生物可降解的交联支链聚(亚烷基亚胺)的制作方法

专利名称：生物可降解的交联支链聚(亚烷基亚胺)的制作方法
技术领域：
本发明涉及交联聚合物及其药物组合物，并且涉及使用和制备所述交联聚合物 和组合物的方法。
背景技术：
基因治疗的成功依赖于基因输送体系有效且安全地将治疗基因输送至靶标组织 的能力。基因输送体系可以分为病毒型和非病毒型(或质粒DNA型)。目前被用于当 今临床中的基因输送技术可以被看作第一代，其中这些技术用于通过细胞固有的化学、 生化和分子生物学性质来转染或感染靶标细胞的能力。然而，单单依赖于这些性质限制 了治疗性应用。例如，已将能够感染哺乳动物细胞的病毒有效地用于具有高转导效率的 基因转移。然而，在将病毒体系用于临床应用后出现了严重的安全顾虑(例如，宿主的 强免疫响应和诱变的可能性)。基于“裸DNA”或合成的质粒DNA的非病毒基因输送体系具有潜在的优于病 毒载体的益处，这是由于使用的简单性并且不会刺激特定的免疫响应。许多合成的基因 输送系统已据描述可克服裸DNA的限制，包括阳离子脂、肽和聚合物。尽管早期对此乐 观，但阳离子脂型体系的临床相关性因其较低的效率、毒性和顽固性性质而受到限制。另一方面，聚合物作为对于当前体系的可行替代物出现，因为其优异的分子灵 活性使得可以进行复杂的修饰和引入新的化学方法。阳离子聚合物(例如，聚(L-赖氨 酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)和聚亚乙基亚胺(PEI))作为基因输送候选物已被广 泛研究，因其能够缩合DNA、提高DNA稳定性和跨膜输送。阳离子聚合物的转染效率 受其分子量的影响。高分子量(> 20kD)的聚合物的转染效率大于较低分子量的聚合 物。然而，高分子量的聚合物也具有更大的细胞毒性。已进行过若干尝试来规避这个 问题并在不增加阳离子聚合物的细胞毒性的情况下改善其转染活性。例如，Lim等已通 过熔融缩合合成了一种可降解聚合物聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸](PAGA) (Pharm. Res. 17 811-816，2000)。虽然PAGA已被用于一些基因输送研究中，其实际应用因低转 染活性和较差的水溶液中的稳定性而受到限制(JControlled.Rel.88 : 33-342，2003 ； Gene Ther. 9 1075-1084，2002)。已通过熔融缩合或通过二环己基碳二亚胺(二甲基氨基) 吡啶(DCC/DMAP)活化的缩聚从Cbz-4-羟基-L-脯氨酸合成了 PHP酯(J. Am.Chem. Soc.121 5633-5639，1999 ； Macromolecules 32 3658-3662，1999)。已利用二(2-甲 氧基羰基乙基)[三( 羟甲基)甲基]胺的羟基与羧基之间的本体缩聚并继以与6-(Fmoc-氨 基)己酸的缩合来合成了网状聚(氨基酯)(n-PAE) (Bioconjugate Chem.13 952-957， 2002)。这些聚酯已显示出可缩合DNA并以低细胞毒性转染细胞，但其在水溶液中的稳定性较差。


发明内容
在一方面，本发明提供了分子间交联的聚(亚烷基亚胺)，其由具有伯氨基、仲 氨基和叔氨基的支链聚(亚烷基亚胺)单元组成，所述单元通过聚(亚烷基亚胺)单元中 的伯氨基和具有生物可降解键的短链连接子彼此共价交联，其中至少一个伯氨基氮任选 地被保护，且至少一个单元任选地与靶向配体、显像剂和/或亲脂基团键合。在另一方面，本发明提供了一种支链聚(亚烷基亚胺)化合物，其基本所有伯氨 基氮原子都由第一保护基保护，且其基本所有仲氨基氮原子都由第二保护基保护。在再一方面，本发明提供了一种支链聚(亚烷基亚胺)化合物，其基本所有伯氨 基氮原子都未经保护，且其基本所有仲氨基氮原子都被保护。在又一方面，本发明提供了一种具有多个伯氮原子和仲氮原子的支链聚(亚烷 基亚胺)化合物，其中(a)基本所有仲氨基氮原子都由保护基保护；(b)伯氨基氮原子为(i)未经保护；或( )被保护；或(iii)与R1键合，其中R1是亲脂基团、靶向配体和/或显像剂；且至少一个伯氮被保护，且至少一个伯氮原子与R1键合。在另一方面，本发明提供了包含本发明的交联聚(亚烷基亚胺)和核苷酸分子的 药物组合物。在某些方面，所述核苷酸是小RNA分子。本发明还提供了制备本发明的交联聚(亚烷基亚胺)的方法。所述方法包括(a) 将支链聚(亚烷基亚胺)内的至少约50%的仲氮原子可逆地封闭以形成经保护的支链聚 (亚烷基亚胺)；和(b)将所述经保护的支链聚(亚烷基亚胺)与具有生物可降解键的短 链连接子交联。如果需要，可以在交联后将经保护的支链聚(亚烷基亚胺)单元脱保护。在另一方面，本发明提供了其它的制备本发明的交联聚(亚烷基亚胺)的方法。 这些方法包括(a)将支链聚(亚烷基亚胺)内的至少约75%的伯氮原子可逆地封闭以形成 伯氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)；(b)将所述伯氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)内 的至少约50%的仲氮原子可逆地封闭以形成伯氮和仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)； (C)将所述伯氮和仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)脱保护以形成仲氮被保护的支链聚 (亚烷基亚胺)；和(d)将所述仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)与具有生物可降解键 的短链连接子交联以形成交联支链聚(亚烷基亚胺)。如果需要，可以在交联后将保护基 从交联的支链聚(亚烷基亚胺)除去。此外，如果需要，还可以对交联的支链聚(亚烷基亚胺)进行修饰以带有靶向配 体、显像剂和/或亲脂基团；这通常通过在交联之前经保护的前体与此类适当试剂反应 而实现。本发明还提供了由本发明的方法制备的交联支链聚(亚烷基亚胺)。当在处于生理学pH以下的制剂中的水性介质中时，本发明的交联支链聚(亚烷 基亚胺)通常以阳离子形式存在。换言之，某些可利用的氮原子将处于阳离子形式，即质子化形式。


