR8SO2(其中R8独立为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基杂芳基或杂芳基烷基。尤其优选的化合物为亚烷基为亚甲基，B为-NR8CO2，X为芳基烷基。
第四类优选化合物为R5为烷基或苯基，尤其为丙基，1-甲基乙基，或(S，S)-1-甲基丙基。在这一组化合物中尤其优选R1和R4为氢，并且R2为杂芳基烷基，尤其为4-噻唑基甲基。
进一步首选的化合物为基团B，即本发明第一方面定义的式(I)，其中n＝0，或(1)化合物B，其中R3和R6为氢。
(2)化合物(1)，其中R2为芳基烷基或杂芳基烷基。
(3)化合物(2)，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2。
(4)化合物(3)，其中R2任选被苄基或杂芳基烷基取代。
(5)化合物(4)，其中R2为4-叔-丁氧基苯基，3-氯苄基，3-吲哚甲基，2-噻吩甲基，4-咪唑基甲基，4-噻唑基甲基。
(6)化合物(5)，其中R2为4-噻唑基甲基。
(7)化合物(6)，其中R7为芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基。
(8)化合物(6)，其中Z为-C(O)O-，R7为任选取代的苄基。
(9)化合物(7)，其中Z为-S(O)2-，R7为芳基或杂芳基。
(10)化合物(8)或(9)，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
(11)化合物(10)，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
(12)化合物(11)，其中R2为(亚烷基)-B-X，其中B为-O-，NR8，-S(O)n-(其中n为0，1或2)，-C＝O，-CONR8-，-NR8CO2，-NR8SO2-，或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基或杂芳烷基。
(13)化合物(12)，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
(14)化合物(13)，其中R2为-CH2-B-X，B为-NHCO2-，X为苄基。
(15)化合物(14)，其中R7为芳基或芳基烷基。
(16)化合物(15)，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
(17)化合物(16)，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
进一步首选的化合物为基团C的那些，即本发明第一方面定义的式(I)，其中n＝1。
(1)化合物C，其中m为0，R3和R6为氢。
(2)化合物(1)，其中R2为芳基烷基或杂芳基烷基。
(3)化合物(2)，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2。
(4)化合物(3)，其中R2任选取代的苄基或杂芳基烷基。
(5)化合物(4)，其中R2为4-叔-丁氧基苄基，3-氯代苄基，3-吲哚甲基，2-噻吩甲基，4-咪唑基甲基，或4-噻唑基甲基。
(6)化合物(5)，其中R2为4-噻唑基甲基。
(7)化合物(6)，其中R7为芳基，芳基烷基，杂芳基，杂芳基烷基。
(8)化合物(7)，其中Z为-C(O)O-，R7为任选取代的苄基。
(9)化合物(7)，其中Z为-S(O)2-，R7为芳基或杂芳基。
(10)化合物(8)或(9)，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
(11)化合物(10)，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
(12)化合物(11)，其中R2为(亚烷基)-B-X，其中B为-O-，NR8-，S(O)n-(其中n为0，1或2)，-C＝O，-CONR8-，-NR8CO2-，-NR8SO2-或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳基烷基，杂芳基或杂芳烷基。
(13)化合物(12)，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
(14)化合物(13)，其中R2为-CH2-B-X，B为-NHCO2-，X为苄基。
(15)化合物(14)，其中R7为芳基或芳基烷基。
(16)化合物(15)，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
(17)化合物(16)，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
本发明已制备的具代表性的化合物如下I.式(I)中二肽异羟肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和ZR7为苯甲氧基羰基和其他基团详细限定如下表I
St*-连接R2碳的立体化学和R2的取代(如果有独立的手性中心)St**-连接R5碳的立体化学和R5的取代(如果有独立的手性中心)II，式(I)中二肽异羟肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R4为(S，S)-1-甲基丙基和其他基团详细限定如下表II
St*-连接R2碳的立体化学III式(I)中二肽异羟肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R6＝H和ZR7为苯甲氧基羰基和其他基团详细说明如下表III
St*-连接R5碳的立体化学IV式(I)中二肽异羟肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝H，R2为(S)-3-吲哚甲基，和ZR7为苯甲氧基羰基和其他基团详细说明如下表IV
St*-连接R5碳的立体化学V式(I)中三肽异羟肟酸化合物，其中n＝0，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R2为(S)4-噻唑甲基，R5为(S，S)-1-甲基丙基和其他基团详细说明如下
St*-连接R9碳的立体化学和R9的取代基(如果有独立的手性中心)VI本发明的各种三肽异羟肟酸化合物，其中n＝1，m＝1，R1＝R3＝R4＝R6＝H和R2为(S)4-噻唑甲基，R5为(S，S)-1-甲基丙基，以及其他基团详细说明如下表VI
其它R2和R3形成亚烷基或杂亚烷基链的各种化合物包括CBz-Ile-Pro-NHOH(m/e＝378)和CBz-Ile-Thz-NHOH(m/e＝396)。Thz为4-噻唑烷-羧基。
其它R5和R6形成亚烷基链的各种化合物包括CBz-Pro-Trp-NHOH(m/e＝451)。
本发明的化合物由几种合成方法制得，将在如下叙述。
用于制备这些化合物的起始材料和试剂或者可由供应商提供，AldrichChemica]Co.，(Milwaukee，Wisconsin，USA)，Bachem(Torrance，California，USA)，Emka-Chemie，或Sigma(St.Louis，Missouri，USA)，或者通过本领域技术人员公知方法制备，参考书籍中提出下列方法，如Fieser和Fieser的有机合成试剂，1-15卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd的碳化合物化学，1-5卷及附录(Elsevier Science Publishers；1989)，有机反应，1-40卷(JohnWiley and Sons，1991)，March的高级有机化学，(John Wiley and Sons，第四版)，和Larock的综合有机转化(VCH Publishers Inc.，1989)。尤其，以各种被保护形式存在的天然氨基酸或非天然氨基酸由特殊化学商提供，例如NovabiochemInc.(La Jolla，CA)，Advanced Chemtech Inc.(Louisville，KY)，Svnthetech Inc.(Albany，OR)，Bachem Inc.(Torrance，15 CA)。这些方案仅仅举例说明了本发明合成的化合物的一些方法，本领域技术人员对这些方案可进行各种修改。
