专利名称：：用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物的制作方法用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物本发明涉及到化合物如聚唾液酸的衍生物，该衍生物具有末端唾液酸单元，且优选地基本只由唾液酸单元组成，在还原或非还原端有能与底物反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团，本发明也涉及到生产这些衍生物的方法。这些衍生物用于缀合含胺基基团的底物，如肽、蛋白质、药物、药物送递系统(如脂质体)、病毒、细胞(如动物细胞)、微生物、合成聚合物或共聚物等。聚唾液酸(PSA)是由某些细菌菌林和哺乳动物某些细胞产生的天然存在的无支链的唾液酸聚合物[Rothet.al.，1993]。通过用神经氨酸酶进行有限的酸水解、消化作用或是通过分级分离天然的、细菌的或细胞来源形式的聚合物，可以产生各种聚合度的聚唾液酸从n-约80或更多个唾液酸残基，^氐至n-2。不同PSA的组成也各异，所以存在同聚形式即oc-2，8-连接PSA，包括大肠杆菌(Aco7/)Kl菌林和B群脑膜炎球菌(meningococci)的荚膜多糖，它也存在于胚胎形式的神经细胞粘连分子(N-CAM)中。也存在杂聚形式，如大肠杆菌K92菌林的oc-2,8a-2，9交替连接的PSA和脑膜炎奈瑟氏菌(义迈e/7/z^/〃cr/》的C群多糖。此外，唾液酸也存在于与非唾液酸单体(如脑膜炎奈瑟氏菌的W135群或Y群)形成的交替共聚物中。PSA具有重要的生物学功能包括病原菌对免疫和补体系统的逃逸，以及胎儿发育过程中对未成熟神经元的神经胶质粘连性的调控(其中该聚合物具有抗粘连的功能)[Muhlenhoffet.al.，1998;Rutishauser，1989jTroy，1990，1992;ChoandTroy，1994]，但在哺乳动物中没有已知的PSA受体。大肠杆菌Kl菌抹的a-2，8-连接PSA也称为'多聚乙酰神经氨酸，(colominicacid)并且用于(以各种长度)阐述本发明。在细菌多糖中，甚至当缀合到免疫原性载体蛋白时，PSA的a-2，8-连接形式也是独特地非免疫原性的(在哺乳动物受试者中既不引起T细胞应答也不引起抗体应答)，这种缀合形式可能反映了其作为哺乳动物(以及细菌)聚合物的存在。较短形式的聚合物(最高到n=4)存在于细胞表面神经节苷脂上，广泛分布于身体中，并且被认为有效地加强和维持了PSA的免疫耐受性。近些年，PSA的生物学性质，特别是(1-2,8-连接的同聚PSA的生物学性质，被用于改变蛋白质和低分子量药物分子的药代动力学性质[Gregoriadis，2001;Jainet.al.,2003;US-A-5846,951;冊-A-0187922]。许多治疗型蛋白包括过氧化氲酶和天冬酰胺酶的PSA衍生化[Fer雄desandGregoriadis，1996and1997]使循环半衰期和它们的稳定性得到了显著的提高，并且使得在应用这些蛋白质时不用考虑已经存在的抗体，这些抗体是先前暴露于该治疗型蛋白而产生的一种不需要的(而且有时是不可避免的)结果[FernandesandGregoriadis,2001]。在许多方面，聚唾液酸化蛋白的l奮饰后的性质同聚乙二醇(PEG)衍生蛋白相近。例如，在所有情况下，半衰期都增加了，而且蛋白质和肽对于蛋白水解消化作用更加稳定，但是PSA对生物活性的《呆持似乎比PEG更强[Hreczuk-Hirstet.al.，2002]。而且，PEG用于必须长期给药的治疗药剂中时存在问题，因为PEG生物降解非常緩慢[Beranovaet.al.,2000]而且其高和低分子量形式都倾向于在组织内蓄积[Bendele,et.al.，1998;Convers，et.al.，1997〗。人们发现聚乙二醇化蛋白会导致产生抗PEG抗体，这些抗体会影响血液循环中该缀合物的停留时间[Chenget.al.，1990]。尽管PEG作为与治疗剂缀合的肠道外给药的聚合物有着成熟的历史，还需要对其免疫毒理学、药理学和代谢有更好的理解[HunterandMoghimi,2002;Brocchini,2003]。同样的，在要求高给药量的治疗药剂中应用PEG(因此最终导致高剂量的PEG)也存在顾虑，因为PEG的蓄积会导致毒性。因而a-2，8-连接PSA成为了使人关注的PEG替代物，它作为人体的天然部分是免疫系统"不可见"的生物可降解聚合物，而且可由组织神经氨酸酶降解为唾液酸，而唾液酸是一种无毒的糖类。在前面的科学论文和已获得授权的专利中，我们小组已经描述了利用天然的PSA来改进蛋白质治疗剂的药代动力学性质[Gregoriadis,2001;FernandesandGregoriadis,1996，1997，2001;Gregoriadiset.al.，1993,1998，2000;Hreczuk-Hirstet.al.，2002;Mital，2004;Jainet.al.,2003，2004;US-A—05846，951;WO-A—0187922]。现在，我们描述的是新的PSA衍生物，这提供了PSA衍生蛋白(和其它形式的治疗药剂)的新组成和新生产方法。这些新材料和方法特别适合于生产用于人类和动物的PSA衍生治疗药剂，对于人类和动物，由于医学伦理学和监管部门(如FDA,EMEA)的安全性要求，使得药物个体的化学和分子定义非常重要。前面已经描述了将多糖联接到治疗药剂如蛋白质上的方法[JenningsandLugowski，1981;US-A-5846，951;WO-A-0187922]。这些方法中有一些是依靠聚合物非还原端的化学衍生化来产生蛋白质反应活性醛基部分(图1)。PSA(和其它多糖)的还原端在温和条件下与蛋白只具有弱反应活性，该温和条件是在缀合过程中维持蛋白质构象和PSA的化学完整性所必需的。含有邻二醇的唾液酸末端单元的非还原端可以容易地(且选择性地)被高碘酸盐氧化而生成单醛衍生物。这种衍生物与蛋白质的反应活性更高，并且含有反应性适宜的元件，适于通过还原性氨基化和其他化学作用蛋白质连接。我们已经在以前的US-A-5846,951和WO-A-0187922中对此进行了描述。这一反应在图1中进行了阐述，其中a)显示了末端唾液酸的非还原端用高碘酸钠氧化CA(源自大肠杆菌的a-2，8-连接PSA)生成一个蛋白质反应活性醛基之后，醛基与蛋白质的一个伯胺基团之间的反应，和b)显示了用氰基硼氢化钠选择性地还原希夫碱，从而与蛋白质氨基基团生成一个稳定的不可逆的共价键。在W02005/016973中，我们描述了具有由末端唾液酸单元引入的巯基反应活性基团的多糖衍生物。末端唾液酸单元通常是在多糖的非还原端由唾液酸单元的衍生化引入的。巯基反应活性基团优选地为马来酰亚胺基团。引入这一基团的反应可以包括在一端具有巯基反应活性基团和另一端具有如酰肼或酯基团的异双功能试剂与一个醛基或一个胺基基团之间的反应，该醛或胺基基团位于多糖的唾液酸衍生末端单元上。产物可用于蛋白的定位衍生作用，例如在Cys单元或引入的巯基基团位置衍生。尽管已经描述的各种将PSA连接到治疗药剂上的方法[US-A-5846,951;WO-A-0187922]在理论上是可行的，但是为使蛋白与PSA非还原端(以醛的形式)反应生成的缀合物达到可接受的产量，所要求的反应时间在较高温度下将不利于蛋白质的稳定性(例如，干扰素a-2b)。其次，所需的反应物浓度(即聚合物过量)可能难以实现或不够经济。因此，我们通过开发出一种新的方法解决了上述问题，这种方法用于将在还原和/或非还原末端带有NHS-唾液酸基团的聚唾液酸缀合至蛋白质。还原端的弱反应活性可以被用来产生有益的效果(通过破坏非还原端，帽化还原端和用双功能交联剂衍生)，因而避免了使用已经建立的方法(图1)所导致的图2和3所描述的产物复杂性，图l的方法是用高碘酸盐氧化的CA来还原性氨基化蛋白质。JenningsandLugowski，在US4，356，170中，描述了通过活化的还原末端单元用蛋白质来^f生细菌多糖，包括开始的还原步骤和随后的氧化步骤。