图1显示了证实SiRNA与根据本发明的另一个方面的聚合物的复合的电泳结 果；

图2A和2B显示了描述与根据本发明的再一个方面的适宜对照相比的GAPDH或 荧光素酶活性的数据图；图3显示了描述与本发明的又一方面的对照SiRNA复合物相比用基于支链PEI的 交联聚合物制备的SiRNA复合物的VEGF表达的数据图；图4显示了描述与本发明的再一方面的对照SiRNA复合物相比用基于支链PEI的 交联聚合物制备的SiRNA复合物的VEGF表达的数据图；图5显示了描述与本发明的另一方面的对照SiRNA复合物相比采用以基于支链 PEI的交联聚合物制备的SiRNA复合物对ApoB转录物的抑制的数据图；和图6A和6B显示了描述与已用本发明的再一方面的非静默siRNA制剂注射的对 照小鼠中的GAPDH水平相比，在静脉注射用于本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)配制 的GAPDH siRNA后小鼠的肺和肝组织中的GAPDH表达的数据图。图7是描述在静脉注射用本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)配制的GAPDH siRNA与非静默siRNA制剂后在小鼠的肺和脾脏中的VEGF转录水平的数据图。
具体实施例方式在公开和描述本发明之前，应该理解的是本发明不限于本文公开的特定的结 构、方法步骤或材料，而是如相关领域中的普通技术人员所认识的那样扩展至其等价 物。应该理解，本文所采用的术语仅用于描述特定的实施方式的目的而并非旨在进行限 制。必须注意，如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“a”、"an"和 “the”包括复数形式，除非上下文中明确地另外声明。因此，例如，对含有“一个分
子”的聚合物的指代包括对具有一个或多个此类分子的聚合物的指代，而对于“一个抗 体”的指代包括对于一个或多个此类抗体的指代。定义在描述和要求本发明时，将根据下文所述的定义来使用以下术语。如本文所用，术语“进行转染”和“转染”是指将核酸从细胞的外环境运送至 细胞内环境，具体指细胞质和/或细胞核。不受任何特定理论的限制，应该理解的是核 酸可以在被包封在聚合物复合物内或附着于聚合物复合物之后被输送至细胞或者由聚合 物复合物携带而输送至细胞。具体的转染实例将核酸输送至细胞核。如本文所用，“受试对象”是指可以受益于本发明的药物组合物或方法的施用 的哺乳动物。受试对象的实例包括人类，并且还可包括其它动物，如马、猪、牛、狗、 猫、鼠和水栖哺乳动物。如本文所用，“组合物”是指两种以上的化合物、元素或分子的混合物。在某 些方面，术语“组合物”可以用于指代核酸和输送体系的混合物。
如本文所用，“小”在用于指代核苷酸序列时是指核苷酸链长在一方面为约 17 30碱基对或在另一方面为10 100碱基对的核苷酸序列。如本文所用，术语“施用”、“进行施用”和“输送”是指将组合物呈递至受 试对象的方式。施用可以通过各种本领域已知途径如口腔、胃肠外、透皮、吸入和植入 而实现。因此，口服施用可以通过吞咽、咀嚼、吮吸包含组合物的口服剂型而实现。胃 肠外施用可以通过将组合物于静脉内、动脉内、肌内、关节内、鞘内、腹膜内、皮下、 肿瘤内和颅内注射而实现。用于此类用途的可注射物可以以常规形式制备，或作为液体 溶液或悬浮液，或适于在注射前在液体中制备为溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳化 液。另外，透皮 施用可以通过将透皮组合物涂布、贴附、滚涂、粘附、倾洒、按压和涂 抹在皮肤表面而实现。这些和其它施用方法是本领域中所公知的。可以用于施用的合适 赋形剂包括例如水、盐水、右旋葡萄糖、甘油和乙醇等；和必要时的少量辅助性物质， 如润湿剂或乳化剂和缓冲剂等。如本文所用，术语“核苷酸序列”和“核酸”可以交换使用，并且指代DNA 和RNA以及其合成同类物。核酸的非限制性实例可包括编码蛋白的质粒DNA、生成抑 制性RNA的核苷酸序列、单链或双链、错义、反义、无义的合成序列以及控制蛋白、肽 和核酸生成的开关和速率调节核苷酸。另外，核酸还可以包括但不限于基因组DNA、 cDNA、RNAi> siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、rRNA、微 RNA 以及杂交序列或者合 成或半合成序列。另外，核酸可以来自天然或人工来源或两者。在一方面，核苷酸序 列还可以包括对治疗性蛋白的合成或抑制进行编码的核苷酸序列。此类治疗性蛋白的非 限制性实例可以包括抗癌剂、生长因子、降血糖剂、抗血管生成剂、细菌抗原、病毒抗 原、肿瘤抗原或代谢酶。抗癌剂的实例包括白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素 7、白细胞介素12、白细胞介素15、干扰素α、干扰素β、干扰素Y、集落刺激因子、 粒细胞-巨噬细胞刺激因子、抗血管生成剂、肿瘤抑制基因、胸苷激酶、eNOS、iNOS、 p53、pl6、TNF- α , Fas抗体、突变的癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。在另 一方面，质粒DNA可以编码RNAi分子，所述RNAi分子被设计来抑制参与肿瘤细胞或其 它过度增殖细胞的生长或维持的蛋白。此外，在某些方面，质粒DNA可以同时编码治疗 性蛋白和一种或多种RNAi分子。在其它方面，核酸还可以是质粒DNA和合成RNA(包 括正义RNA、翻译RNA和核酶)的混合物。另外，核酸可以具有从寡核苷酸到染色体 的不同尺寸。这些核酸可以来自人类、动物、植物、细菌、病毒或合成来源。