如果需要，起始材料和反应中间产物可以应用常规技术进行分离和纯化，包括但不限于过滤、蒸馏、结晶和色谱等。
本发明的化合物为的天然和非天然的二肽和三肽的C末端异羟肟酸衍生物，在N末端进一步功能化。它们由起始的肽前体制得并进一步去保护(如有必要)形成有功能的N末端和C末端。肽前体是由本领域技术人员公知方法制得，包括液相化学和固相合成，见E.Atherton和R.C.Sheppard的固相肽合成实践方法(Oxford University Press，1989)。
总之，如方案A和B中所述，一个C末端保护的氨基酸P1-AA1与一个N末端保护的氨基酸P2-AA2偶合产生P1-AA1-P2-AA2。偶合是通过活化P2-AA2的C末端浓缩P1-AA1的N末端而完成。活化试剂和偶合条件为本领域技术人员公知的那些，包括碳化二亚胺调节的偶合，或其后通过乙酰化N-羟基丁二酰亚胺酯形成及其后的。为合成二肽异羟肟酸，典型通过羟胺处理，除去保护基团和用R7-Z-L使N末端具有功能(以任一顺序)，得到二肽前体，其进一步转化为本发明的异羟肟酸化合物。为合成三肽异羟肟酸，化合物P1-AA1-AA2-P2N被选择性的N去保护，形成P1-AA1-AA2，然后其偶合到N保护的氨基酸AA3-P3。去保护、N末端功能化和羟胺处理如方案B中所阐明，然后得到式(I)的三肽异羟肟酸。
方案A二肽异羟肟酸合成路线 式I.其中n＝0方案B三肽异羟肟酸合成路线 参考式I的命名，AA2对应于-C(＝O)-CR1R2-NR3-，AA2对应于-C(＝O)-CR4R5-NR6-，AA3对应于-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)mNR10.P1、P2、P3代表保护基团。
具体地，本发明的化合物由固相合成制得。最初，N保护的氨基酸P1-AA2通过它的C末端连接到树脂上。典型的固相合成树脂包括氯甲基化和羟甲基化的树脂，例如4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基树脂(Pam树脂)，和4-苯甲氧基苯甲基乙醇树脂(Wang树脂)购自Advanced Chemtech，Louisville，Kentucky，U.S.A.Pegylated聚乙烯树脂，Argogel-OhTM，树脂购自Argonaut echnologies Inc.(Belmont，CA)。优选的氯甲基树脂包括苯乙烯/二乙烯苯树脂，如Merrifield树脂购自Aldrich Chemical Company，Milawaukee，Wisconsin，U.S.A。
氨基酸结构单元、AA2和AA3应用本领域技术人员公知的重复偶合和去保护步骤有顺序的连接。偶合反应在常规的二肽偶合条件下进行，典型在无水、惰性、质子惰性极性溶剂中(如二甲基甲酰氨，乙酰腈，四氢呋喃，二氯甲烷)中进行，应用辅助偶合试剂，如碳化二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)，二异丙基碳化二亚胺(DIC)，二咪唑如羰基二咪唑，三唑如羟基苯并三唑(HOBT)，或其它羧基活性基团，例如N-羟基丁二酰亚胺，连三个碳原子的有机碱，例如4-二甲基氨基吡啶，N-甲基吗啉或三乙基氨基。
采用的保护基团取决于被保护基团，为本领域技术人员公知的那些，有代表性的保护基团可在有机化学保护基团，J.F.W.McOmie(London，Plenum Press，(1973))、和有机化学保护基团，T.W.Greene and P.G.Wuts(John Wiley and Sons，(1991))中查得。一种优选的N保护基团是芴基甲氧羰基(FMOC)。
装配好完整的肽骨架后，除去N末端的保护基团。在某些情况下，N末端保护基团可以对应于ZR7，消除对去除保护基团的需要。N末端的功能化通过后来的用R7-Z-L处理而实现，其中L为在亲核取代条件下的离去基团。去除保护基团的条件因保护基团的不同而不同。酸敏感的保护基团例如叔-丁氧基羰基(t-BOC)在温和的酸环境下被去除(例如三氟乙酸)，而碱敏感保护基团例如9-芴基甲氧羰基在温和的碱环境下被去除。典型的离去基团L包括卤素，甲苯磺酰盐，甲磺酰盐。
最后的固相断裂通过羟氨处理而完成，产生式I的化合物。
如前所述，天然和非天然的氨基酸均可用于制备本发明化合物。天然氨基酸和它们的缩写形式已众所周知，此处不在重复。一些非天然氨基酸及其缩写包括高丝氨酸(hSer)，高丝氨酸内酯(hSerlac)，高半胱氨酸(Hcy)，高精氨酸(hArg)，高瓜氨酸(Hci)，青霉胺(Pen)，Ná-甲基精氨酸(N-MeArg)，正亮氨酸(Nle)，正缬氨酸(Nval)，正异亮氨酸(NIle)，N-甲基异亮氨酸(NMeIle)，苯基甘氨酸(PhG)，t-丁基甘氨酸(Tle)，羟哺氨酸(Hyp)，3，4-去氢羟哺氨酸(Δ-Pro)，焦谷氨酸(Pyr，Glp)，鸟氨酸(Orn)，2，3-二氨丙酸(2，3-DAP)，1-氨基异丁酸(1-Aib)，2-氨基异丁酸(2-Aib)，2-氨基丁酸(2-Abu)，4-氨基丁酸(4-Abu)，2，4-二氨基丁酸(A2bu)，α-氨基辛二酸(Asu)，albizzin(Abz)，-环己丙氨酸(Cha)，3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)，瓜氨酸(Cit)，2-哌啶酸(Pip)，4-氯苯基丙氨酸(4-GlPhe)，4-氟苯基丙氨酸(4-FPhe)，肌氨酸(Sar)，4-噻唑丙氨酸(4-Taz)，高苯基丙氨酸(Hpa或hPhe)，2-噻吩丙氨酸(2-Thi)，3-苯并噻吩丙氨酸(3-Bal)，和1-氨基丙烷羧酸(1-NCPC).各种非天然氨基酸可由供应商提供。
本发明的化合物用于治疗过量间质胶原沉积的疾病，例如纤维增生疾病如间质非纤维变性，外周中枢纤维化、Symmers’纤维变性、外周肌肉纤维变性，肾纤维变性，心内膜硬化、肝炎、急性呼吸窘迫综合症、关节炎、膀胱纤维变性、外科手术粘连、腱外科、角膜结疤、硬皮病、慢性同种移植排斥反应、血液透析分流纤维变性和再狭窄。
本发明的化合物原胶原C端蛋白酶抑制剂，从而抑制可形成胶原纤维的胶原型I、II、III的C-末端处理。而且，本发明选择的化合物选择性抑制原胶原C端蛋白酶超过其它降解酶如胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3。因此，本发明的化合物主要留下由胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3介导的胶原的天然再吸收。由于这种选择性，这些化合物的疗效大于非选择性的化合物。尤其，本发明优选的化合物抑制原胶原C端蛋白酶的选择性优于胶原酶-1和胶原酶-2一百倍，选择性更强的化合物超过一千倍。对原胶原C端蛋白酶超过胶原酶-1和胶原酶-2的选择性抑制在实施例中描述的检测法中说明。因此本发明允许病人服用一剂，其选择性抑制原胶原C端蛋白酶超过胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3，而治疗纤维变性疾病。这种抑制的选择性超过10倍，优选超过100倍，最优选超过1000倍。
式I中化合物抑制原胶原C端蛋白酶的活性的能力，可以通过本领域普通技术人员公知的体外检测方法加以说明，如在实施例XIII中更详细描述的检测方法。对胶原酶的选择性抑制可以通过实施例XIV中描述的试验方法测定。
