数字PCR(dPCR)是常规聚合酶链式反应(PCR)方法的改进，其可以用于直接量化和克隆扩增核酸(包括DNA、cDNA、甲基化的DNA、或RNA)。dPCR和传统PCR之间的一个区别在于测量核酸量的方法。PCR和dPCR均对每个单独样品进行一个反应，dPCR还在样品内进行单一反应，但是所述样品被分离成大量的分区(partition)，并且所述反应在每个分区中单独进行。这种分离允许对核酸量进行灵敏的测量。DPCR已被证明可有效用于研究基因序列中的变异，例如拷贝数变异或点突变。
在dPCR中，样品被分区，使得样品内单个的核酸分子被定位并被集中在许多分离的区域内。所述样品通过简单的稀释过程(process)进行分级分离，使得每个级分含有大约一个拷贝的DNA模板或更少。通过分离单个DNA模板，该过程有效富集在原始样品中以极低水平存在的DNA分子。样品的分区有助于采用泊松统计对分子进行计数。其结果是，每个分区会分别含有“0”或“1”个分子，或阴性或阳性的反应。虽然传统PCR中分子的起始拷贝数与扩增循环的数量成比例，dPCR并不依赖于扩增循环的数量来确定初始样品量。
现有dPCR分析方法采用荧光探针和基于光的检测方法来鉴定扩增产物。这些方法要求足够的靶分子扩增以产生足以被检测到的信号，但可能会导致额外的错误或偏差，因此，希望能够提供一种改进的、用于检测样品内感兴趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的准确度和精确度，并且其具有可以与基于dPCR的方法关联使用的灵敏度。
发明概述
本发明提供了一种靶核酸的检测方法，包括：将样品分级分离成多个样品体积，其中超过50％的级分在每个样品体积中含有不超过1个靶核酸分子；使所述多个样品体积经受用于扩增的条件；检测在其中存在靶核酸的样品体积中离子浓度的变化；对带有扩增的靶核酸的级分的数量进行计数；以及确定所述样品中靶核酸的量。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品与用于扩增的引物和探针组合。所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加或者可以是离子浓度的降低。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品与珠组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括将样品上样至基板(substrate)上，其中所述基板包括至少一个孔(well)。所述基板可以是玻璃、金属、金属氧化物、硅、陶瓷、聚合物涂层或其任意组合。所述孔可以用或者可以没有用密封层密封，所述密封层可以是固体或液体，例如盖片、玻璃、塑料、复合材料、光学透明材料、不混溶的流体或任何其它合适的密封结构。此外，所述孔的表面可以是处理过的表面。所述处理过的表面可以包括有助于感兴趣的靶分子结合的表面处理，包括用亲水性涂层、抗体、链霉亲和素、抗生物素蛋白、薄膜涂层、纳米纤维、寡核苷酸、其任意组合或任何其它合适的表面处理来涂布所述表面。可选择地，所述样品可以被上样至基质(matrix)上，例如细胞外基质、聚合物基质、或凝胶如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或水凝胶。所述方法还包括将多个样品的每一个置于多个分离的位置中，其中所述多个分离的位置的每一个与单个传感器进行化学通讯或者其中所述多个分离的位置的每一个与它们自己的单个传感器进行化学通讯。在所述方法的一些实施方案中，所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加，或者可以是离子浓度的降低。在一些实施方案中，所述离子可以是阳离子如氢离子，或者可以是阴离子如焦磷酸分子。所述离子浓度的变化可以由pH的变化指示，或者可以被转换成电信号。在一些实施方案中，所述方法可以包括对起始样品中靶核酸的量进行定量。
本发明还提供了一种对核酸进行绝对定量的方法，包括：将含有初始量靶核酸的样品稀释成多个样品体积，其中含有一个或多个靶核酸分子的反应区的百分比大于50％并小于100％；使多个样品体积经受至少一个扩增循环；检测多个样品体积中至少一个样品体积的离子浓度变化作为至少一个扩增循环的结果；以及定量靶核酸的初始量。所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加、离子浓度的降低、pH的变化，可以涉及阳离子如氢离子、阴离子如焦磷酸分子、或阳离子和阴离子二者的检测。
通过引用并入
本发明在其说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用以相同的程度并入本发明，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地且单独地通过引用并入本发明。
附图说明
本发明的新特征特别地记载于所附的权利要求书中。通过参考下面阐述示例性实施方案的详细描述及其附图来获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施方案中利用了本发明的原理，其中：
图1显示PCR延伸阶段的实例；
图2显示采用本发明所述方法的装置的一个实施方案；
图3显示采用本发明所述方法的装置的一个实施方案；
图4A和4B显示采用本发明所述方法的装置的一个实施方案；
图5A和5B显示采用本发明所述方法的装置的一个实施方案；
图6A-6B显示采用本发明所述方法的装置的一个实施方案。
发明详述