其可通过 本领域技术人员已知的任何技术获得。如本文所用，术语“肽”可以用于指代包含通过一个氨基酸的羧基与另一个氨 基酸的氨基连接的两个或多个氨基酸的天然或合成分子。本发明的肽不受长度限制，因 此“肽”可以包括多肽和蛋白。有益性肽的非限制性实例包括催产素、加压素、促肾上 腺皮质激素、表皮生长因子、催乳素、促黄体素释放素或促黄体激素释放激素、生长激 素、生长激素释放因子、胰岛素、生长抑素、胰高血糖素、干扰素、胃泌素、四肽胃泌 素、五肽胃泌素、尿抑胃素、胰泌素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧张素、肾素、 缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、粘杆菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽和它们的合成类似物、 修饰物和药理学活性片段、以及单克隆抗体和可溶性疫苗。如本文所用，术语“共价”是指其中电子由原子对共享的化学键。
如本文所用，“药”、“活性剂”、“生物活性剂”、“药物活性剂”、“药”和“药物”可以互换使用，并且是指具有在以显著量或有效量施用于受试对象时可测定 的指定或选定的生理学活性的试剂或物质。本领域的这些术语在药学和医学领域是公知 的。此类物质的实例包括宽泛类别的可以对受试对象输送的化合物。一般而言，这包括 但不限于核酸和寡核苷酸；抗感染剂，如抗生素和抗病毒剂；镇痛剂和镇痛组合物； 食欲抑制剂；抗蠕虫剂；抗关节炎剂；平喘药；抗惊厥剂；抗抑郁剂；抗糖尿病剂； 止泻剂；抗组胺剂；抗炎剂；抗偏头痛制剂；止吐剂；抗肿瘤剂；抗帕金森症剂；止 痒剂；抗精神病剂；解热剂；解痉剂；抗胆碱能剂；拟交感神经剂；黄嘌呤衍生物； 心血管制剂，包括钾通道阻滞剂、钙通道阻滞剂、β阻滞剂、α阻滞剂和抗心律失常 剂；利尿剂和抗利尿剂；血管扩张剂，包括通用血管扩张剂、冠状血管扩张剂、周围血 管扩张剂和脑血管扩张剂；中枢神经系统刺激剂；血管收缩剂；咳嗽和感冒制剂，包括 解充血剂；激素，如雌二醇和包括糖皮质激素的其它留醇；催眠剂；免疫抑制剂；肌肉 松弛剂；副交感神经阻滞剂；精神兴奋剂；镇静剂；和安定剂。通过本发明的方法，可 以输送所有形式的药物，例如离子化、非离子化、游离碱和酸加成盐等，也可输送高分 子量或低分子量的药物。
如本文所用，术语“生物可降解”是指通过增溶水解、还原或通过生物形成实 体(可以为酶和生物体的其它产物)的作用而将材料向复杂度更低的中间体或末端产物的转化。
如本文所用，术语“聚合主链”用于指代重均分子量处于指定范围内的聚合主 链分子的集合。聚合主链通常具有分子的至少两个末端。在支链聚合主链的情形中，每 个支链将被认为具有至少一个末端。
如本文所用，术语“基本”是指作用、特征、性质、状态、结构、物品或结果 的完全或接近于完全的限度或程度。例如，“基本”被封闭的物体是指该物品完全被封 闭或近乎被完全封闭。在某些情况下，确切的可允许的从绝对完全性的偏差程度取决于 具体的环境。然而，一般而言，接近的完成性将具有与获得绝对和完全的完成性的情况 下相同的整体结果。“基本”的使用可等同地适用于在指代完全缺乏或接近完全缺乏作 用、特征、性质、状态、结构、物品或结果的负面含义中使用的情况。例如，“基本不 含”颗粒的组合物或完全没有颗粒，或接近完全没有颗粒以致其效果将与完全没有颗粒 的情况相同。换言之，“基本不含”成分或要素的组合物可以仍然在实际上含有这些物 质，只要没有可测量的它们的影响即可。
如本文所用，术语“单元”在用于指代支链聚(亚烷基亚胺)(BPAI)时是指交 联之前的支链聚(亚烷基亚胺)分子。BPAI的单元将携带显像剂或其它本文所讨论的基 团；这些基团可以在交联前根据需要被并入ΒΡΑΙ。
如本文所用，术语“大约”用于通过提供可能“稍高于”或“稍低于”端点的 给定值来提供数值范围端点的灵活性。
如本文所用，为方便起见可能将多个物品、结构要素、组成要素和/或材料显 示于一个通用列表中。然而，这些列表应被视为列表中的每个成员都被单独地确定为独 立和独特的成员。因此，在没有相反指出的情况下，不应仅仅基于出现在共同的组中而 将这些列表的任何个体成员视为同一列表的任何其它成员的实际等价物。
浓度、量和其它数值数据可以在本文中以范围格式表达或呈现。应该理解，这 种范围格式仅出于便利和简洁而使用，因此应被灵活地解读为不仅包括作为该范围的极 值而专门列举的数值，还包括该范围内所涵盖的所有单独的数值或子范围，如同每个单 独的数值和子范围都被专门列举一样。举例而言，“约1 约5”的数值范围应被解读 为不仅包括约1 约5的专门列举的值，还包括该指定范围内的单独的值和子范围。因 此，在该数值范围中包括如2、3和4等单独值以及如1 3、2 4和3 5等子范围， 以及单独的1、2、3、4和5。同样的原理适用于仅将一个数值列举作为最小值或最大值 的范围。此外，无论所描述的范围或特征的宽度，这种解读均适用。
基因治疗成功的基础是在系统施用后安全而有效的基因输送载具的发展。本发 明提供了一种有效的用于向靶标细胞输送和/或表达核酸的非病毒聚合物型基因载剂。 在一方面，例如，提供了一种聚合核苷酸表达组合物，其包含生物可降解的交联支链聚 (亚烷基亚胺)，其中所述支链聚(亚烷基亚胺)单元由具有生物可降解键的短链连接子 交联在一起。所述组合物还包含与生物可降解交联聚(亚烷基亚胺)结合的核苷酸序列。 在某些方面，本发明的组合物特别适于输送小核苷酸序列。如上所述，当处于生理学pH 以下的制剂中的水性介质中时，本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)通常以阳离子形式存 在。因此，优选的本发明的聚合核苷酸表达组合物被认为是阳离子型，因为生物可降解 交联聚(亚烷基亚胺)中的某些可利用的氮原子将处于质子化形式。