式I中化合物治疗纤维变性和胶原过量产生和沉积的体内疗效可用多种动物模型说明，这些动物模型包括博来霉素诱导的肺纤维化模型(S.H.Phan等“博来霉素诱导的肺纤维化”，Am.Rev.Respir.Dis.，124428-434(1981)，和P.F.Piguet等“Effective Treatment ofthe PulmonaryFibrosis Elicited in Mice by Bleomycin or Silica with anti-CD-1l Antibodies”，Am.Rev.Resp.Dis.，147435-441(1993))，海绵体植入(sponge implant)模型(E.N.Unemori等“Human Reiaxin Decreases Collagen Accumulation In Vivoin Two Rodent Models of Fibrosis，”J.Invest.Dermatol.，101280-285(1993)，四氯化碳或NDMU诱导的肾纤维化模型，以及在WO97/05865中提到的其它动物模型(“用于治疗与胶原过量相关疾病的C端蛋白酶抑制剂”)。
通常，本发明的化合物可以以产生类似的效用药物的任何可接受的服用方式给予治疗有效量。本发明化合物的实际剂量，即活性成分，取决于许多因素，如治疗疾病的严重性，受试者的年龄和健康程度，使用化合物的效果强度，给药途径和类型等以及其它因素。药物可服用一天一次以上，优选一天一次或两次。
式I中化合物的治疗有效量在大约在每天每公斤体重0.05-35mg之间；优选大约0.3-20mg/kg/day.这样，一个70Kg的人，优选剂量范围大约是21mg到1.4g每天。
通常，本发明的化合物以制剂组成方式按如下任一途径给药口服，全身的(systemic，如透皮、鼻、肺、或通过栓剂)，或非肠道给药(例如肌肉注射、静脉给药或皮下给药)。优选的给药方式是应用常规的每日剂量方案全身性的给药，其剂量可以根据疾病的严重程度调节。
典型的通过鼻给药是用适于雾化或有气雾推进物的干燥的粉剂、溶液或混悬剂或者应用适于用于测量剂量的吸入器。另一种方法，药物与微滴结合，这些微滴由材料如凝胶、右旋糖苷、胶原质或白蛋白制成。微滴可方便地以冷冻干燥的方式，用鼻吸入器或压缩的气雾器。渗透吸收增强剂例如亲脂性的类固醇也可作为添加剂，以增强药物进入组织。
有效的服用方式可通过肺或呼吸道传递，因为多肽可直接通过哺乳动物肺泡细胞吸收。有利地，这种服用方式常常并不需要渗透吸收增强剂。肺传递进入肺深层的给药方法和设备在美国专利第5780014和5814607中有描述。
最后，化合物可通过透皮吸收而达到全身作用，包括将药物放在肌肤表面，使它通过皮肤渗透。透皮吸收设备是采用一种结构，例如黏着片或类似物，作为药物的贮藏库，使药物扩散与肌肤接触。一般类型，这种结构是三维稳定基质称为单片基质。这种基质在美国专利5804214、5149538和4956171中有详细说明，这种基质是由丙烯酸橡胶，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯和乙烯醋酸纤维的聚合体和共聚体组成。
剂型的选择根据多种因素如药物的给药方式(例如对于口服剂型，片剂，丸剂或胶囊被优选)和药物的生物利用度。最近，已开发出药物制剂特别用于生物利用度差的药物，它是根据通过增加表面积即减少粒径可以增加生物利用度的原则。例如，美国专利号4,107,288描述了粒径范围在10-1,000nm的药物制剂，其中活性物质被支持到高分子的交联基质上。美国专利号5,145,684描述了一种药物制剂，其中药物在表面改性剂存在下被研磨成毫微颗粒(平均粒径400nm)，然后分散到液体介质中，得到表现出具有相当高的生物利用度的药物剂型。
该组合物通常由式(I)化合物组合以至少一种药物可接受的赋型剂组成。可接受的赋型剂为非毒性、辅助给药、不反向影响式(I)化合物的治疗效果。这些赋型剂可以是任何固体、液体、半固体，或者当为气溶胶组合物时，气体赋型剂是本领域技术人员常规获得的那些。
固体药物赋型剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、白明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸盐、氯化钠、干脱脂乳等。液体和半固体赋型剂可以选自甘油、丙二醇、水、和多种油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选的液体载体，特别是用于注射溶液的液体载体包括水、盐水、葡萄糖溶液和丙二醇等。
压缩气体可以在气溶胶剂型中用于分散本发明的化合物。适合用于该目的的惰性气体为氮气、二氧化碳等。
其它适合的药物赋型剂和它们的剂型在Remington’s PharmaceuticalSciences中描述，由E.W.Martin编辑(Mack Publishing Company，第18版，1990)。
制剂中化合物的量可以在本领域技术人员通常使用的范围内改变。通常，该制剂含有，根据重量百分比0.01-99.99重量％的式(I)化合物(基于制剂总重量)，其余用适当的药物赋型剂补足。优选地，该化合物存在量为1-80wt％。含有式(I)化合物的有代表性的制剂在实施例30中描述。
实施例ICBz-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中ZR7为苯甲氧羰基)1.BOC-AA1和FMOC-AA1于空的带活塞的固相提取瓶中加入ArgoGel-OHTM(ArgonautTechnologies，Belmont，CA)，加入3当量BOC或者FMOC保护的AA1，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。[或者，向树脂中加入3当量BOC或FMOC保护AA1，3当量HATU和6当量DIPEA。加入足量的NMP使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)]。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，干燥得到BOC-AA1或FMOC-AA1树脂。未反应的树脂位点以Ac2O遮盖(capping)溶液遮盖，(19mL Ac2O，9mL DIPEA，0.8gr HOBt，400mL NMP)，向树脂(～12.5ml/gr树脂)中加入足够量，使树脂膨胀。树脂如上过滤和清洗。2.H2N-AA1-树脂2a.BOC保护材料由上得到的树脂(BOC-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/TIS处理两小时。反应液抽滤，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA1-树脂。
2b.FMOC保护材料-由上得到的树脂(FMOC-AA1-树脂)先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF处理20分钟。反应液抽滤，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA1-树脂。3.CRz-AA2-AA1-树脂向H2N-AA1-树脂中加入3当量CBZ保护的AA2，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液，加入充分的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。[或者，向树脂中加入3当量BOC或FMOC保护AA1，3当量HATU和6当量DIPEA。加入足量的NMP使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)]。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-AA2-AA1-树脂。4.保护基团的去除如果AA1或AA2含有一个要去除的酸不稳定的侧链保护基团，上述得到的树脂(CBz-AA2-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)处理两小时。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.CBz-AA2-AA1-NHOHCBz-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到CBz-AA2-AA1-NHOH。