Jennings等采用了这一方法的实例包括还原性末端单元是N-乙酰基甘露糖胺的多糖、葡萄糖、葡萄糖胺、鼠李糖和核糖。在EP-A-0454898中将蛋白质的氨基基团连接到醛基基团上，该醛基是通过还原和部分氧化葡糖胺聚糖还原性末端的糖部分合成的。以这种方式处理的葡糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素和疏酸皮肤素。这些化合物在还原末端都没有唾液酸单元。本发明提供了一种新型的化合物，包括至少一个末端单元是衍生自唾液酸单元的一种聚唾液酸底物，所述唾液酸单元包含在2或7位碳上连接到末端单元的N-羟基琥珀酰亚胺酯，任选地通过接头连接。N-琥珀酰亚胺基在下文中被称为NHS基团。本发明中琥珀酰亚胺基部分可以未被取代或被如磺酰基团或其它基团取代以产生可用的溶解度。衍生的末端单元可以来自非还原末端唾液酸基团或来自还原末端唾液酸基团。每个PSA分子可以有两个这样的NHS基团，例如末端单元上的一个NHS基团来自非还原末端唾液酸基团，另一个来自还原末端唾液酸基团。本发明的化合物也可以用通式来定义。新型化合物优选地具有通式I、II或in:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中W为H或磺酰；R2为一个连接基团；A为NR5、NR5NR6、0或SR，其中115和116独立地选自H、C^烷基和芳基；SylO为一个唾液酸基团；n为1—100,m为0—100;R3为氢或一种单-、双-、寡聚-或多聚唾液酸基团、一种蛋白、一种肽、一种脂质、一种药物、一种细胞膜或细胞壁组分或一种药物送递系统；并且114为氢或一种单-、双-、寡聚-或多聚唾液酸基团、一个烷基、一个酰基、一种药物或一种药物送递系统。连接基团R2，同化合物I至in中的NHS基团和酯键一起通常形成一个衍生自双功能NHS试剂的结构，所述双功能NHS试剂是用来合成上述化合物的。本申请文件的后面会列出适合的双功能试剂。在合成源自PSA的标记为A的基团的过程中，原料自身连接到双功能试剂适当的末端，同时从NHS试剂上相应地去掉一个离去基团(在不参加反应NHS基团的另一端)，或者同时有试剂结构性的重排。通常，连接基团R2包括一个亚烷基基团和一个羰基，通式I至m化合物中的A会连接到羰基上。优选地，R'为CpH2pC0，其中p为2-12。或者，连接基团可以包括一个亚烷基基团，其中烷基碳原子之一连接到A基团上。例如R2可以包括链中酯、酰胺、醚、石克醚和/或1-碌k-N-琥珀酰亚胺键，例如通过PSA试剂或NHS试剂的初步衍生反应获得。R'可以是一个烯氧亚烷基基团或一个烯寡氧亚烷基基团。A优选地为NR5，其中R5为氢，NR5衍生自一种伯胺PSA起始试剂。下面给出了这种胺基PSA衍生物及其生产方法的实例。在一个实施方案中，对末端唾液酸单元进行了预先化学反应处理以生成有用的官能团，含有马来酰亚胺基团的试剂将会连接到上述所得的官能团上。在一个实施方案中，我们发现可以很方便地利用在我们早期出版物中公开的生成醛基的化学反应作为预备步骤，来生成可连接冊S基团的官能团。本发明包括生成新型化合物的方法。也提供了一种合成新型化合物的新方法，在所述新方法中，任选地在末端唾液酸单元预先书f生4匕之后，使PSA底物与双功能试剂反应，所述双功能试剂的功能之一是作为NHS酯，而另一功能是根据具体情况与唾液酸单元或其衍生物反应，上述方剂之间丄生共:缀:作用，且NH;基^保4不变。、3一'、-'-在一个优选的实施方案中，对底物中的唾液酸单元进行一步预先反应处理，这一步会生成一个胺基基团。当被衍生化的唾液酸单元是一个还原末端单元时，预备步骤可以包括异头碳的氨基化，或优选地包括下列步骤a)通过还原作用打开还原末端唾液酸单元的环，以生成邻二醇基团；b)选择性地氧化步骤a)中生成的邻二醇基团，以生成醛基基团；c)用铵化合物通过还原性氨基化作用将步骤b)中的醛基基团转化为氨基基团，例如，使用氰基硼氢化物(borohydrate);和d)用过量的同双功能NHS试剂与步骤c)所得的的氨基基团反应。在这种方法中使用的含有还原性末端唾液酸基团的起始底物原料应该优选地在还原末端具有唾液酸单元，通过它的8位碳原子连接到邻近的单元。在步骤b)中当末端唾液酸的环被还原性地打开之后，还原端的6，7-二醇基团被氧化而在7位碳原子上生成一个醛基基团，随后在该位置上引入氨基基团(步骤c)和NHS基团(步骤d)。在另一个实施方案中，还原末端的唾液酸单元通过9位碳原子连接到邻近的单元上，在步骤b)中，在还原端由步骤a)生成的C-7，C-8二醇基团被氧化以在8位碳原子上生成一个醛基基团，之后生成氨基基团(步骤c)，然后是NHS基团(步骤d)。根据一个优选的实施方案，起始原料是一种PSA，其还原末端带有一个唾液酸，且在非还原端也有一个含有邻二醇基团的末端唾液酸单元。本方法的第一步(步骤a)中，在多糖的还原端进行了还原反应以打开环生成一个邻二醇。在还原步骤中，非还原端的邻二醇的功能没有改变并保持完整。第二步是氧化反应(步骤b)，在氧化步骤中非还原端和还原端的邻二醇会被氧化生成醛基基团。在步骤c中醛基被氨基化，在步骤d中NHS基团被连接上。结果所得产物将会是双功能性的，即其含有两个冊S基团；而且产物交联底物的能力使得其可能具有有用的治疗活性，产物的交联底物的能力是通过还原和非还原端的两个NHS基团与适合的官能化底物之间的反应所赋予的。根据所述方法的另外一个优选实施方案，其中还原末端唾液酸是被氨基化的，在非还原末端也含有末端唾液酸的唾液酸起始底物经过如下步骤处理e)选择性的氧化步骤，将C-7，C-8邻二醇基团位置的非还原末端唾液酸单元氧化生成C-7-醛基基团；和f)还原步骤，将C-7-醛基基团还原为相应的醇。这一步骤也同时将还原端的唾液酸环还原性地打开，也就是同时进行了步骤a)。本发明这一方面提供了具有一个"钝化的"唾液酸非还原末端的唾液酸衍生物，这样就可以通过高碘酸盐氧化作用(步骤b)和还原性氨基化作用(步骤c)来活化还原末端。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种新的方法，其中在非还原末端含有末端唾液酸的唾液酸起始原料经过如下处理步骤e)选择性的氧化作用，将在C-7，C-8邻二醇基团处的非还原末端唾液酸单元氧化，在7位碳原子上生成一个醛基基团；步骤c)用一个铵化合物通过还原性氨基化作用将步骤e)中生成的醛基基团转化为氨基基团，和；步骤d)对所得的氨基基团进行修饰。本发明的本实施方案中用到的原料优选地在非还原端具有唾液酸单元，该唾液酸单元通过邻近单元的8位碳原子连接到邻近单元上。在步骤e)中，C-7，C-8邻二醇基团被氧化，在7位碳原子上生成一个醛基基团，醛基随后被转化为一个氨基基团(步骤c)和NHS基团(步骤d)。在另一个实施方案中，非还原端的唾液酸单元通过邻近单元的9位碳原子连接到邻近单元上，在步骤b)中这一邻近基团的C-7，C-8二醇被氧化，在8位碳原子生成一个醛基基团，随后醛基被一个氨基基团(步骤c)和NHS基团(步骤d)代替。上述提到的氧化反应步骤(b和e)应当优选地在这样的条件下实施，所述条件使得长链聚合的骨架起始原料基本没有发生链中断裂，因此基本没有分子量的下降。可以使用能够实施这一氧化反应的酶。更加便利的是所述氧化反应为化学氧化反应。该反应可以使用固定化的试剂如基于聚合物的过钌酸盐来实施，或通过更加直接的利用溶解试剂的方法来实施。合适的氧化剂为过钌酸盐，或优选地为高碘酸盐。氧化反应可以使用高碘酸盐来实施，浓度范围是lmM到lM，pH范围是5到10，温度范围是0到6(TC,反应时间范围是1分钟到48小时。对步骤a)和步骤f)适宜的还原条件应可以在催化剂存在的条件下利用氢，所述氢的形式优选地为氢化物如硼氢化物。这些可以;陂固定化成为安珀莱特(Amberlite)树脂固载的硼氢化物。优选地，碱金属氢化物如硼氢化钠被用作还原剂，浓度范围是1nM到0.1M,pH范围是6.5到10,温度范围是O到60°C,反应时间范围是1分钟到48小时。