许多核苷酸序列可以与本发明的聚合载具结合。虽然这些核苷酸序列可以包含 较大的核苷酸大分子，但所述聚合体系对于输送和表达小核苷酸序列特别有用。在一 方面，此类小核苷酸序列可以包括但不限于RNAi、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、 rRNA和微RNA。在一个具体方面，所述小核苷酸序列可以包括siRNA。如下文实施例 中所示，聚合载具令人吃惊地极好地适合于输送和/或表达如siRNA等RNAi部分。聚 (亚烷基亚胺)单元中的氮与核苷酸分子中的磷酸基的摩尔比为约5 1 约200 1， 优选为约10 1 约100 1，且更优选为约20 1 约50 1。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的交联聚(亚烷基亚胺)和核苷酸分子的 药物组合物。在某些方面，所述核苷酸是小RNA分子。在这些组合物中，所述核苷酸分 子可以与交联聚(亚烷基亚胺)结合。所述组合物中的核苷酸分子选自siRNA、shRNA、 dsRNA、ssRNA、mRNA、rRNA、微 RNA、DNA、质粒、cDNA 及其组合。
所述组合物还可以包含选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇、半乳糖苷化酯、 聚乙二醇缀合酯及其组合的共配制剂(coformulant)。
本发明的聚合基因表达制剂可以任选地包含与支链聚(亚烷基亚胺)共聚物共价 偶联的功能性部分。此类功能性部分的非限制性实例包括如荧光标记物等显像剂；脂 质；脂肪酸；受体配体；膜渗透剂；核内体溶解剂；核定位序列；和pH敏感核内体溶 解肽。在一方面，所述功能性部分可以是包括选自以下的成员的脂肪酸丁酸、己酸、 辛酸、己酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、亚 麻酸、α-亚麻酸及其组合。在应用时，可以将显像剂并入本发明的交联生物可降解支 链聚(亚烷基亚胺)的程度为约0.01 0.2、优选为约0.07 0.15、最优选为约0.09 0.11摩尔显像剂/摩尔支链聚(亚烷基亚胺)单元，或其程度为约0.05 1、更优选为约 0.15 0.4、最优选为约0.25 0.35摩尔显像剂/摩尔交联聚合物。
另外，本发明提供了包含生物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)和核苷酸分子的 聚合核苷酸表达组合物，其中所述支链聚(亚烷基亚胺)单元通过具有生物可降解键的短 链连接子交联在一起，且所述核苷酸分子与生物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)结合。 核苷酸分子的非限制性实例可包括siRNA、shRNA>微RNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、 rRNA、DNA、质粒、cDNA及其组合。
本发明还提供了一种制备生物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)的方法，其中所 述支链聚(亚烷基亚胺)单元通过具有生物可降解键的短链连接子交联在一起。该方法可 以包括将多个支链聚(亚烷基亚胺)单元内的至少50%的伯氮原子和仲氮原子可逆地封闭 以形成经保护的支链聚(亚烷基亚胺)单元，将所述多个经保护的支链聚(亚烷基亚胺) 单元与具有生物可降解键的连接子交联，和在交联后将经保护的支链聚(亚烷基亚胺)单 元脱保护。该封闭-反应-脱保护方法允许任何配体的加成。
在本发明的各方面中考虑了使用各种聚亚烷基亚胺作为核苷酸输送和/或表达 的聚合主链。合适的聚(亚烷基亚胺)的非限制性实例是聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚 乙基亚胺)、聚(1，2-亚丙基亚胺)、聚(亚乙基亚胺)及其组合。在本发明的一个具 体方面，支链聚(亚烷基亚胺)是支链聚(亚乙基亚胺)(“ΒΡΕΙ”、“ΡΕΙ”或“支链 PEI")。本文可用的优选支链PEI的分子量为约1000道尔顿 约4000道尔顿，更优选 为约1200道尔顿 2500道尔顿，且最优选为约1500道尔顿 2000道尔顿。
PEI有效地将DNA缩小为小的分布较窄的带正电荷的球形复合物，并能在体外 和体内转染细胞。PEI与其它阳离子聚合物类似，因为PEI的转染活性随着聚合物/DNA 比的增加而增加。PEI比PLL的一个显著有点在于其核内体溶解活性，这使得PEI能产 生高转染效率。适用于本文的支链PEI具有约25%的伯氮原子、约50%的仲氮原子和约 25%的叔氮原子。
PEI在水性介质中的整体质子化程度从ρΗ7至ρΗ5时翻倍，这意味着在核内体中 PEI变得高度质子化。不希望受任何理论束缚，据信PEI的质子化会激发氯离子流入核内 体膜，而水伴随进入以抵消核内体内的高离子浓度，这最终导致因渗透膨胀所致的核内 体破裂和所包裹的DNA的释放。由于PEI的固有核内体溶解活性，其通常不需要添加核 内体溶解剂以进行转染。另外，PEI的细胞毒性和转染活性或多或少地与该聚合物的分 子量线性相关。
由于游离BPEI作为无水游离碱或盐(如氯化物)的吸湿性以及从较高分子量的 BPEI观察到的细胞毒性，游离BPEI的使用可能表现出某些不便。本发明致力于通过从 较小的BPEI单元组装更大分子量的生物可降解聚集体来规避或者缓解高分子量BPEI的 细胞毒性。任何用于PEI交联的双官能团连接子都能在属于相同聚合物单元的两个氮原 子之间(即形成环而不是实际上将聚合物分子连接)或在来自不同聚合物单元的两个氮原 子之间(即实际上连接聚合物单元)形成连接。由于在光谱学上可能难以区分这两种连 接模式，一种有用的分析测试是通过光散射或溶液粘度测量来确定分子量和确定所得交 联产物的生物活性(参见例如，J.Mater.Chem. 1995，5，405-411，本文通过参考并入)。 在任何给定氮原子的附近，相同主链氮的局部浓度较高且不依赖于溶液浓度，而来自不 同主链的氮的浓度较低且为浓度依赖性。因此，在正常条件下，可以预计环的形成是优 选的连接子反应途径。