实施例IIR7-SO2-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中Z为-SO2-)1.FMOC-AA2-AA1-树脂于HN2-AA1-树脂中加入3当量FMOC保护的AA2，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到FMOC-AA2-AA1-树脂。2.H2N-AA2-AA1-树脂FMOC-AA2-AA1-树脂先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF溶液处理20min。反应液抽滤，用用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA2-AA1-树脂。3.R7-SO2-AA2-AA1-树脂H2N-AA2-AA1-树脂先用3二氧杂环己烷水溶液洗，然后加入10当量的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧杂环己烷使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入20当量二异丙基碳化二亚胺。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2C12洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，产生R7-SO2-AA2-AA1-树脂。4.R7-SO2-AA2-AA1-NHOHR7-SO2-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到R7-SO2-AA2-AA1-NHOH。
实施例IIIR7-NHCO-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中Z为-NHCO-)1.R7-NHCO-AA2-AA1-树脂NH2-AA2-AA1-树脂先用THF洗，加入一定量的异氰酸酯，R7N＝C＝O。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7-NHCO-AA2-AA1-树脂。2.保护基团的去除如果AA1或AA2含有一个要去除的酸不稳定的侧链保护基团，上述得到的树脂(R7-NHCO-AA2-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)处理两小时。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。3.R7-NHCO-AA2-AA1-NHOHR7-NHCO-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入25当量50％NH2OH水溶液在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到R7-NHCO-AA2-AA1-NHOH。
表II和表V中的二肽异羟肟酸(其中Z为-CONH-)用实施例III中的步骤制备。
实施例VICBz-NR6-CH2CO-AA1-NHOH的一般实验1.BrCH2CO-AA1-树脂向H2N-AA1-树脂中加入12当量溴乙酸，13当量二异丙基碳化二亚胺。加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行并旋转2小时。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用DMSO洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到BrCH2CO-AA1-树脂。2.R6-NHCH2CO-AA1-树脂BrCH2CO-AA1-树脂先用DMSO洗。加入足量的DMSO使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入所需的40当量伯胺，NR6NH2。反应在旋转仪中进行并旋转2小时。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R6-NHCH2CO-AA1-树脂。3.CBz-NR6-CH2CO-AA1-树脂向R6-NHCH2CO-AA1-树脂中加入3当量CBZOSu，3当量Et3N和0.05当量的0.116M 4-二甲基氨基吡啶的THF溶液。加入足量的CH2Cl2使树脂(～12.5mL/gr的树脂)膨胀。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-NR6-CH2CO-AA1-树脂。4.保护基团的去除如果AA1或AA2含有一个要去除的酸不稳定的侧链保护基团，上述得到的树脂(CBz-NR6-CH2CO-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)处理两小时。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.CBz-NR6-CH2CO-AA-NHOHCBz-NR6-CH3CO-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到CBz-NR6-CH2CO-AA1-NHOH。
实施例VIIR7NHCO-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中Z为-C(O)NH-)1.向ArOCO-AA2-AA1-树脂(Ar＝Ph)中加入足量的DMF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。加入20当量R7NH2，反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-AA2-AA1-树脂。2.R7NHCO-AA2-AA1-树脂先用THF洗，加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到R7NHCO-AA2-AA1-NHOH。
实施例VIIICBz-AA3-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中n＝1，ZR7为苯甲氧羰基)1.CBz-AA2-AA2-AA1-树脂向H2N-AA2-AA1-树脂中加入3当量CBZ保护的AA3，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量的0.116M二甲氨基吡啶的THF溶液。加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。[或者，向树脂中加入3当量CBz保护AA3，3当量HATU，3当量HOAt和6当量DIPEA。加入足量的NMP使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)]。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到CBz-AA2-AA1-树脂。2.保护基团的去除如果AA1、AA2或AA3含有一个要去除的酸不稳定的侧链保护基团，上述得到的树脂(CBz-AA3-AA2-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)处理两小时。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。3.CBz-AA3-AA2-AA1-NHOHCBz-AA3-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到CBz-AA3-AA2-AA1-NHOH。
