专利名称：氨酯键小分子量pei交联衍生物、制备方法、用途及其复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及PEI衍生物、制备方法、用途及复合物，具体涉及一种氨酯键小分子量 PEI交联衍生物、制备方法、用途及其复合物。
背景技术：
基因治疗，是将外源性基因物质(DNA或RNA)导入细胞，促成或者抑制特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。目前常用的基因输送载体可以分为重组病毒载体及人工合成载体(即非病毒载体)。病毒载体虽然显示了高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒的制备和纯化困难且携载基因容量小。因此非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。传统的生物可降解高分子材料(如PGA、PLA、PLGA)不具有基因内吞逃逸功能，所以转染率不高，改性天然高分子如壳聚糖，其结构在设计改造上具有局限性，而以聚乙烯亚胺(PEI)为代表的能够帮助基因物质内吞逃逸的聚阳离子则因高分子量而引起细胞毒性过大。PEI是目前研究最为广泛的聚阳离子非病毒载体，分支状分子量为25 kDa的PEI (PEI 25kDa)转染效率最高，但是PEI 25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致细胞累计毒性较大。多数的国内外研究集中在可降解的PEI交联衍生物。最早俄亥俄州立大学的Robert J. Lee在结合化学杂志上(Bioconjugate Chemistry2001；12:989-9.发表'Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine'的文章，文中用交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、双硫二丙二亚氨甲基醚(DTBP)分别与小分子量PEI (PEI SOODa)交联得到两个含有二硫键PEI衍生物。在中国仓鼠卵巢(CH0 )细胞中具有与市售高分子量PEI (25KDa)相当的转染活性，二硫键的引入希望该衍生物可以被体内的还原试剂谷胱甘肽还原，从而二硫键断开，降解成为没有细胞毒性的小分子量PEI，但是文献中没有给出具体的细胞毒性数据。麻省理工学院的M. Klibanov在药学研究杂志上(Pharm. Res. 2005;22:373-80.) 发表'Cross-linked small polyethylenimines while still nontoxic, deliver DNA efficiently to mammalian cells in vitro and in vivo'的文章，文中合成了酉旨键连接的PEI衍生物，发现其在体内和体外的转染活性都优于bPEI 25 KDa。但是这一类酯键交联的PEI衍生物所含有的伯胺和仲胺易与酯键发生重排反应，致使聚阳离子的结构不稳定。犹他大学的Sung Wan Kim 在缓控释杂志(Journal of Controlled Release 2005,103 209 - 219) 发表〈〈Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier》的文章，生成亚胺键连接的可降解PEI，其特点是，中性pH值可稳定存在，在酸性条件下(pH=4. 5)亚胺键断开，生成无细胞毒性的小分量PEI，降低了细胞毒性，但是其结构不稳定(亚胺键的引入)，其转染活性也不高(与PEI 25kDa对照)。本课题组徐松琳在控制释放杂志(Journalof controlled release, 2008, 130, 64-68)^^T"Novel poly (ethylene imine) biscarbamate conjugate as an efficient and nontoxic gene delivery system，，的文章，该文章中所合成的氨酯类衍生物PEIC在与报道基因复合比例为40/1这一高质量比时达到最大转染活性(与商业化聚乙烯亚胺25 kDa对照)，质量比为40/1时会增加载体的载量从而会带来更大的毒性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种氨酯键小分子量PEI交联衍生物、制备方法、用途及其复合物。本发明制备的含有氨酯键结构的可降解小分子量PEI 交联衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性，在不同的细胞中均具有较好的生物活性，是高效、低毒的基因物质载体，用于输送基因物质。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
第一方面，本发明涉及一种氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物，其结构式为
权利要求
1. 一种氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物，其特征在于，其结构式为
2.根据权利要求1所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物，其特征在于，所述氨酯键小分子量PEI交联衍生物的基本构建单元为小分子量PEI，所述小分子量PEI的分子量为 800Dao
3.一种制备权利要求1所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将小分子量PEI与乙二醇二氯甲酸酯按摩尔比为3:2的比例加入三乙胺-氯仿体系中；(b)搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述小分子量PEI交联衍生物。
4.根据权利要求3所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的制备方法，其特征在于，所述小分子量PEI的分子量为800Da。
5.根据权利要求3或4所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的制备方法，其特征在于，还包括分离纯化的步骤将所述小分子量PEI交联衍生物用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析；透析结束后，用微孔滤膜过滤，冻干。
6.如权利要求5所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的制备方法，其特征是，所述透析袋的截留分子量为lOOODa。
7.如权利要求5所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的制备方法，其特征是，所述透析的时间为12 48小时。
8.如权利要求5所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物的制备方法，其特征是，所述微孔滤膜的孔径为0. 22 0. 45 μ m。
9.一种权利要求1所述的氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物在制备用于输送基因物质载体中的用途。
10.一种复合物，其特征在于，该复合物是采用包括如下步骤的方法制备而得将权利要求1所述氨酯键交联小分子量PEI交联衍生物溶液加入到质粒溶液中，混合，室温下孵育，即得。
11.如权利要求10所述的复合物，其特征在于，所述质粒为DNA质粒。
12.如权利要求10所述的复合物，其特征在于，所述孵育的时间为30 120分钟。
全文摘要
本发明公开了一种氨酯键小分子量聚乙烯亚胺(PEI)交联衍生物、制备方法、用途及复合物。所述衍生物结构式为，其中，x为1～20，y为1～20。所述氨酯键小分子量PEI交联衍生物的制备方法包括如下步骤将小分子量PEI与乙二醇二氯甲酸酯按摩尔比为3:2的比例加入三乙胺-氯仿体系中；搅拌、摇动或震荡反应体系，使之发生缩合反应，即得所述小分子量PEI交联衍生物。与现有技术相比，本发明制备的含有氨酯键结构的可降解小分子量PEI交联衍生物具有高的转染活性和较小的细胞毒性，在不同的细胞中均具有较好的生物活性，是高效、低毒的基因物质载体，用于输送基因物质。
文档编号C08G73/04GK102504250SQ201110327129
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者王玉强, 盛净, 苏靖, 金拓, 陆平 申请人:上海交通大学