为了使得这种环形成最小化，可以利用下列方法中的至少一种。第一种方法可 以包括增加反应混合物中的聚合物分子浓度。第二种方法可以包括通过用合适的保护 基可逆地封闭可利用氮原子来减少每个聚合物分子上的可利用氮原子的数目。在极限 情况下，当每个分子仅有一个氮原子可利用时，环形成变得不可能，而唯一可能的聚集 体是二聚体。对于较不完全保护的聚合物而言，来自其它聚合物链的氮原子的局部浓 度与来自相同链的氮的局部浓度平行降低，但可使得两者相当，从而导致50%的连接相 对于环形成的几率。虽然分子量可能依赖于各种因素而变化，但在一方面，交联聚合 物的分子量可以为约15,OOODa 约25,OOODa。在另一方面，交联聚合物的分子量可以 为约3,000Da 约10,000Da。在再一方面，交联聚合物的分子量可以为约500Da 约 2,OOODa。在又一方面，交联聚合物的分子量可以为约500Da 约25,OOODa。
在一方面，合适的交联BPEI氨基包括BPEI分子表面上或表面附近的伯氨基。 因此，在BPEI的情形中，上述保护应为化学选择性地保护所有或几乎所有的仲氨基而留 下一部分游离伯氨基。
在BPEI聚集体的组装期间可以使用叔丁氧基羰基(BOC)作为保护基来将BPEI 转化为被保护的形式。这些反应通常在无水的情况下(即在有机溶剂中)进行。在一方 面，BPEI单元的约50% 约99%的仲氮原子可以被保护。在另一方面，BPEI单元的约 75% 约99%的仲氮原子可以被保护。在又一方面，BPEI单元的约90% 约95%的仲 氮原子可以被保护。
在一方面，BPEI中的约90% 约95%的仲氨基可以被保护，而留下80% 90%的伯氨基未经保护且可用于进一步修饰。通过后续封闭可以进一步减小BPEI分子 表面上的游离伯氨基的密度，从而更少数的伯氨基仍然游离。例如，在BPEI18cicid的情形 中，可能留下3 7个(30% 70% )游离的伯氨基。在较高保护范围时获得的材料可 能在其剩余游离NH基团上更能接收化学修饰。该方法优选用于连接若干较小的BPEI分 子，因为在使用未经保护的BPEI时使无法避免的环形成最小化。另外，在一方面，可能 便利的是在交联完成的同时在一锅(one-pot)反应中将悬挂配体(pendantligand)与聚亚烷 基亚胺单元相连。
应该注意，任何选择性保护BPEI单元的氮基团的方法都应被认为属于本发明的 范围内。一个示例性技术是由O，Sullivan等，1988Tetrahedron Letters第四卷，第50 期，第 6651-6654 页和 O，Sullivan 等，1996 J.Enzyme Inhibition,第 11 卷，第 97-114 页 (本文通过参考将其并入)所教导的对于较小的(3 4个N原子)线性聚胺的三步选择 性保护技术。所述技术包括将所有伯氨基作为三氟乙酰胺保护而留下仲氨基作为三氟乙 酸盐，然后将这些仲氨基作为叔丁氧基羰基(BOC)或其它衍生物保护，最后将伯氨基脱 保护。该技术具有足够的选择性而允许其在大得多的聚胺(例如，具有约20个仲NH和 约 ο个伯NH2 WBPEI18cicid)中的制备性应用具有较好结果。如果需要，大致球形的ΒΡΕΙ 的外部上的剩余伯氨基(约10个/BPEI18qqd分子)中的一些还可以被进一步保护(统计上 而言)，导致每个聚(亚烷基亚胺)分子更小的游离伯氨基的数目。
此类被附属配体(例如，脂质、可选的荧光标签)保护的单元还限制了可利用的 伯氨基的数目并将其进一步隔开，从而其与双官能团连接子的相互作用不会产生分子内 交联，后者可能导致凝胶的形成。
可以根据需要来调节交联支链聚(亚烷基亚胺)的尺寸(即分子量)和交联度。 交联聚合物的尺寸将取决于起始BPAI的尺寸或分子量、连接子的尺寸、交联程度等。
合适的本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)的平均分子量为约500道尔顿(更优 选为600道尔顿) 约25000道尔顿。特定的交联产物的平均分子量为约4000道尔顿 20,000道尔顿。其它交联产物的平均分子量为8000道尔顿 15,000道尔顿。
短链连接子被用来使本发明的各方面的支链聚合单元交联。短链连接子是主链 长度为约6 约40个原子的基团，通常但并不必须为对称的，其在主链中含有至少一个 生物可降解键。典型的连接子的平均分子量为约100道尔顿 约500道尔顿。连接子基 团的前体分子在其主链的各端拥有活性化学基团，且这些化学基团可以相同或不同。连 接由这些活性化学基团执行，由此将两个聚胺单元或聚胺单元与附属配体连接。此外， 连接子可以是支链化的，从而含有三个以上的末端活性化学基团。在一方面，此类连接 子是在烷酰基部分中具有2 20个总碳原子的烷二酰基链，所述烷酰基部分经由可降解 二硫键连接，如二硫代二烷基酸衍生物那样。此类连接子可以由下式表示
-C (O) (CH2) XSS (CH2) yC (O)-
其中χ和y独立地表示1 12的整数。此类连接子在其末端具有连接该连接子 与聚(亚烷基亚胺)的酰胺键。
交联产物中的连接子的前体上的反应基团包括但不限于活化酯(如N-羟基琥珀 酰亚胺酯)、酰卤、活化碳酸衍生物(如氯甲酸酯)或活化胺衍生物(如异氰酸酯和异硫 氰酸酯)。
连接子还可以是含有生物可降解二硫键的短聚乙二醇(“PEG”)基团(即具 有约2 12个氧化乙烯基的PEG)。PEG连接子的前体上的代表性反应基团是末端活化 的化学基团，包括但不限于活化酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、酰卤、活化碳酸衍生物 (如氯甲酸酯)和活化胺衍生物(如异氰酸酯和异硫氰酸酯)。
连接子的亲水性/疏水性可能取决于其选定结构而变化，从而影响生物条件下 的连接子降解的容易性。该性质在需要对连接的聚合物聚集体进行微调时是有利的。