选择的反应条件要保证PSA原料上的侧翼羧基不被还原。在实施预氧化反应步骤后(即在非还原端)，生成的醛基基团被还原为醇基基团，所述醇基基团不是邻二醇基团的一部分。其它适宜的还原剂为酸性条件下的氰基硼氢化物，如聚合物固载的氰基硼氢化物或碱金属氰基硼氬化物，L-抗坏血酸，焦亚碌b酸钠，L-selectride(商标)，三乙酰氧基硼氬化物等。在反应各步(如还原和氧化)过程中，在对每一步得到的中间产物进行随后步骤的处理前，要先将其从氧化剂、还原剂、交联剂、和其他的试剂如NaCNBH3、胱胺中分离出来。如果反应步骤是在液相中进行的，可以使用常规技术来进行分离，如使用乙二醇来消耗过量的氧化剂、乙醇沉淀、多糖透析、尺寸排阻色谱法和超滤来浓缩液体溶液。还原反应步骤的产物混合物也可以用透析和超滤来分离。可以设计在固定的氧化剂和还原剂上进行的反应，这样就可以更简便地对产物进行分离。本发明的方法中，生成中间胺基化合物，然于与双功能NHS试剂反应，由于NHS基团可与胺基基团反应，所以使用同双功能NHS试剂很方便。当这类试剂的两个NHS基团的反应活性相等时，有必要使用明显过量的该试剂来使交联反应的程度最小化，即胺基中间产物的两个分子与双-DHS试剂的一个分子反应。实施反应所处条件必须使得第二个NHS基团保持完整，且反应产物必须可以从过量的未反应NHS试剂中分离。NHS基团在水中高度地不稳定。因此反应条件必须使得匪S试剂与水或其它质子溶剂的接触降到最低。优选地在二甲基亚砜(DMS0)中实施反应。为了增溶底物，可能必须在反应中包含少量的水或其它的质子和极性溶剂。它们的量应该降到最低，例如保持在总溶剂量的10°/。以下。为了促进试剂溶解并加速反应，可能需要升高温度，前提是不会导致如氧化或裂解底物等的化学修饰达到不期望的程度。在另一个的实施方案中，根据步骤a)、b)和/或步骤c)生成的醛基封端中间产物与肼反应，生成腙中间产物。腙基可以与NHS基团反应。在本发明方法的有双功能NHS试剂参加的一些必要步骤中，双NHS化合物为合适的NHS试剂。也同样要小心在上述胺基中间产物上发生的反应。反应路线图见图8a)。适合的双-NHS试剂为双[2-琥珀酰亚胺基氧基羰基-氧)乙基]砜(BS0C0ES)和其硫代类似物，双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)，双琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)，双碌"戈双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP),双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS),双琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)或其^l代类似物，3，3，-双疏代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP),和乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)和其辟u代类似物。根据所述方法的一个可选实施方案，预备步骤不是在底物上形成胺基基团，而是在预备步骤中生成巯基基团，优选地在末端唾液酸单元上，或者在末端唾液酸单元和另一端的末端单元上，所述另一端的末端单元可以是唾液酸或另一种糖残基。巯基基团，例如，是通过胱胺与一个醛基基团反应，然后再还原生成的。通过在起始原料上用各自的末端基团实施步骤a)、b)和/或步骤e)可以在一个末端或两个末端引入醛基基团。起始原料可以另外有一个带有邻二醇基团的非还原末端糖，其中邻二醇基团可以与胱胺反应而转化成醛基。或者，这样的末端基团可以被随后的氧化及还原步骤钝化，以防止生成双功能巯基中间产物。石克醇化作用可以按照Pawlowski等描述的通用步骤来实施。或者，可以通过对在上述步骤a-c生成的胺基中间产物进行一系列步骤而引入巯基。通过将胺基基团与包含巯基化唾液酸单元的2-亚氨蓉汾烷(iminothiolane)(2-IT)反应(Pawlowski，A.e"70/7.,可以引入巯基基团。含有巯基的中间产物是一种新型的化合物，并且代表了本发明的另一个方面。该化合物可以用下面的通式IV、V、VI或VII表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中f为连接基团；A工为NR12,其中R"为H，d—"烷基，或芳基；GlyO为一个糖基，k为0-100;Gly10为一个糖基，它任选地在侧翼羧酸基团上发生衍生；W为一个单-、双-、寡-或多糖基团、一种蛋白质、一种肽、一种脂质、一种药物、一种药物送递系统、或细胞膜或壁的一种组分；和118和119分别为氢或一个单-、双-或寡糖基团、一个烷基基团、一个酰基基团、一种药物、一种脂质或一种药物送递系统；R"为一个单-、双-、寡-或多糖基团、一种蛋白质、一种肽、一种脂质、一种药物、一种给药系统、细胞膜或壁的一种组分、或一个下图所示的基团其中R"和R"中一个为氢，另一个是一个单-双-或寡糖基团、一个烷基基团、一个酰基基团、一种药物、一种脂质或一种药物送递系统。连接基团R7选自与上述所列R2同样的基团。W和W的定义优选地分别同所上述公开的W和R4优选定义一样。Gly0优选地是SylO。本发明第一方面的方法的必要步骤中，当Gly0为SylO时的巯基中间产物与异双功能接头反应，所述异双功能接头同NHS基团一样含有一个巯基反应活性官能团。这种巯基反应活性基团为例如N-马来酰亚胺基团，或辟u代吡t定二辟L基团、乙烯砜或N-硪乙酰胺基团。适合的双功能试剂的实例有N-(oc-马来酰亚胺乙酰氧)琥珀酰亚胺酯，(AMAS),N-(P-马来酰亚胺丙酰氧)琥珀酰亚胺酯，(BMPS)，马来酰亚胺辛酰氧)琥珀酰亚胺酯，(EMCS)，或其硫代类似物，N-(Y-马来酰亚胺丁酰氧)琥珀酰亚胺酯，(GMBS)，或其碌"义类似物，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC),m-马来酰亚胺苯曱酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，或其硫代类似物，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺曱基)-环己烷-1-羧基酯)(SHCC)或其硫代类似物，琥珀酰亚胺-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)或其疏代类似物，琥珀酰亚胺-6-(P-马来酰亚胺-丙酰氨基)己酸酯(SMPH)，N-(k-马来酰亚胺十一酰基氧)硫代琥珀酰亚胺-酯(疏代-KMUS)，琥珀酰亚胺-6-[3-2(2-吡啶二硫基)丙酰氨基]己酸酯(LC-SPDP)或其硫代类似物，4-琥珀酰亚胺氧羰基-曱基-ot-(2-吡啶二硫基)曱苯(SMPT)，或其硫代-LC类似物，N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺[4-乙烯砜]苯甲酸酯(SVSB)，琥珀酰亚胺-3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)，和N-琥珀酰亚胺-》典乙酸酯(SIA)和N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰基)氨基苯曱酸酯(SIAB)或其硫代类似物。一般反应所用的反应条件，这里也可以应用，实例参照Hermanson1995。可以依据其水溶性和缀合物是否可以被切割来选择上述提到的NHS异双功能试剂。优选带有短的非免疫原性接头的试剂。用NHS试剂的反应通常在0-100%的DMSO溶液中进行(优选地最小化水的含量，如10%),温度在0-150。C之间，优选地在20。C。中间产物上的唾液酸底物可以在热条件下被促进溶解，例如优选地在惰性环境下超声或微波加热。