实施例IXR7Z-AA3-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中Z为-SO2-或-C(O)NH-)1.FMOC-AA3-AA2-AA1-树脂于HN2-AA2-AA1-树脂中加入3当量FMOC保护的AA3，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量0.116M 4-二甲氨基吡啶的THF溶液中，加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。[或者，向树脂中加入3当量FMOC保护的AA3，3当量HATU，3当量HOAt和6当量DIPEA。加入足量的NMP使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)]。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到FMOC-AA3-AA2-AA1-树脂。2.H2N-AA3-AA2-AA1-树脂FMOC-AA3-AA2-AA1-树脂先用DMF洗，然后用含20％哌啶的DMF溶液处理20分钟。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到H2N-AA3-AA2-AAl-树脂。3.R7Z-AA3-AA2-AA1-树脂3a.Z＝SO2∶H2N-AA3-AA2-AA1-树脂先用3二氧杂环己烷水溶液洗，然后加入10当量所需的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧杂环己烷水溶液使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入20当量二异丙基乙基胺。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，产生R7SO2-AA3-AA2-AA1-树脂。
3b.Z＝NHCO∶H2N-AA3-AA2-AA1-树脂先用THF洗然后用一定量3当量的异氰酸盐，R7N＝C＝O，加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行反应并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-AA3-AA2-AA1-树脂。4.R7Z-AA3-AA2-AA1-NHOHR7Z-AA3-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液在Speed Vac上浓缩，得到R7Z-AA3-AA2-AA1-NHOH。
实施例XR7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOH的一般实验(式I中二肽化合物，其中n＝1，m＝0，R9为H(A为C(O)CH2NR10)，Z为单键，-SO2，-C＝O，或-C(O)NH-)1.BrCH2CO-AA2-AA1-树脂向H2N-AA2-AA1-树脂中加入12当量溴乙酸，12当量二异丙基碳化二亚胺。加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行并旋转2小时。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用DMSO洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到BrCH2CO-AA2-AA1-树脂。2.R10NHCH2CO-AA2-AA1-树脂BrCH2CO-AA2-AA1-树脂先用DMSO洗。加入足量的DMSO使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入40当量所需的胺，NR10NH2或R7R10NH。反应在旋转仪中进行并旋转过夜.反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R10NHCH2CO-AA2-AA1-树脂。(如果用R7R10NH，相应于Z为单键，直接到步骤4。)3.R7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-树脂3a.Z＝SO2∶R10NHCH2CO-AA2-AA1-树脂先用二氧杂环己烷水溶液洗，然后加入10当量的磺酰氯，R7-SO2Cl。加入足量的90％二氧杂环己烷水溶液使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。然后加入20当量二异丙基乙胺。反应在旋转仪中进行并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，产生R7SO2NR10CH2CO-AA2-AA1-树脂。3b.Z＝-CO-∶向R10NHCH2CO-AA2-AA1-树脂中加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。3当量所需的氯酸，R7COCl和3当量Et3N[第一种选择性的方法是向树脂中加入足量的CH2Cl2使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入3当量所需的羧酸，R7COOH，3当量二异丙基碳化二亚胺和0.05当量的0.116M二甲基氨基吡啶的THF溶液。第二种选择性的方法是向树脂中加入3当量所需的羧酸，R7COOH，3当量HATU，3当量HOAt和6当量DIPEA，然后是足量的NMP使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)]反应在旋转仪中进行反应并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1 HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7CO-NR10CH2-AA3-AA2-AA1-树脂。3c.Z＝-CONH-∶R10NHCH2CO-AA2-AA1-树脂先用THF洗，然后用3当量所需的异氰酸盐，R7N＝C＝O，加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)。反应在旋转仪中进行反应并旋转过夜。反应物抽滤，用CH2Cl2洗三遍，用MeOH洗三遍，用1∶1HOAc/CH2Cl2洗一遍，用MeOH洗三遍，最后用CH2Cl2洗三遍，得到R7NHCO-NR10CH2-AA2-AA1-树脂。4.保护基团的去除如果AA1或AA2含有一个要去除的酸不稳定的侧链保护基团，上述得到的树脂(R7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-树脂)用95/2.5/2.5的TFA/H2O/三异丙基硅烷(TIS)处理两小时。反应液抽滤，用CH2Cl2洗三遍，MeOH洗三遍，再用CH2Cl2洗三遍。5.R7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOHR7Z-NR10CH2CO-AA2-AA1-树脂先用THF洗。加入足量的THF使树脂膨胀(～12.5ml/gr树脂)，然后加入25当量50％NH2OH水溶液，在旋转仪中进行反应并旋转两天。反应物抽滤，用CH2Cl2、MeOH、再用CH2Cl2洗，滤液真空浓缩，得到R7Z-NR10C(O)CH2-AA2-AA1-NHOH。*注明在所有情况，所有固体试剂在溶剂后加。如果试剂不是固体，溶剂在液体试剂后加。对于待需去除的侧链的AA2或AA1这种情况在NH2OH断裂前进行。典型的待需去除的侧链的氨基酸有Glu(OtBu)，His(Boc)和Ser(OtBu)。
