精品肝素和制备精品肝素的方法
【专利摘要】本文涉及一种精品肝素和制备精品肝素的方法。其中制备精品肝素的方法包括：将粗品肝素溶解到水中，制备肝素溶液，向肝素溶液中加入硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B，与半乳糖胺杂质进行酶反应；除去肝素溶液中的硫酸软骨素酶AC和/或硫酸软骨素酶B。
【专利说明】精品肝素和制备精品肝素的方法
【技术领域】
[0001] 本文涉及精品肝素和制备所述精品肝素的方法。
【背景技术】
[0002] 肝素是由己糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸）和D-硫酸氨基葡萄糖以 1 - 4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状结构，其分子量 为3000-37000Da之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂使用。此外，肝素还具有抗 炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能（Maurice Petitou, Benito Casu，Ulf Lindah. 1976 - 1983,a critical period in the history of heparin:the discovery of the antithrombin binding site. Biochimie85(2003)83 - 89)〇
[0003] 粗品肝素经过纯化之后可以药用，纯化过程包括一系列的一般分离步骤以及使 外来物质失活的步骤。其中分离步骤利用了肝素的物化性质，比如高阴离子密度，水溶性 以及对于热、酸、碱和氧化剂的相对高活性（Marco Guerrini，Zhenqing Zhang, Zachary Shriver, etc. Orthogonal analytical approaches to detect potential contaminants in h印arin.PNAS，2009,106 (40) :16956 - 16961)。
[0004] 在历史上药品级别的肝素是基于血浆凝固试验来定义的，而不是其分子性质。目 前这种状态已经改变，这是因为肝素污染危机和更加精妙的多糖分析手段的出现。世界 上的多家标准品机构，包括美国药典和欧洲药典，已经开始用基于规定的生化方法，比如 核磁共振（NMR)、毛细管电泳（CE)、高效液相色谱（HPLC)来测定肝素的结构和电荷性质。 2007年末到2008年初的硫酸软骨素污染肝素钠事件，导致了很多国家的肝素在血液透析 的过程中出现过敏反应，比如急性低血压，并导致超过140位病人死亡（Kishimoto TK， 等人(2008)Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system. N Engl J Med358:2457 - 2467 ；Guerrini M,等人 (2008)Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events.Nat Biotechnol26:669 _ 675;Blossom DB,等人（2008) Outbreak of adverse reactions associated with contaminated heparin. N Engl J Med359:2674 - 2684)。
[0005] 肝素中另一种杂质为过硫酸软骨素。过硫酸软骨素（0SCS)每个双糖单位含有4个 硫，如下式1所示，到目前为止，双糖含有4个硫元素在自然界中还没有发现，结构也不同于 其他的粘多糖（GAG)不纯物质。0SCS的出现也开始使各国重视肝素的其他污染物，如硫酸 皮肤素（DS)、透明质酸（HA)和所谓的边角料，这些也可以被过硫酸化而出现在肝素中。所 以肝素粗品的精制工艺显得越来越重要。
[0006]
【权利要求】
1. 一种精制的精品肝素，其中，所述精品肝素所含的半乳糖胺的杂质为5质量％以下、 优选为3质量％以下、进一步优选为1质量％以下，再进一步优选为0. 8质量％、0. 5质量％、 〇. 3质量％、优选为0. 1质量％以下。
2. 根据权利要求1所述的精品肝素，其中，所述精品肝素的羊血浆效价为150IU/mg以 上、优选为160IU/mg以上、进一步优选为170IU/mg以上。
3. 根据权利要求1或2所述的精品肝素，其中，所述精品肝素配制为4mg/mL的肝素溶 液时，在260nm处的吸光度为0· 1以下，在280nm处的吸光度为0· 1以下。
4. 一种制备精品肝素的方法，其包括： 向含粗品肝素的肝素溶液中加入下列酶中的至少一种与半乳糖胺杂质进行酶反应，上 述酶为硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述硫酸软骨素酶AC是与MBP融合的硫酸软骨 素酶AC，即MBP-ChonAC(SEQ ID NO: 1)，所述硫酸软骨素酶B是与MBP融合的硫酸软骨素酶 B，即 MBP-ChonB(SEQ ID N0:2)。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中向肝素溶液中添加胰酶停止酶反应。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中，还包括下列的提纯步骤： 除杂质步骤； 乙醇沉淀步骤； 氧化步骤； 冷冻干燥。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述除杂质步骤和乙醇沉淀步骤重复进行两次 或三次以上。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中，在最后一次乙醇沉淀之前进行氧化并脱色。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中，除杂质步骤包括向肝素溶液中添加氯化钙以除 去杂质，并进一步添加无水碳酸钠以除去钙离子。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中，利用H202对肝素溶液进行氧化并脱色。
12. 根据权利要求4?11中任一项所述的方法，其中， 所述硫酸软骨素酶B和粗品肝素的比例为：500IU-50000IU硫酸软骨素酶B/kg 粗品肝素，优选的比例为1000IU-20000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素，进一步优选 3000IU-12000IU硫酸软骨素酶B/kg粗品肝素，最优选为5000IU-10000IU硫酸软骨素酶B/ kg粗品肝素； 所述硫酸软骨素酶AC和粗品肝素的比例为：300IU-30000IU硫酸软骨素酶AC/kg 粗品肝素，优选的比例为1 〇〇〇IU-15000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素，进一步优选 2000IU-10000IU硫酸软骨素酶AC/kg粗品肝素，最优选为3000IU-6000IU硫酸软骨素酶 AC/kg粗品肝素。
13. 根据权利要求4?12中任一项所述的方法，其中，获得所述粗品肝素的肝素原料为 来自动物组织的基本上含有肝素的原料，优选来源于猪、牛、羊组织的肝素，更优选来源于 猪小肠粘膜的肝素。
【文档编号】C08B37/10GK104140478SQ201310165701
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月8日 优先权日:2013年5月8日
【发明者】邢新会, 吴敬君, 张翀 申请人:清华大学