当后续使用的产物对有机溶剂耐受性很差时，可以使用水溶性NHS试剂。此外，当产物用于细胞表面缀合时，优选水溶性NHS试剂，因为任何未从产物中除去的未反应试剂都不能穿过细胞膜。本发明中的起始原料是聚唾液酸(PSA)。这样的化合物可能在分子中包括非唾液酸单元。例如唾液酸单元可与其他糖单元交替排列。但是，多糖优选地基本只由唾液酸单元组成，唾液酸优选地是在a-2，8和/或cc-2，9处连接的(下文用PSA指代聚唾液酸)。起始原料含有至少2个唾液酸单元，优选地至少5个，更优选地至少10个，例如至少50个。PSA可以来自任何来源，优选天然来源如细菌，例如大肠杆菌K1或K92，B群脑膜炎球菌，或者甚至是奶牛的奶或N-CAM。唾液酸聚合物可以是杂聚的聚合物如脑膜炎奈瑟氏菌的135群或V群，或者可以是化学合成的。PSA可以是盐或游离酸的形式。PSA可以是水解的形式，这样从细菌源获得PSA后可以降低它的分子量。PSA可为有窄或宽的分子量范围的物质，如多分散性为1.01,甚至为2或更多。优选地所用的PSA分子量的多分散性少于1.2。许多以天然形式、或作为上述类型的中间产物、或作为宽分子量分布的终产物存在的PSA可以被分级分离成具有较低多分散性的级分，即分成具有不同平均分子量的级分。分级分离优选地利用阴离子交换色镨完成并用一种适宜的碱性緩冲液洗脱。我们发现了一种适宜的阴离子交换介质，即一种具有季铵离子侧翼基团(即强碱)的制备介质，如基于活性琼脂糖的强离子交换物质。洗脱緩冲液无反应活性且优选地易挥发，这样可以通过蒸发作用从每个级分中回收所需产物。适宜的碱性緩冲液的实例为胺，例如三乙醇胺。例如可以用冻千的方法回收。分级分离方法适合于PSA起始原料和其它PSA衍生物。因此，可以在本发明必要的方法步骤之前或之后应用这种分级分离技术。优选地，分级分离过程是利用离子交换色镨法(IEC)在许多分子量优选地高于5kDa的可离子化介质上进行的，并且优选地使用具有挥发性的酸或碱作为洗脱緩冲液。优选地，PSA具有羧酸集团，且离子交换为阴离子交换。优选地，洗脱緩冲液含有胺，如三乙醇胺，优选地，通过冻干洗脱级分来回收PSA。本发明的PSA-NHS化合物可以用于随后的衍生化胺的过程，例如有生物学用途的化合物。这样的反应优选地在磷酸盐、碳酸氬盐/碳酸盐、HEPES或硼酸盐緩沖液中进4于，以上l爰冲液的浓度优选地在5-200mM之间。也可以使用其它不含伯胺的緩冲液。例如，可以使用HEPES，因为它仅含有叔胺。在反应结束时，可以加入大量过量的中性到碱性pH值的Tris/甘氨酸来停止反应。反应优选地在4。C到2(TC下进行30分钟到2小时，pH为7到9之间。根据胺的浓度，所用的PSA-NHS化合物会比蛋白质(或其他衍生化合物)过量2-50倍摩尔。通常，PSA-NHS化合物的浓度范围优选地在0.1-10mM之间。胺，例如蛋白质，浓度优选地保持在IO-IOOiuM，因为过度稀释的蛋白质溶液会导致PSA-NHS化合物中的NHS基团大量水解。产物NHS化合物对于衍生化的含胺基团的蛋白质特别重要，在所述蛋白质中适宜的胺基基团为赖氨酸的e胺基基团或N-末端氨基基团。产物对于衍生化的蛋白质或肽形式的治疗活性药剂特别重要，治疗活性药剂如细胞因子、生长激素、酶、激素和抗体或抗体片段。或者，这种方法可以被用于衍生化药物送递系统如脂质体，例如可通过NHS基团与脂质体上的胺基团反应形成组件。在US-A-5846951中给出了其他的药物送递系统。其他可被衍生化的物质包括病毒、微生物、包括动物细胞的细胞以及合成的聚合物或共聚物。本发明还提供了方法，其中新化合物与具有可衍生胺基基团的生物学相关化合物反应，所处反应条件适合于NHS基团与胺基基团反应生成一个共价缀合物。生物学相关分子优选地为一种肽或一种蛋白质，且胺基基团位于一个赖氨酸单元的一条侧链上或位于肽或蛋白质的N-末端。衍生化程度可以不到1.0,但是优选地至少为1.0，例如至少为1.5，也就是生物学活性化合物的每个分子都缀合至少一个PSA底物部分。通过与新PSA化合物反应使得蛋白质和药物送递系统的衍生化，可能导致半衰期的增加、稳定性的提高、免疫原性或抗原性的降低、和/或溶解度的调节以及随之而来的生物利用度和药代动力学性质的调节，或可能增强活性物质的溶解度，或可增强含有衍生的活性物质的溶液的粘度。优选的新单功能PSA-NHS具有高度的反应活性，且有助于合成和制造可药用的产品，因为它可以防止因使用带未修饰还原末端的PSA所导致的严重的复杂性(图2)。新型聚合物的生产(图5)包括选择性氧化(步骤e),优选地用高碘酸盐(见前面部分)在非还原端引入一个醛基官能团，之后还原氨基化(步骤c)和缩合形成NHS官能团(步骤d)。但是，同图l所阐述的现有技术不同，此醛基部分可以通过例如使用硼氢化物的还原反应而被破坏(步骤a)。在聚合物的另一端，这;同时将e同还原i羟基部分"反i会在4原端引入;:二醇)能"，该二醇官能团易于在第二个氧化反应步骤中被选择性氧化。当天然聚合物(连续地)被高碘酸盐氧化、被硼氢化物还原、第二次被高碘酸盐氧化、氨基化和缀合生成NHS化合物时，就生成了一种新的聚合物，这种聚合物是真正地单功能的，只在原来的还原端有一个单一的活性基团(即NHS基团)(图5)。图9和IO通过各种衍生物的缩合反应给出了蛋白质反应活性图解。单功能的PSA只会通过最外端的非还原端单一取向地连接到蛋白质上，且不能随意地交联蛋白。这种新反应方法的方案(图5)彻底不再需要从各种不需要的产物(图2所述)中将想要的产物纯化出来，因为在这种新的反应方案中完全不会再有不需要的产物。下面是附图的简要说明。图la为反应路线图，显示了活化非还原唾液酸末端单元的现有技术；图lb为反应路线图，显示了用蛋白-胺基部分来还原胺化反应路线图la的产物的醛基部分的现有技术；图2用示意图显示了副反应中潜在的副产物；图3的反应路线显示了PSA还原末端唾液酸单元的缩酮和闭环形式之间的互变异构；图4显示了还原端衍生化的NHS多聚乙酰神经氨酸(当非还原端没有邻二醇时)的制备；图5显示了还原端衍生化的NH广CA多聚乙酰神经氨酸(在非还原端移除邻二醇)的制备；图6显示了制备CA-NHS-蛋白缀合物的一般路线；图7a显示了衍生化的巯基多聚乙酰神经氨酸(CA-SH在非还原端)的制备；图7b用示意图显示了用NHS-马来酰亚胺通过CA-SH制备CA-蛋白质缀合物；图7c显示了用NHS-马来酰亚胺(AMAS)通过CA-SH制备CA-蛋白质缀合物；图8a显示了在还原端通过NHS制备CA-蛋白质缀合物；图8b显示了聚唾液酸还原端的帽化；图8c显示了非还原端衍生的CA的制备；图9显示了在非还原端用双(硫代琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)制备CA-蛋白缀合物；图IO显示了用交联剂DSG制备CA-蛋白缀合物的示意图；图11显示了按照实施例5分离的CA的凝胶渗透色谱(GPC)的色谱图；图12显示了CA-NHS-生长激素(GH)蛋白质缀合反应(CA35kDa)的尺寸排阻HPLC结果；图13显示了CA-NHS-GH缀合物的十二烷基At酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果；图14显示了未反应和反应的CA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)结果；图15显示了实施例10中CAH-NHS反应的SDS-PAGE分析结果；图16显示了图15中级分6的HPLC色i普图。实施例材料高捵酸钠和分子量标记来自SigmaChemicalLaboratory,UK。所用的CA，线性a-(2，8)-连接的大肠杆菌K1PSA(平均22.7kDa，多分散性(p.d.)1.34;39kDa，p.d.1.4;llkDa，p.d.1.27)来自Camida，Ireland。