实施例XI原胶原C-蛋白酶的分离和制备人PCP的克隆和HT-1080载体的构建人原胶原C-蛋白酶(PCP，也被认为是骨形态发生蛋白或BMP-1)是由人成纤维细胞cDNA库克隆而来(Stratagene，San Diego，CA)。克隆是基于报道的核苷酸序列通过PCR进行的。(Wozney，J.M.，Rosen，V.，Celeste，A.J.，Mitsock，L.M.，Whitters，M.J.，Kriz，R.W.，Hewick，R.M.，和Warig，E.A.(1989)direct GenBank submission accession M22488，locus HUMBMP1)应用Taq聚合酶，5’引物GCGCGCGGTACCCGCCCCGCCAGCATGCCCGGCGTGGCCCGCCTGCCGCTGCTGCTCGGGCTGCTGCTGCTCCCGCGTCCCGGCCGGCCGCTGGACTFGGCCGACTACACCTATGACCTGGC(SEQ ID NO1)(OligoTherapeutics，Inc.，Wilsonville，OR)，以及3’反向链引物CCGCTCGAGCCTCACTGGGGGGTCCGGTTTCTTTTCTGCACTCGGAATTTGAGCTGGTG(SEQ D NO2)(Gibco)产生完整全长核苷酸编码的信号序列、前肽、催化结构域和所有的C-末端结构域形成天然翻译终止位点。PCR产物由凝胶电泳采用Wizard DNA纯化试剂盒纯化，通过TA克隆法直接与哺乳动物表达载体pCR3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)连接。连接产物用于应用热休克法转化E coli菌系TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，转化体用纯化的质粒的限制性内切酶酶分析法选择，应用的限制性内切酶为HindIII和BamHI。对PCP插入检测为阳性的转化体采用Perkin-Elmer/ABI系统进行序列分析。两种克隆被选择，组合，编码与Wozney等预言一样的完整氨基酸序列。两种克隆采用酶Bbr I进行限制性重组，在自然发生的内部位点断裂，和EcoRV，在插入体和载体连接处断裂。被切除的片段重新连接到EcoRV-处理的pCR3.1。最终构建物含有与Wozney等报道一致的完整编码序列，例外是信号序列中的沉默突变，在由翻译起始位点算起的第39和45位G-＞A。完成的质粒构建由E.coli DH5扩增，离子交换色谱纯化(MaxiPrep columnsfrom Qiagen(Valencia，CA)catalog#12162)。HT-1080的转染和PCP-表达克隆的选择人纤维肉瘤系HT-1080(ATCC)于100mm培养皿中，在含10％热不稳定胎牛血清(HI-FBS)的高糖DMEM(DMEM-HG)中生长，在不含血清的介质中，采用用于脂质转染胺(Gibco，Bethesda，MD)的标准方法，用2ìg纯化的质粒转染。稳定的转染体通过用400ìg/mlG418(Gibco)处理平板培养物进行选择。选择10天后，贴壁的单个菌落由培养板中挑出，在12孔板中重复，生长直到汇合。个别的稳定的菌落被筛选出来用于PCP表达，采用TaqMan分析(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，应用相等量的总RNA。5’端引物为GACGAAGAGGACCTGAGGGCCTT(SEQ D NO3)(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)，3’端反向引物为TTCCTGGAACTGCAGCTTTGA(SEQ DNO4)(Perkin-Elmer，Foster City，CA)，反向探针为TGCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCT(SEQ ID NO5)(Perkin-Elmer)。在TaqMan筛选中基于PCPmRNA的最高表达水平，选用稳定的HT-1080/hPCP-23系。HT-1080/hPCP-23稳定系的原种移至含5％胎牛血清(HI-FBS)和10％DMSO(无G418)的DMEM-HG中，-70℃缓慢冷却过夜，然后转至液氮浴中长期贮存。新生的HT-1080/hPCP-23在含10％HI-FBS和250ìg/mlG418的DMEM-HG中维持不超过7代。用于收获的PCP的表达通过HT-1080/hPCP-23复制和生长而完成，在大鼠尾型I胶原—涂层板，不含血清和无G418的OptiMEM(Gibco)中，进行24小时。HT1080细胞中PCP的生产转化产生PCP的HT1080细胞系被采用，在含5％HI-FBS和4ml/LG418(GIBCO)的optiMEM介质中生长。培养物维持在37℃，溶解氧30％。产生典型的10升的一批大小。当细胞密度达到4-6×105个/ml，收集培养液，用0.2ìm膜过滤。另外一种方法是以每天0.8到1.0培养体积的新鲜介质灌流。灌流的培养物的密度达到1-2.5×106个/ml，维持2星期，持续收获。由HT1080细胞中纯化PCP以Dyematrex Gel Green A(Millipore，Bedford，MA)填充的柱子用50mMHEPES平衡，pH7.2，含有6mM CaCl2和0.3MNaCl。荷载HT1080细胞培养液后，用10倍柱体积的含1.0MNaCl的平衡缓冲液洗脱。PCP用50mM HEPES，PH7.2(含3M NaCl，2M尿素，6mM CaCl2)洗脱。洗脱部分混合浓缩至150-200mls，用4.0 L50 mMHEPES，6mM CaCl2，pH7.2透析过夜。然后用5000g离心15min除去沉淀物。含PCP样品在-20℃贮存备用。
含PCP样品解冻，用含有6mM CaCl2，pH7.2的50mM HEPES稀释，如果必要，NaCl浓度在0.1-0.15M。pH用2NHCl调至6.7。蛋白溶液用0.45ìm膜过滤，除去沉淀物。然后负载到Q-Sepharose HighPerformance(Pharmacia，Piscataway，NJ)填充的柱上，该柱已用含有6mMCaCl2和0.15M NaCl，pH6.7的50m MHEPES平衡.PCP不保留在柱上，因此在洗脱液中。PCP浓缩至1mg/ml用于筛选。果蝇细胞中PCP的产生用于转化产生PCP的果蝇细胞在生物反应器中进行，典型批体积是10升，在SF900IISF介质(GIBCO)。温度维持30C，溶解氧30％。定期性的，细胞流入一个含有谷氨酸盐、脂质和yeastolate的混合物中。当细胞密度达到30-50×106个/ml，上清液通过离心和用30Kd膜超滤浓缩而收获。纯化来自果蝇细胞的培养液体的PCP来自果蝇细胞的培养液体浓缩8倍，如果必要pH调整至7.1-7.2。培养液体3000g离心10分钟，用0.45ìm的滤膜过滤。然后负载到用羧基-砜(J.T.Baker/Mallinckrodt，Phillpsburg，NJ)填充的柱上，该柱已用含有6mMCaCl2，pH7.2的50mM HEPES平衡.负载后，柱用10倍柱体积的平衡缓冲液洗脱。保留蛋白用9倍柱体积的0.1到1.0M的NaCl梯度洗脱。含有活性PCP的收集液混合进一步纯化。