考虑将多种多样的生物可降解键引入短链连接子中。在一方面，例如，生物可 降解键可以包含酯键、酰胺键、二硫键和磷酸酯键中的至少一个。在一个具体方面，生 物可降解键是生物可降解二硫键。在另一个具体方面，如上所示，生物可降解二硫键可 以是二元酸部分的一部分，例如，二硫代二丙酸或另一种二硫代二烷基酸的酰胺键。一 个具体实例可以包括烷基链长为1 10个碳原子的二硫代二烷基酸。在再一个具体方 面，生物可降解二硫键连接子可以包括具有生物可降解二硫键的乙二醇部分。乙二醇部 分的一个非限制性实例是二硫代二(四乙二醇氨基甲酸酯)。
生物可降解键的其它非限制性实例可以包括酯、酰胺、磷酸酯、磷酰酯、胼、 顺式-asotinyl和氨基甲酸酯。由于任何连接子都能以分步方式反应，连接子可以连接不 同的聚(亚烷基亚胺)单元或相同聚(亚烷基亚胺)单元的不同区域(环形成)。如上所 述，后者会有利于形成轻微交联的材料，其因多重环化而具有较差的溶解性。本发明的 技术引入了对聚合单元中的氮原子的部分和可逆的化学选择性(仲相对于伯)封闭/保护 来使该问题最小化。此类选择性保护有助于聚合单元的连接。该方法还允许在交联的支 链聚(亚烷基亚胺)上进行附属辅助配体(例如，脂质或显像剂)的常规引入。
产品交联聚(亚烷基亚胺)中的连接子摩尔数与支链聚(亚烷基亚胺)的摩尔数 之比为约0.1 1 约5 1。更优选的是，连接子的摩尔数与支链聚(亚烷基亚胺)共 聚物的摩尔数之比为约1 1 约5 1。
在一方面，本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)可以由式I表示
(Ly(BPAI))xYzI
其中，
BPAI表示数均分子量为约1000道尔顿 约25000道尔顿的支链聚亚烷基亚胺单 元；
Y表示双官能团生物可降解连接子；
L表示配体或官能部分；
χ是2 20的整数；
y是0.01 100 ；与统计平均混入程度有关
且ζ是1 40的整数。
本发明的优选实施方式可以由式II表示
Ls[-CO (CH2) aSS (CH2) aCO"]p{[ (CH2) nN (_X) _]q}r II
其中
L表示选自脂质、显像剂和靶向抗体的配体或官能部分；
X表示氢或主链的另一个-(CH2) nN (X)-支链，或在相邻N原子也带有连接子的 情况下为该连接子；且
[-CO (CH2) aSS (CH2) aCO-]表示生物可降解二硫代二酸连接子；
‘‘a，，是1 15的整数；
‘‘η，，是2 15的整数；
‘‘ρ，，是 1 100 的整数；
“q”是20 500的整数；
“r”是2 20的整数；且
“s”是0.01 40的数字；与统计平均混入程度有关。
如上所述，本发明的生物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)可以通过将低分子量 支链聚(亚烷基亚胺)(优选PEI)单元用例如生物可降解二硫键交联而合成。所得的生 物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)是水溶性的。本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺) 与目前可利用的聚合物的转染活性的差异可能是由于聚合物组成、合成方案和物理化学 性质的差异造成的。本发明的脂官能化的交联支链聚(亚烷基亚胺)具有受到聚阴离子 化合物(如见于核酸中的那些聚阴离子化合物)静电吸引的氨基。这些交联支链聚(亚 烷基亚胺)缩合DNA并形成紧凑结构。另外，生物活性材料输送之后的单体降解产物 (即，带有脂和连接子片段的低分子量ΒΡΕΙ)的低毒性为基因载剂提供了减低的细胞毒性 和增加的转染效率。
如式I和II中所示，本发明的生物可降解交联支链聚(亚烷基亚胺)也可以与各 种官能部分或配体(如示踪剂(例如显像剂)或靶向抗体)直接地或经由间隔分子相连。 在一方面，仅一小部分的可用氨基与配体偶联。与交联支链聚(亚烷基亚胺)缀合的靶 向配体引导聚合物/核酸/药物复合物与特定靶标细胞结合并穿透进入这些细胞(肿瘤细胞、肝细胞、造血细胞等)。靶向配体还可以为细胞内靶向单元，使得能引导将核酸/药 物转移至受益的细胞区室(线粒体和核等)。
在一方面，配体可以包括与聚合物的氨基偶联的糖部分此类糖部分可优选为单 糖或寡糖，例如，半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纤维二糖、 nytrose>丙糖、右旋葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖醛酸、葡 萄糖醛酸和葡萄糖酸。乳糖的半乳糖基单元提供了用于肝细胞的便利靶向分子，因为这 些细胞上的半乳糖受体具有高亲和力和亲合力。
在另一方面，官能部分可以是显像剂。显像剂包括任何显色或荧光染料或标记 物。虽然考虑了大量荧光标记物，具体的代表性实例包括罗丹明、Cy3、Cy5和荧光素。 此外，荧光标记物与交联支链聚(亚烷基亚胺)之间的摩尔比可能根据预期靶标的性质和 各种其它程序细节而有所不同。在某些方面，显像剂(例如，荧光标记物或显色标记物) 与交联支链聚(亚烷基亚胺)的摩尔比是约0.05 1，更优选为约0.15 0.4，且最优选 为 0.25 0.35。
可以使用的其它类型的靶向配体包括诸如抗体或抗体片段等肽、细胞受体、生 长因子受体、细胞因子受体、叶酸、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、脱唾液 酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸(单核细胞)、甘露糖(巨噬细胞、某些B细胞)、 Lewisx和唾液酸Lewisx(内皮细胞)、N-乙酰乳糖胺(T细胞)、半乳糖(结肠癌细胞) 和血栓调节蛋白(小鼠肺内皮细胞)、如多粘菌素B和血球凝集素HA2等融合剂、向溶酶 体剂(lysosomotrophiciigent)以及如T抗原等核定位信号(NLS)等。此外，在一个具体 方面，官能部分可以包括脂肪酸基团。脂肪酸基团的非限制性实例是丁酰基、己酰基、 辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、肉豆蔻油酰基、棕榈 油酰基、油酰基、亚麻酰基、α-亚麻酰基及其组合。