其他材料包括2,4二硝苯基肼(AldrichChemicalCompany,UK)，透析袋(3.5kDa和10kDa截留度(MedicellInternationalLimited,UK);琼月旨糖SPHiTrap，PD-IO柱(Pharmacia,UK);XK50柱和琼脂糖QFF(AmershamBiosciencesUK);三鞋曱基氨基曱烷-甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶(4-20°/。和16%)，三羟曱基氨基曱烷-甘氨酸-十二烷基硫酸钠电泳緩冲液和上样緩冲液(Novex，UK)。去离子水是从ElgastatOption4水纯化系统中得到的(ElgaLimited,UK)。所用的所有试剂均是分析纯。在蛋白或CA测定中，用微量滴定板读数器(DynexTechnologies,UK)进4亍分光光度法测定。方法蛋白和CA测定用间苯二酚法[Svennerholml957]定量测定CA,如唾液酸，关于间苯二酚法也可参考[Gregoriadiset.al.，1993;FernandesandGregoriadis，1996，1997]。用二辛可宁酸(BCA)色度法测定GH。实施例1-用IEC分级分离CA(CA,22.7kDa，p.d.1.34)[参照〗在XKS0柱中装入900ml琼脂糖QFF，并用3个柱体积的洗涂緩沖液平衡(20mM三乙醇胺；pH7.4)，流速50ml/min。通过注射口将CA(25克溶于200ml洗涤緩冲液)上样到柱上，流速50ml/min。然后用1.5倍柱体积(1350ml)的洗涤緩冲液洗柱。结合的CA用1.5倍柱体积的不同洗脱緩冲液洗脱(三乙醇胺緩冲液，20mMpH7.4，含有OmM至475mM的NaCl，按25mMNaCl递增)，最后用含有lOOOmMNaCl的同样緩冲液去除所有残余的CA和其它的残留物(如果有的话)。使用5kDa的膜(Vivascience，UK)通过高压超滤将样品浓缩至20ml。通过在4X:反复超滤，用去离子水换掉样品的緩冲液。用GPC(如实施例5所述)和非变性PAGE(用阿辛蓝染色；实施例8)分析样品的平均分子量和其他参数。用上述步骤制备的CA的窄级分被高碘酸钠氧化，并用GPC和非变性PAGE分析聚合物的总量变动。实施例2:CA的活化[参照]在20。C下将新鲜制备的0.02M的高碘酸钠(NaI04;摩尔数比CA过量6倍)溶液与CA混合，并且在黑暗中将反应混合物磁力搅拌15分钟。氧化的CA用70%(终浓度)的乙醇沉淀，并且用3000g将混合物离心20分钟。除去上清，将沉淀用最少量的去离子水溶解。CA再次被70。/0乙醇沉淀，然后用12，000g离心。将沉淀用最少量的去离子水溶解，冻千并在-2(TC下储存备用。实施例3:测定CA和^"生物的氧化态[参照]用2，4-二硝苯基肼(2，4-DNPH)定量测定CA氧化度，2，4-二硝苯基肼与羰基化合物相互作用会生成少量可溶的2，4-二硝苯基腙。在2，4-DNPH试剂(1.0ml)中加入未氧化的CA和氧化的CA(CAO)(各5mg)，振荡溶液然后置于37。C下直到观察到晶体沉淀[Shrineret.al.，1980]。利用一种基于在碱性溶液中将氰化铁离子还原为亚铁氰化铁(波斯蓝)的方法[ParkandJohnson,1949]测定了(定量的)CA的氧化度，在630mn处测定。在本实施例中，用葡萄糖作为标准。实施例4a:胺基多聚乙酰神经氨酸(CA-NH2)的制备[参照]用含有过量300倍的摩尔数的NHX1的2ml去离子水，溶解10-100mg/mlCAO，并置于50ml管中，然后加入NaCNBH4(在INNaOH水溶液中的5M储液)至终浓度为5mg/ml。混合物在室温下孵育5天。同样也制备了用多聚乙酰神经氨酸代替CAO的参照溶液。通过加入5ml水冻乙醇，将产物多聚乙酰神经氨酸胺基衍生物沉淀下来。在室温下，用台式离心4几4000rpm离心30分4中来回收沉淀。在2ml去离子水中重悬沉淀，然后在10ml的超速离心管中用5ml水冻乙醇重新沉淀。在室温下，用30，OOOrpm离心30分钟收集沉淀。沉淀再次在2ml去离子水中重悬并冻干。实施例4b:测定胺含量用TNBS(间三硝基苯磺酸，即2，4，6-三硝基-苯磺酸)测定法来测定产物中的氨基基团的含量[Satakeet.al.，I960]。在微量滴定板的孔中，将TNBS(0.5p1的15mMTNBS)加到90p1的0.1M、pH9.5的硼酸盐緩冲液中。再加入10m150mg/ml的CA-amine溶液。将平板在室温下放置20分钟，然后在405nm处读取吸光度。用浓度范围在0.1到lraM之间的甘氨酸作为标准。TNBS将伯胺基团转化为三硝基苯的形式。检测到了胺基的TNP加成产物。用TNBS测定法测定经双冷乙醇沉淀法纯化的产物的结果表明，转化率接近85%。实施例4c:多聚乙酰神经氨酸-SH的制备通过实施例4a所述的还原氨基化作用，用胱胺来衍生化氧化的CA，与实施例4a不同的是，此时用摩尔数过量IOO倍的胱胺代替了NH4C1。在纯化产物之前，在37。C下用50mMDTT处理1小时。还原产物用双乙醇沉淀法和在琼脂糖G25上进行的尺寸排阻色谱。另一个例子中，将实施例4a中制备的CA冊2溶于含lmMEDTA的10mM、pH8.0的PBS中。加入摩尔数过量50倍的2-亚氨瘗吩烷，反应在"。C下进行1小时。通过在交联葡聚糖凝胶G25柱上进行凝胶过滤来除去未反应的2-亚氨硫醇盐，该交联葡聚糖凝胶G25柱是用反应緩冲液平衡的。用Ellman的测定法估测了巯基含量。简而言之，将15yl样品同150Ml含有0.08mg/ml5,5，-双硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、O.IM磷酸、lfflMEDTA，pH8的溶液混合。在室温下反应30分钟，并在405mn处读取吸光度。产物适合用于图7b和7c的反应路线中所示的反应。此外，发现聚合物的巯基含量为60%。实施例4d:CA-NHS的制备将前面参照实施例4a中合成的CA-NH2(3SkDa)(1S-:20mg)溶于0.15PBS(350jul，PH7.2)中，然后加入含有50或75摩尔当量BS3的PBS(150/al，pH7.2)。将混合物涡旋5秒钟，然后在20。C下反应30分钟。用PD-10柱纯化CA-NHS产物，并用PBS(pH7.2)作为洗脱液。所得产物立即用于蛋白质和肽中NH2基团的定位缀合。通过用间苯二朌测定法分析唾液酸的含量，可以测定PD-10级分中的CA浓度。通过用紫外分光光度计在260認处分析CA和NHS反应溶液，以及在254nm处用薄层色语显镨，可以测定CA聚合物的NHS含量。将上面实施例4a中合成的CA-NH2(35kDa)(15-20mg)溶于加入了DMSO(300-285ji1)的最少量的水中(50-65|a1)，或在加热的情况(100-125°C)下溶于>95%的DMSO(350p1)中。在CA-NH2溶液中加入含有75摩尔当量DSG的DMSO(150L)，涡S走5秒钟，然后在2(TC下反应30分钟。CA-NHS产物是用二噁烷沉淀(2次)纯化，或是用PBS(7.2)作为洗脱液在PD-10柱上纯化。所得产物立即用于蛋白质和肽中冊2基团的定位缀合。同前面一样，用间苯二酚测定法测定PD-10级分的CA浓度。用紫外分光光度计(260nm)和薄层色谱(254nm)测定CA聚合物的NHS含量。实施例5:CA样品的凝胶渗透色谱[参照]CA(35kDa)样品溶于含NaN03(0.2M)的CH3CN(10%;5mg/ml)中，并在2xGMPWn柱上用色谱法分离，通过折光率(GPC系统VE1121GPC溶剂泵，VE3590Rl检测器)检测，并用Trisec3软件(ViscotekEuropeLtd)校正。才羊品(5mg/ml)用0.45/am尼龙膜过滤，以0.7cm/min的速度过柱，0.2MNaN03和CH3CN(10%)作为流动相(图11)。实施例6:CA-NHS-蛋白缀合物的制备(用BS"和DSG)将溶于碳酸氢钠中(23mg/ml，pH7.4)的GH共价地连接到CA-NHS(35kDa)上，CA-NHS是在实施例4b中使用过量的BS、'j备的。反应于20。