由羧基-砜柱上洗脱下来的PCP负载到Dyematrex Gel Green A柱上(Millpore，Bedford，MA)，该柱已用含有6mM CaCl2和0.3M NaCl，pH7.4的50mM HEPES平衡.然后用含1.0M NaCl的平衡缓冲液洗脱。保留的蛋白用含有6mM CaCl2，3M NaCl，2M尿素，pH7.4的50mM HEPES洗脱。洗脱峰浓缩，用含有6mM CaCl2和0.3M NaCl，pH7.4的50mM HEPES透析。制备物3000g离心10分钟。向上清液中加入Brij 35(Sigma，Madison，WI)至终浓度0.02％。此制备用于筛选。
实施例XII胶原酶的分离如Gehring，E.R.等J.Biol.Chem，270，22507，(1995)中描述的，人胶原酶-1的催化结构域作为与泛素蛋白融合的蛋白在E.Coli中表达。融合蛋白纯化后，胶原酶-1催化结构域通过用1mM氨基苯基汞乙酸(APMA)37℃处理1小时而释放，然后用锌螯合色谱纯化。
如Mookhtiar，K.A.等，Biochemistry，29，10620，(1990).中描述的，人胶原酶-2和白明胶酶B以活性形式由光滑的表皮中分离得到。
人胶原酶-3的前肽和催化结构域作为与泛素蛋白融合的N-端融合蛋白在E.Coli中表达。蛋白纯化后，催化结构域通过用1mM氨基苯基汞乙酸(APMA)37℃处理1小时而释放，然后用锌螯合色谱纯化。
如Roswit，W.T.等，Arch.Biochem.Biophys.，225，285-295(1983).中描述的，大鼠胶原酶-3以活性形式由子宫平滑肌细胞的培养介质中纯化而来。
实施例XIII原胶原C端蛋白酶活性的抑制化合物对PCP的抑制力在如下的体外检测方法中说明，应用合成的肽作为底物。方法A用20μM底物(Dabcyl-Pro-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Glu-Pro-n-Leu-Edans)(SEQ ID NO6).进行连续检测。最终检测条件是20μM底物，50 mM HEPES pH 7.5，50mM NaCl，3％DM50，37℃and PCP酶。产物的形成由荧光分光光器监测。Ex.＝335nm，Em.＝490nm.IC50通过初速度对化合物浓度作图计算得到。方法B80μL缓冲液A含有溶于DMSO或载体工具的相当量的检验化合物，与溶于20μM HEPES的大约10μL 1mg/mL PCP酶和10μL0.1mM底物混合。混合物在室温下温孵1-2小时，用Victor Plate reader读取荧光数值(Ex.405nm，Em.460nm 2000-4000，0.1-1sec/孔)，底物为DACM-Cys-Pro-Tyr-Aps-Glu-pro-nLeu-Lys-FITC-OH.(SEQ IDNO7)(DACM＝二甲基氨基香豆基马来酰亚胺，FITC＝荧光黄异硫氰酸盐)。IC50通过初速度对化合物浓度作图计算得到。
另外的体外检测方法是用天然的原胶原作为底物，这些方法在WO97/05865中有进一步的描述(“用于治疗与胶原过量有关疾病的C-端蛋白酶抑制剂”)。
表I-III，V and VI中的化合物IC50的范围在0.02到200μM。
表VI中的化合物IC50的范围在10-1000ìM。
实施例XIV胶原酶活性的测定如Knight，C.G.等，FEBS Lett.，296(3)263-266(1992)描述的，本发明体外37℃对胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3的抑制活性是基于水解MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2(SEQ ID NO8)(Bachem，Inc.)胶原酶酶用检测缓冲液稀释(50mM Tricine pH 7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，和0.005％Brij-35)含有10ìM溶于DMSO的上述底物。加入溶于DMSO或仅仅溶于DMSO(对照样品)的本发明化合物，其DMSO的终浓度为2.5％.荧光变化用Perkin-Elmer LS-52B荧光仪监测，激发波长为328nm，发射波长为393nm。
由表I-VI选出的化合物对PCP的选择性抑制超过对人胶原酶酶10到1000倍。
序列表<110> Dankwardt，Sharon MarieVan Wart，HaroldWalker，Keith Adrian Murray<120>肽原胶原C端蛋白酶抑制剂<130>20425<160>8<170>用于Windows3.0版的FastSEQ<210>1<211>122<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1gcgcgcggta cccgccccgc cagcatgccc ggcgtggccc gcctgccgct gctgctcggg60ctgctgctgc tcccgcgtcc cggccggccg ctggacttgg ccgactacac ctatgacctg120gc122
<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2ccgctcgagc ctcactgggg ggtccggttt cttttctgca ctcggaattt gagctggtg59<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gacgaagagg ac ctgagggc ctt23<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4ttcctggaac tgcagctttg a21
<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5tgccgtctga gatccacagc ctgct25<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>6Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Leu1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>7Cys Pro Tyr Gly Asp Glu Pro Leu Lys1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<223>Xaa＝DPA<400>8Arg Ala Xaa Leu Gly Leu Pro1 权利要求