本发明的一个优点在于其提供了其中易于对粒径和电荷密度进行控制的基因载 剂。对粒径的控制对于优化基因输送体系而言可能较为重要，因为粒径常常决定在体内 的转染效率、细胞毒性和组织靶向。在一方面，粒径可以为约IOOnm直径，这对于经由 胞吞作用进入细胞是有效粒径。在另一方面，粒径可以为约50nm 约300nm。在再一 方面，粒径可以为约50nm 约500nm。另外，带正电荷的颗粒表明提供了充分的与带 负电荷的细胞表面结合的机会，其后通过胞吞作用进入细胞。本发明所公开的基因载剂 的ζ电势为约+ImV 约+60mV。
本发明的交联聚(亚烷基亚胺)适于将如RNA和DNA等大分子输送至哺乳动物 细胞内。如上所述，本发明的交联混合物特别适于保护和输送小核苷酸序列。阳离子聚 合物/核苷酸复合物的粒径和ζ电势可能受该聚合物/核苷酸复合物中的聚合物与核苷 酸分子间的氮磷比(Ν/Ρ)影响。下文所示的实验和结果表明，生物可降解聚合物的物理 化学性质与其作为安全有效的基因输送体系的使用相一致。
本发明的交联支链聚(亚烷基亚胺)的代表性制备程序如下反应图I中所示。为 简化起见，一分子或一单元的支链聚(亚烷基亚胺)(“ΒΡΑΙ”)由带有指示伯氮原子的 点的圆圈表示。
大多数反应性氨基(即氮原子)在交联前被保护或封闭。除了避免与某些氮原 子的不必要的反应以外，保护起着使未经保护的氨基在空间上彼此远离的作用，由此阻止经由相同单元内的氮原子的分子内交联的形成。
在反应图I所示的本发明的方法中，BPAI中的伯氮原子首先被保护(随后分别 进行与例如显像剂的任何初步反应)，接着用不同保护基或第二保护基保护仲氮。然后将 前一种保护基从伯氮原子除去，而那些氮原子于是可以与靶向配体或亲脂基团在交联前 进行反应。在交联之前和在与亲脂基团等反应后，将一部分伯氮原子重新保护。然后将 支链化的、任选地经衍生化的支链聚(亚烷基亚胺)交联以提供本发明的交联聚(亚烷基 亚胺)。然后如果需要可以进行氨基的脱保护。出于图形惯例，最后的脱保护交联产物 作为环化3单元结构显示。
反应图I
权利要求
1.一种交联聚(亚烷基亚胺)，其由具有伯氨基、仲氨基和叔氨基的支链聚(亚烷基 亚胺)单元组成，所述单元通过聚(亚烷基亚胺)单元中的伯氨基和具有生物可降解键的 短链连接子彼此共价交联，其中至少一个伯氨基氮任选地被保护，和至少一个单元任选地与靶向配体、显像剂和/或亲脂基团键合。
2.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其平均分子量为约500道尔顿 约 25000道尔顿。
3.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述连接子的平均分子量为约100 道尔顿 约500道尔顿。
4.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述连接子的摩尔数与支链聚 (亚烷基亚胺)的摩尔数之比为约1 1 约5 1。
5.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中至少一个单元与靶向配体、显像 剂和/或亲脂基团键合。
6.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述显像剂是荧光标记物或显色 标记物。
7.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中多个聚(亚烷基亚胺)单元携带亲脂基团。
8.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述靶向配体是受体配体、膜渗 透剂、核内体溶解剂、核定位序列或pH敏感核内体溶解肽。
9.如权利要求7所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述亲脂基团是选自丁酰基、己 酰基、辛酰基、己酸、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、肉豆蔻油酰基、 棕榈油酰基、油酰基、亚麻酰基、α-亚麻酰基及其组合的脂肪酸基团。
10.如权利要求6所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述显像剂选自罗丹明、Cy3、 Cy5、荧光素及其组合，且其中聚(亚烷基亚胺)的摩尔数与显像剂的摩尔数之比为约 5 1 约 1000 1。
11.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述生物可降解键是酯键、酰胺 键、二硫键或磷酸酯键。
12.如权利要求11所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述生物可降解键是生物可降 解二硫键。
13.如权利要求11所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述生物可降解键是二硫代二 酸的生物可降解二硫键，所述二硫代二酸选自其中烷酰基部分具有2 10个碳原子的二 硫代二烷酰酸，包含于乙二醇部分、二硫代二异氰酸二烷基酯、二硫代二异硫氰酸二烷 基酯、二硫代二异氰酸二乙二醇酯和二硫代二异硫氰酸二乙二醇酯中的生物可降解二硫 键。
14.如权利要求13所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述乙二醇部分是二硫代二 (四乙二醇氨基甲酸酯)。
15.如权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)，其中所述支链聚(亚烷基亚胺)单元 是支链亚乙基亚胺单元。