C下在0.15MPBS(pH7.2;1.5ml)中进行了30分钟，CA-NHS:GH的摩尔比率为25:1或50:1。用SDS-PAGE鉴定聚唾液酸化的GH,并且用HPLC-尺寸排阻色i普鉴定缀合产物。对照包括在不含任何CA-匪S的情况下，用BS'对天然蛋白质进行缀合反应。也包括在不含天然GH的情况下，用BS"对CA-冊2进行缀合反应。将溶于碳酸氢钠中(pH7.4)的GH共价地连接到CA-冊S(35kDa)上，该CA-NHS是根据实施例4b所述使用过量的DSG制备的。反应于20。C下在0.15MPBS(pH7.2;1.5ml)中进行了30分钟，CA-NHS:GH的摩尔比率为50:1。用SDS-PAGE鉴定聚唾液酸化的GH，并且用HPLC-尺寸排阻色谱鉴定缀合产物。对照包括在不含任何CA-NHS的情况下，用DSG对天然蛋白质进行缀合反应。实施例7.CA-NHS-GH缀合物的HPLC-SEC将CA-GH缀合物溶于碳酸氢铵緩沖液(0.2M;pH7)，用superpose6柱层析并用紫外线指数检测(Agilent,10/50system,UK)。样品(lmg/ml)用0.45尼龙膜过滤，上样175pl，样品以0.25cm/min的速度过柱，碳酸氢铵緩冲液作为流动相(图12)。实施例8.CA和CA-GH缀合物的SDS和非变性PAGE采用SDS-PAGE(MiniGel，VerticalGelUnit,powersupplymodelConsortE132;VWR，UK)来检测在聚唾液酸作用后产生的GH分子大小的变化。从反应混合物和方法对照(未氧化的CA)中取出O分钟(对照)和30分钟时的GH及其缀合物(带有CA-NHS)样品，进行SDS-PAGE，所用凝胶为4-20%的聚丙烯酰胺凝胶。对照宽量程的分子量标记对样品进行了校准(图13和14)。结果成功地将CA(22.7kDa)及其衍生物分级分离成为占总体百分比不同的、平均分子量最高到46kDa的、多分散性不到1.1的各种窄级分。表2示出了分离22.7kDa物质的结果表2:CA22.7(pd1.3)的离子交换色语<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>未实验本方法是规模可变的，基质变化范围在1ml至900ml之间的每个规模，分级分离图几乎相同(没有示出全部结果)。较大聚合物(CA，39kDa,pd1.4)的分级分离产生最高可达90kDa的产物。本方法甚至可以成功地用于分级分离大批的聚合物。结果表明离子交换的级分是窄分散的，这与GPC的结果一致。所有的窄级分都成功地被20mM高碘酸盐氧化。从本生产方法的不同阶段取样，并用GPC和非变性PAGE分析，结果表明分子量和多分散性没有变化。CA，一种PSA，是一种线性oc-2，8-连接的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)残基同聚物(图la)。利用在碱性溶液中将氰化铁离子还原为亚铁氰化铁(波斯蓝)的方法[ParkandJohnson,1949]定量地测定CA的氧化态，用葡萄糖作为标准。同天然聚合物相比，氧化的CA具有100mol"/n的表观醛基含量。用氰化铁定量测定氧化过程中CA中间产物的结果与用2，4-DNPH定性测定的结果一致，2，4-DNPH会与天然CA生成暗黄色沉淀，并且与含有醛基形式的聚合物生成亮橙色，导致在室温下反应10分钟后生成亮橙色沉淀。用高碘酸盐和硼氢化物处理后，用GPC分析了内cx-2，8-连接的Neu5Ac残基的完整性。将氧化CA(CA0),胺基CA(CA-NH2),CA-NHS物质的色谱图同天然CA的色谱图进行比较。发现(图12)所有的CA都表现出几乎同样的洗脱曲线，没有证据表明各个步骤会？I起聚合物链的明显地片段化或交联(对于CA-NHS)。小峰代表了緩冲液中的盐。用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析了CA-GH缀合物的形成。对于用DSG的缀合反应，SDS-PAGE表明没有剩余的游离GH且缀合反应进行完全。SEC-HPLC确认了这一结果，因为在游离GH的预期洗脱时间之前，CA-GH被洗脱下来(没有观察到游离GH的峰)。另一方面，使用BS3的CA-NH2到GH缀合反应的SDS-PAGE分析表明存在游离的GH，这一结果被SEC-HPLC确认，SEC-HPLC在大约70分钟处出现了一个游离蛋白的洗脱峰。此外，SEC-HPLC测得的缀合度为53%处。结果(图13)表明在缀合物泳道有条带移位，这通常表明同GH相比，聚唾液酸化GH的质量增加。此外，通过SEC-HPLC把GH缀合物分成了不同的种类。实施例9:多聚乙酰神经氨酸酰肼(CAH)的制备[参照]在400ju1、pH5.5的20mM乙酸钠緩冲液中，50mg的氧化的多聚乙酰神经氨酸(19kDa)与2.6mg的肼(液体)25。C下反应2小时。然后用70%乙醇沉淀多聚乙酰神经氨酸。将沉淀重溶于350pl、pH7.4的磷酸盐緩冲液，且加入NaCNBH3至5mg/ml。在25"C下，混合物反应4小时，然后冷冻过夜。用装有交联葡聚糖G25的PD10柱，用0.15M冊4HC03作为流动相，通过凝胶渗透色语除去NaCNBH3和反应副产物。级分(每份0.5ml)用TNBS测定法分析(氨基基团特异性的；如前面所述)。级分6、7、8和9(外水体积级分)具有明显高于本底的较强信号。由于NH/离子的存在，本底较高。级分6、7、8和9也含有多聚乙酰神经氨酸。将这四个级分进^于冻干来回收CA-酰肼(CAH)。实施例10:多聚乙酰神经氨酸NHS(CA-NHS)和多聚乙酰神经氨酸-蛋白质缀合物的制备室温下，在400julPBS(pH7.4)中，10mg的19kDaCA-酰肼和9mg的BS'反应30分钟。反应混合物上样到装有交联葡聚糖G25的PD10柱上，收集0.5ml级分。向5到9之间的每个级分中加入0.lmgBSA。室温下》文置2小时后，级分与BSA发生反应。用SDS-PAGE和SECHPLC分析这些样品。级分几乎没有多聚乙酰神经氨酸。除了存在同其他样品和BSA—样的条带之外，多聚乙酰神经氨酸富集的级分(6和7)还有一个蛋白质条带，这是缀合物存在的明证(图15)。级分6的HPLC色谱图表明，同缀合反应游离蛋白相比，缀合物的保留时间有大的改变(图16a和b)。所用的BSA含有杂质。BSA的峰在56分钟处(图16a)。除了存在56分钟的峰外，还有作为缀合物的较大的种类。在80分钟处有个大峰，这是CA-NHS与蛋白质反应时释放出的NHS。这个峰不可能是游离的BS3，因为已经将CAH通过了凝胶渗透色谱柱，这一步会除去游离的BS3。这强烈地表明了在CA分子上形成了一个NHS酯基团(图16b)。参考文献Bendele，A.，Seely,丄，Richey'C.，Sennello，G.,Shopp，G.,Renaltubularvacuolationinanimalstreatedwithpolyethylene-glycolconjugatedproteins,Toxicologicalsciences,42(1998)152-157.Beranova,M.，Wasserbauer，R,,Vancurova，D.,Stifter，M.，Ocenaskova，丄，Mora,M.'Biomaterials，"(2000)521-524.Brocchini，S.'Polymersinmedicine:agameofchess.DrugDiscoveryToday,8，(2003)1"-112.Carlsson，丄，Drevin，H.AndAxen'R.,BiochemJournal,173,(1978)，723-737.ChengT'Wu,M.，Wu,P.