1.选自由式(I)表示的化合物组的化合物 其中，R1和R4相互独立，为氢或烷基；R2为(i)环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳烯基，杂环或杂环烷基；或(ii)-(亚烷基)-B-X，其中B为-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n为0、1或2)、-C＝O-、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NR8SO2-(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基杂芳基，或杂芳烷基；或(iii)-(亚烷基)-B-X，其中B为NR8CO(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；或(iv)R2和R3形成亚烷基或杂亚烷基链；R3为氢或烷基；R6为氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基或杂芳烷基；R5为(i)氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，芳烯基，杂芳基，杂芳烷基，杂芳烯基，杂环烷基，杂烷基，或-(亚烷基)-C(O)-X1，其中X1为烷基，羟基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、杂芳基，杂芳氧基，杂芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互独立为H或烷基，或R’和R”形成亚烷基链)；或(ii)R4和R5形成亚烷基链；或(iii)R5和R6形成亚烷基链；n为0或1；A为-C(＝O)-CH(R9)-(CH2)m-N(R10)-，其中，m为0-5的整数；R9为氢，烷基，环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，杂芳烷基，杂环烷基，杂烷基，或-(亚烷基)-C(O)-X1，其中X1为烷基，羟基，烷氧基，芳基，芳烷基，芳氧基，芳烷氧基、杂芳基，杂芳氧基，杂芳烷氧基，或NR’R”(R’和R”相互独立，为H或烷基，或R’和R”形成亚烷基链)；和R10为氢，烷基，芳烷基，或杂芳烷基；Z为Y-B其中，Y为亚烷基或单键；和B为-CO-，-C(O)O-，-CONR8-，-SO2-，或SO2NR8-(其中R8为氢或烷基)，亚烷基(任选被羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基取代)或单键；R7为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基；条件是当n＝0和Z为SO2时，那么R2不含有咪唑基；和它们药物可接受的盐、前体药物、单独的异构体、异构体的混合物。
2.权利要求1的化合物，其中n为0。
3.权利要求2的化合物，其中R3和R6为氢。
4.权利要求3的化合物，其中R2为芳烷基或杂芳烷基。
5.权利要求4的化合物，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
6.权利要求5的化合物，其中R2为任选取代的苯甲基或杂芳烷基。
7.权利要求6的化合物，其中R2为4-叔-丁氧苯甲基，3-氯苯甲基，3-吲哚甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑甲基或4-噻唑甲基。
8.权利要求7的化合物，其中R2为4-噻唑甲基。
9.权利要求8的化合物，其中R7为芳基，芳烷基，杂芳基或杂芳烷基。
10.权利要求8的化合物，其中Z为-C(O)O-，R7为任选取代的苯甲基。
11.权利要求9的化合物，其中Z为-S(O)2-，R7为芳基或杂芳基。
12.权利要求10或11的化合物，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
13.权利要求12的化合物，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
14.权利要求3的化合物，其中R2为-(亚烷基)-B-X其中B为-O-、-NR8-、-S(O)n-(其中n为0、1或2)、-C＝O、-CONR8-、-NR8CO2-、-NR8SO2-或-C(＝NR8)NSO2(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基。
15.权利要求14的化合物，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
16.权利要求15的化合物，其中R2为-CH2-B-X，B为-NHCO2，X为苯甲基。
17.权利要求16的化合物，其中R7为芳基或芳烷基。
18.权利要求17的化合物，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
19.权利要求18的化合物，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
20.权利要求1的化合物，其中n为1。
21.权利要求20的化合物，其中m为0，R3和R6为氢。
22.权利要求21的化合物，其中R2为芳烷基或杂芳烷基。
23.权利要求22的化合物，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
24.权利要求23的化合物，其中R2为任选取代的苯甲基或杂芳烷基。
25.权利要求24的化合物，其中R2为4-叔-丁氧苯甲基，3-氯苯甲基，3-吲哚甲基，2-噻吩基甲基，4-咪唑甲基或4-噻唑甲基。
26.权利要求25的化合物，其中R2为4-噻唑甲基。
27.权利要求26的化合物，其中R7为芳基，芳烷基，杂芳基或杂芳烷基。
28.权利要求27的化合物，其中Z为-C(O)-，R7为苯甲基。
29.权利要求27的化合物，其中Z为-SO2-，R7为芳基。
30.权利要求28或29的化合物，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
31.权利要求30的化合物，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
32.权利要求21的化合物，其中R2为-(亚烷基)-B-X，其中B为-O-、-NR8-、-S-、-C＝O、-CONR8-、-NR8CO2-、-NSO2-或-C(＝NR8)NSO2-(其中R8为H或烷基)，X为环烷基，环烷基烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，或杂芳烷基。
33.权利要求32的化合物，其中Z为-C(O)O-或-S(O)2-。
34.权利要求33的化合物，其中R2为-CH2-B-X，B为-NHCO2，X为苯甲基。
35.权利要求34的化合物，其中R7为芳基或芳烷基。
36.权利要求35的化合物，其中R1和R4为氢，R5为烷基。
37.权利要求36的化合物，其中R5为(S，S)-1-甲基丙基。
38.含有权利要求1到37的任意一个的化合物和一个药物可接受的赋形剂的药物组合物。
39.用于制备权利要求1的化合物的方法(i)将式II中的化合物，其中L为离去基团和R1-R7、A、n和Z如权利要求1所限定，用羟胺或其保护的衍生物处理，(ii)如果需要去保护，分离权利要求1的化合物。
40.按照如权利要求39所要求的方法制备的权利要求1的化合物。
41.作为治疗活性物质的权利要求1-37中任何一个所要求的化合物。
42.权利要求1-37中任何一个所要求的化合物在制备用于治疗纤维变性疾病、更优选急性呼吸窘迫综合症的含有权利要求1-37中任何一个所要求的化合物作为活性成分的药物中的应用。用权利要求1到37的任何化合物，制备一个药物，其含有权利要求1到37的任何化合物作为活性成分，用于治疗。
43.一种治疗纤维变性的方法，在病人需要原胶原C端蛋白酶抑制剂时给予病人，所述抑制剂对原胶原C端蛋白酶的选择性至少高于对胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3的10倍。
44.如上文中描述的本发明。
全文摘要
本发明涉及式(Ⅰ)化合物,其中R
文档编号C07K14/78GK1330661SQ99814311
公开日2002年1月9日 申请日期1999年12月6日 优先权日1998年12月10日
发明者沙仑·马里·丹克沃德特, 哈罗德·埃德加·范瓦特, 基思·阿德里安·默里·沃克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司