16.—种支链聚(亚烷基亚胺)化合物，其基本所有伯氨基氮原子都由第一保护基保护，且其基本所有仲氨基氮原子都由第二保护基保护。
17.—种支链聚(亚烷基亚胺)化合物，其基本所有伯氨基氮原子都未经保护，且其 基本所有仲氨基氮原子都被保护。
18.—种支链聚(亚烷基亚胺)化合物，其具有多个伯氮原子和仲氮原子，其中(a)基本所有仲氨基氮原子都由保护基保护；(b)伯氨基氮原子为 (i)未经保护；或 ( )被保护；或(衍)与民键合，其中R1是亲脂基团、靶向配体和/或显像剂；且 至少一个伯氮被保护，且至少一个伯氮原子与R1键合。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺) 和小RNA分子。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述小RNA分子与所述交联聚(亚烷基亚胺)结合。
21.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述小RNA分子选自siRNA、shRNA、 dsRNA、ssRNA、mRNA、rRNA、微 RNA 及其组合。
22.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述聚(亚烷基亚胺)单元是支链聚 (亚烷基亚胺)单元，且所述短链连接子选自其中烷酰基部分具有2 10个碳原子的二 硫代二烷酰酸、包含于乙二醇部分、二硫代二异氰酸二烷基酯、二硫代二异硫氰酸二烷 基酯、二硫代二异氰酸二乙二醇酯和二硫代二异硫氰酸二乙二醇酯中的生物可降解二硫 键；和小RNA分子。
23.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述小RNA分子与所述交联聚(亚烷基亚胺)结合。
24.如权利要求19所述的多核苷酸输送组合物，其中所述小RNA分子选自siRNA、 shRNA、dsRNA、ssRNA、mRNA、rRNA、微 RNA 及其组合。
25.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求15所述的交联聚(亚烷基亚胺)和核苷酸分子。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述核苷酸分子与所述交联聚(亚烷基亚 胺)结合。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述核苷酸分子选自siRNA、shRNA、 dsRNA、ssRNA、mRNA、rRNA、微 RNA、DNA、质粒、cDNA 及其组合。
28.如权利要求25所述的药物组合物，其中聚(亚烷基亚胺)单元中的氮与核苷酸分 子中的磷酸基的摩尔比为约5 1 约200 1。
29.如权利要求25所述的药物组合物，其还包含选自二油酰基磷酯酰乙醇胺、胆固 醇、半乳糖苷化脂、聚乙二醇缀合脂及其组合的共配制剂。
30.一种制备权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)的方法，所述方法包括(a)将支链聚(亚烷基亚胺)内的至少约50%的仲氮原子可逆地封闭以形成经保护的 支链聚(亚烷基亚胺)；和(b)将所述经保护的支链聚(亚烷基亚胺)与具有生物可降解键的短链连接子交联。
31.如权利要求30所述的方法，该方法还包括(c)在交联后将所述经保护的支链聚 (亚烷基亚胺)单元脱保护。
32.如权利要求30所述的方法，其中在(a)中支链聚(亚烷基亚胺)的约75% 约 99 %的仲氮原子被可逆地封闭。
33.如权利要求30所述的方法，其中在(a)中支链聚(亚烷基亚胺)的约90% 约 95 %的仲氮原子被可逆地封闭。
34.一种制备权利要求1所述的交联聚(亚烷基亚胺)的方法，所述方法包括(a)将支链聚(亚烷基亚胺)内的至少约75%的伯氮原子可逆地封闭以形成伯氮被保 护的支链聚(亚烷基亚胺)；和(b)将所述伯氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)内的至少约50%的仲氮原子可逆地封 闭以形成伯氮和仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)；(C)将所述伯氮和仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)脱保护以形成仲氮被保护的支 链聚(亚烷基亚胺)；和(d)将所述仲氮被保护的支链聚(亚烷基亚胺)与具有生物可降解键的短链连接子交 联以形成交联支链聚(亚烷基亚胺)。
35.如权利要求34所述的方法，其还包括(e)在交联后将保护基从交联的支链聚(亚 烷基亚胺)除去。
36.如权利要求34所述的方法，其还包括(Cl)在交联前将所述仲氮被保护的支链聚 (亚烷基亚胺)与靶向配体、显像剂和/或亲脂基团反应。
37.如权利要求34所述的方法，其还包括(Ia)在保护伯氮原子或仲氮原子之前将所 述支链聚(亚烷基亚胺)与靶向配体、显像剂和/或亲脂基团反应。
38.如权利要求34所述的方法，其还包括(al)在保护伯氮原子或仲氮原子之前将过 量的支链聚(亚烷基亚胺)与显像剂反应。
39.一种通过权利要求30所述的方法制备的交联支链聚(亚烷基亚胺)。
40.一种通过权利要求34所述的方法制备的交联支链聚(亚烷基亚胺)。
全文摘要
本发明公开了一种交联支链聚(亚烷基亚胺)及其组合物和核苷酸分子。本发明还公开了所述交联支链聚(亚烷基亚胺)的制备方法。
文档编号C08G73/02GK102027043SQ200980117430
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月16日 优先权日2008年3月14日
发明者布莱恩·J·斯帕克斯, 库尔西德·安维尔, 格雷戈里·斯洛博德金, 贾森·菲维尔, 马杰德·玛塔 申请人:艾根股份有限公司