，Chern，J，Roffer,SR.,Acceleratedclearanceofpolyethyleneglycolmodifiedproteinsbyanti-polyethyleneglycolIgM.Bioconjugatechemistry,10(1999)520-528.Cho，丄VV.andTroy,F.A.,PSAengineering:SynthesisofpolysialylatedneoglycosphingolipidbyusingthepolytransferasefromneuroinvasiveE,co//K1,ProceedingsofNationalAcademicSciences,USA,91(1994)11427-11431.Convers，C.D.，Lejeune，L.,Shum，K.,Gilbert,C.，Shorr，R.G丄,Physiologicaleffectofpolyethyleneglycolconjugationonstroma-freebovinehemoglobinintheconsciousdogafterpartialexchangetransfusion,Artificialo[gan,21(1997)369r3Z8"Dyer,丄R.，Useofperiodateoxidationinbiochemicalanalysis,MethodsofBiochemicalAnalysis,3(1956)111-152.Fernandes，A丄，Gregoriadis，G.,Polysialylatedasparaginase:preparation,activityandpharmacokinetics'BiochimicaetBiophysicsActa,1341(1997)26-34.Femandes，A丄，Gregoriadis,G.,Synthesis,characterizationandpropertiesofpolysialylatedcatalase，BiochimicaetBiophysicsActa,1293(1996)92-96.Fernandes,A丄，Gregoriadis,G.，Theeffectofpolysialylationontheimmunogenicityandantigenicityofasparaginase:implicationsinitspharmacokinetics,InternationalJournalofPharmaceutics,217(2001)215-224.Fleury,P.,l_ange，丄，Surl'oxydationdesacidesalcoolsetdessucrespar卩acidperiodique,ComptesRendusAcademicSciences,195(1932)1395-1397.Furuhata,TrendsinGlycosci.Glycotech.2004,18(89)143-169.Gregoriadis,G.,Drugandvaccinedeliverysystems,in:PharmaTech，-WorldMarketsResearchCentreUmited，London(2001)172-176.Gregoriadis,G.,Fernandes，A.，McCormack,B.，Mrtal,M.，Zhang,X，Polysialicacids:Potentialforlongcirculatingdrug,protein,liposomeandothermicroparticleconstructs,inGregoriadis,GandMcCormack,B(Eds),TargetingofDrugs,StealthTherapeuticSystems,PlenumPress,NewYork(1998)193-205.Gregoriadis,G.，Fernandes,A.,Mital，M.，McCormack,B.，Polysialicacids:potentialinimprovingthestabilityandpharmacokineticsofproteinsandothertherapeutics,CellularandMolecularLifeSciences,57(2000)1964-1969.Gregoriadis,G.，McCormack,B,，Wang,Z.，Lifely,R.，Polysialicacids:potentialindrugdelivery,FEBSLetters,315(1993)271-276.Hermanson,G.T.,Bioconjugatetechniques,Acadamicpress,London,1995.Hreczuk-Hirst，D.，Jain，S,，Genkin，D.，Laing,P.,Gregoriadis,G.,Preparationandpropertiesofpolysialylatedinterferon誦a隱2b，AAPSAnnualMeeting，—2002,一Iomnto，一Canada，-M-1.056-Hunter,A.C,Moghimi，S.M.,Therapeuticsyntheticpolymers:agameofRussianRoulette.DrugDiscoveryToday,7(2002)998-1001.Jain，S.，Hirst,D.H.，McCormack,B.，Mital,M.，Epenetos，A.,Laing,P,'Gregoriadis,G.，Polysialylatedinsulin:synthesis,characterizationandbiologicalactivityinvivo,Biochemicaet.BiophysicaActa,1622(2003)42-49.Jain,S.,Hirst,D.H.,Laing，P.,Gregoriadis,G.，Polysialylation:Thenaturalwaytoimprove.thestabilityandpharmacokineticsofproteinandpeptidedrugs,DrugDeliverySystemsandSciences,4(2)(2004)3-9.Jennings,H.丄'Lugowski'C.'lmmimogenicityofgroupsA,B，andCmeningococalpolysaccharidetetanustoxoidconjugates,JournalofImmunology,127(1981)1011-1018.Jennings,H.丄，a/in丄Immunol.(1986)137，1708-1713.Lifely'R.,Gilhert，A.S.,Moreno,C.C.,SialicacidpolysaccharideantigenofA/e/sse厂/a;eA7/"gr歸'sandEsc/7e厂/c//aco//:esterificationbetweenadjacentresidues,CarbohydrateResearch,94(1981)193-203.Mital，M.,Polysialicacids:aroleforoptimizationofpeptideandproteintherapeutics,Ph.D.Thesis,UniversityofLondon,2004.Muflenhoff，M.,Ectehardt,M.,Gerardy-Schohn，R.，Polysialicacid:three-dimensionalstructure,biosynthesisandfunction,CurrentopinionsinStructuralBiology,8(1998)558-564.Park,丄T.，Johnson,M.丄，Asubmicrodeterminationofglucose,JournalofBiologicalChemistry,181(1949)149-151.Pawlowski,A,a/.Vaccine17(1999)1474-1483.Roth，丄，Rutishauser，U.，Troy，F.A.(Eds.),Polysialicacid:frommicrobestoman,Birkh3userVerlag,Basel,AdvancesinLifeSciences,1993.Rutishauser,U.,Polysialicacidasregulatorofcellinteractionsin:R.U.MorgolesandR.K.Margalis(eds.)，NeurobiologyofGlycoconjugates,pp367-382，PlenumPress,NewYork,1989.Satake,K.,et.al.,丄Biochem.,47，654，(1960).Shriner，R.L，Fuson，R.D.C.，Curtin,D.Y.'Morill,T.C.'TheSystematicIdentificationofOrganicCompounds,6thed.，W"ey，NewYork,1980.Svennerholm,L.,QuantitativeestimationofsialicacidII:Acolorimetricresorcinol-hydrochloricacidmethod,BiochimcaetBiophysicaActa,24(1957)604-6".Troy,F.A.Polysialylationofneuralcelladhesionmolecules,TrendsinGlycoscienceandGlycotechnology,2(1990)430-449.Troy,F.A.，Polysialylation:Frombacteriatobrain,Glycobiology,2(1992)1-23.权利要求1.一种化合物，包括至少一个末端单元是衍生自一个唾液酸单元的一种聚唾液酸(PSA)底物，所述唾液酸单元包括在它的2或7位碳原子上连接的N-羟基琥珀酰亚胺酯，任选地通过接头连接。2.根据权利要求1的化合物，其中每个末端单元均衍生自包括N-羟基琥珀酰亚胺酯的一个唾液酸单元。3.根据权利要求1或权利要求2的化合物，所述化^具有通式I、n或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中W为H或硫酰；R2为一个连接基团；A为NR5、NR5NR6、0或S，其中115和116独立地选自H、Ch^J^p芳基；SylO为一个唾'液酸基团；n为1—100，m为0-100;R3为氢或一种单-、双-、寡聚-或多聚唾液酸基团、一种蛋白、一种肽、一种脂质、一种药物、一种细胞膜或细胞壁组分或一种药物送递系统;以及114为氢或一种单-、双_、寡聚-或多聚唾液酸基团、一个烷基、一个酰基、一种药物或一种药物送递系统。4.根据权利要求3的化合物，其中R2选自亚;^、亚芳基、亚烷芳基、杂亚芳基、M-杂亚芳基，它们中^^T一个都可以由硫代酸酯、酯、胺或^#:所连接，且其中A为服5或为通过NRS基团连接到^余下部分上的一个连^^基团。5.—种方法，其中任选地在末端唾液酸预衍生化步骤之后，PSA底物与一种双功能试剂反应，所述双功能试剂的功能之一为NHS酯，且另一功能视所处反i务降应:得该试剂和i液酸基团可以发i共:缀合且NHS基团保持不变。6.根据权利要求5的方法，其中底物中的唾液酸单元经过预备步骤的处理，并在该步骤中生成一个胺基基团。7.根据权利要求6的方法，其中唾液酸单元为一个还原末端单元，且预备步骤包括下列步骤a)通过还原作用打开还原末端唾液酸单元的环，以生成邻二醇基团；b)选择性地氧化步骤a)中生成的邻二醇基团，以生成醛基基团c)用^ft合物通过还原性募基化作用将步骤b)中醛J^基团转化为M基团，例如，使用^硼氲化物；和d)用过量的同双功能NHS试剂与步骤c)的^^基团^。8.根据权利要求6的方法，其中在非还原末端含有末端唾液酸的唾液^始原料经过如下处理步骤e)选择性氧化步骤，将在C-7,C-8邻二醇基团处的非还原末端唾液酸单元氧化，在7位碳原子上生成醛；步骤c)用^f匕^4勿通itii原性M^化作用将步骤e)中生成的醛基基团转化为氨基基团；以及步骤d)对所得的氨基基团进行修饰。9.根据权利要求8或9的方法，其中冊S试剂选自双[2-琥珀酰亚l氧基絲M0乙基]砜(BS0C0ES)，双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS3)，双琥多白酰亚胺基戊二酸酯(DSG),^U;U义双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)，双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)，双琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)或其硫代类似物，3,3，-XSU危代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)，和乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)和其硫代类似物。10.根据权利要求9的方法，其中使用NHS试剂的反应为在非质子溶剂中进行的。11.根据权利要求5的方法，其中底物中的唾液酸单元经过预备步骤的处理，在该步骤中生成一个巯基基团。12.根据权利要求ll的一种方法，其中NHS试剂选自N-(oc-马来酰亚胺乙酰氧)琥珀酰亚胺酯，(AMAS)，N-(马来酰亚胺丙酰氧)琥珀酰亚胺酯，(BMPS)，N-(g-马来酰亚胺辛酰氧)琥珀酰亚胺酯，(EMCS)，或其硫代类似物，N-(Y-马来酰亚胺丁酰氧)琥珀酰亚胺酯，(GMBS),或其辟u代类似物，琥珀酰亚H(N-马来酰亚胺曱基)-环己烷-l-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，或其疏代类似物，琥珀酰亚l4-(N-马来酰亚胺曱基)-环己烷-l-羧基酯)或其辟u代类似物，琥珀酰亚胺-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)或其辟u代类似物，琥珀酰亚^~6_(P-马来酰亚l丙^ttJO己酸酯(SMPH)，N-(k-马来酰亚胺-十一酰基氧)石克代琥珀酰亚l酯U危代-KMUS)，琥珀酰亚胺-6-[3，2(2-吡咬^^克基)丙酰氨基]己酸酯(LC-SPDP)或其碌"戈类似物，4-琥珀酰亚胺氧a^-曱基-ot-(2-p比咬J^克基)曱苯(SMPT)，N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡咬J^E克基)丙酸酯(SPDP)，N-琥珀酰亚胺[4-乙烯砜]苯曱酸酯(SVSB)，琥珀酰亚l3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)，和N-琥珀酰亚胺-多典乙酸酯(SIA)和N-琥珀酰亚胺(4-硪乙醃基)M苯曱酸酯(SIAB)或其石jU戈类似物。13.—种衍生化方法，其中具有伯胺基团的生物学有用的化合物与根据权利要求1至4中任一项的一种化合物反应，或与根据权利要求5至11中任一项的方法的产物反应，所处^^应^H吏得在N-琥珀酰亚胺氧基团被取代后，胺基的活性氢被余下的酰基基团取代。14.才Nt权利^"求13的方法，其中生物学有用的分子为蛋白质或肽，其伯胺基团为N-末端或为一个赖氨酸单元的y-胺基基团。全文摘要合成了PSA衍生物，其中还原和/或非还原端的末端唾液酸被转化为N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团。所述衍生物可以与例如含有胺基或肼基团的底物反应，形成未交联/交联的聚唾液酸化合物。所述底物可以例如是有治疗用途的药物、肽或蛋白质或药物送递系统。文档编号C08B37/00GK101160326SQ200680012749公开日2008年4月9日申请日期2006年2月16日优先权日2005年2月23日发明者I·帕佩奥安诺,S·杰因,S·索伯翰尼申请人:利普生技术有限公司