聚合酶链式反应(PCR)依赖于热循环，其由用于DNA熔解和酶促复制DNA的反应的重复加热和冷却的循环组成。大部分PCR方法采用热循环，即交替加热和冷却PCR样品至定义好的一系列温度步骤。这些热循环步骤需要在称为DNA熔解的过程中，首先高温下物理分离DNA双螺旋中的两条链。然后，在较低的温度下，每条链用作通过DNA聚合酶来进行的DNA合成中的模板，以在退火阶段和延伸阶段过程中选择性扩增靶DNA。聚合酶包括热稳定性DNA聚合酶如Taq聚合酶。PCR的选择性源于使用在特定热循环条件下与靶向(targeted for)扩增的DNA区域互补的引物。含有与靶区域互补的序列的引物(短的DNA片段)以及DNA聚合酶是使得选择性和重复扩增成为可能的关键成分。图1示出了DNA的互补链的延伸。在DNA复制过程中随着脱氧核糖磷酸骨架被加长，焦磷酸分子被释放以驱动反应向前进行。此外，反应还从互补链上的氢氧基团释放出单独的氢离子H+。在本发明所提供的方法中，检测到化学浓度的变化可以意味着扩增正在进行，并因此，意味着感兴趣的DNA模板存在于反应容器中。
本发明提供了一种靶核酸的检测方法，包括：将样品分级分离成多个样品体积，其中超过50％的级分在每个样品体积中含有不超过1个靶核酸分子；使所述多个样品体积经受用于扩增的条件；检测在其中存在靶核酸的样品体积中离子浓度的变化；对带有扩增的靶核酸的级分的数量进行计数；以及确定所述样品中靶核酸的量。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品与用于扩增的引物和探针组合。所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加，或者可以是离子浓度的降低。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品与珠组合。在一些实施方案中，所述方法可以包括将样品上样至基板上，其中所述基板包括至少一个孔。所述基板可以是玻璃、金属、金属氧化物、硅、陶瓷、聚合物涂层或其任意组合。所述孔可以用或者可以没有用密封层密封，所述密封层可以是固体或液体，例如盖片、玻璃、塑料、复合材料、光学透明材料、不混溶的流体或任何其它合适的密封结构。此外，所述孔的表面可以是处理过的表面。所述处理过的表面可以包括有助于感兴趣的靶分子结合的表面处理，包括用亲水性涂层、抗体、链霉亲和素、抗生物素蛋白、薄膜涂层、纳米纤维、寡核苷酸、其任意组合或任何其它合适的表面处理来涂布所述表面。或者，所述样品可以被上样至基质上，例如细胞外基质、聚合物基质、或凝胶如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或水凝胶。所述方法还包括将多个样品的每一个置于多个分离的位置中，其中所述多个分离的位置的每一个与单个传感器进行化学通讯，或者其中所述多个分离的位置的每一个与它们自己的单个传感器进行化学通讯。在所述方法的一些实施方案中，所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加，或者可以是离子浓度的降低。在一些实施方案中，所述离子可以是阳离子如氢离子，或者可以是阴离子如焦磷酸分子。所述离子浓度的变化可以由pH的变化指示，或者可以被转换成电信号。在一些实施方案中，所述方法可以包括对起始样品中靶核酸的量进行定量。
本发明还提供了一种对核酸进行绝对定量的方法，包括：将含有初始量靶核酸的样品稀释成多个样品体积，其中含有一个或多个靶核酸分子的反应区的百分比大于50％并小于100％；使多个样品体积经受至少一个扩增循环；检测多个样品体积中至少一个样品体积的离子浓度变化作为至少一个扩增循环的结果；以及定量靶核酸的初始量。所述离子浓度的变化可以是离子浓度的增加、离子浓度的降低、pH的变化，可以涉及阳离子如氢离子、阴离子如焦磷酸分子、或阳离子和阴离子二者的检测。
图2A显示了装置的一个实施方案，其中靶核酸的单个分子可被检测。如图2A所示，代表性的装置200可以包括蚀刻的基板202，所述基板包括至少一个孔204，孔204可以被配置用来容纳和限制样品体积。离子敏感层206可以与所述孔204进行化学通讯，并与传感器208进行电通讯。在一些实施方案中，所述孔204，或者在有超过一个孔的实施方案中的多个孔，与单个传感器进行化学通讯，或者每个孔204可以与它自己的单个传感器进行化学通讯，如图2A所示。在一些实施方案中，所述传感器可以是化学场效应晶体管(chemFET)传感器、离子敏感场效应晶体管(ISFET)或任何其它合适的生物传感器。在一些实施方案中，所述传感器检测离子浓度、pH、热、酶活性变化或针对在孔中发生的反应发出的任何其它能量形式的变化。在一些实施方案中，所述传感器可以被配置为检测在反应过程中单个氢离子的释放。例如，当模板链正被复制时，当每个核苷酸发生结合时，系统可以检测离子浓度的变化，并将该变化报告为峰(spike)。在一些实施方案中，珠207可用于结合DNA链，如图2A所示。合适装置的其它实施方案，在公开的美国专利公开号2010/0301398中有更为详细的描述，其公开的内容通过全文引用并入本发明。
在使用过程中，随着发生扩增并且随着发生核苷酸掺入，氢离子被释放，有效降低了孔中的pH。然后，离子感应层检测到pH变化为电荷的升高。如果有足够的电荷积聚，所述传感器读出跨越传感板的积聚电压中这种变化。在一些实施方案中，样品可以采用任何合适的用于进行PCR方法完成PCR。这些方法可以包括，但不限于，使用热循环仪或等温扩增，如环介导的等温扩增(LAMP)、切口酶扩增反应(NEAR)、解旋酶依赖型扩增(helicase-dependant amplification)，重组酶聚合酶扩增(RPA)或任何其它合适的实施包括可检测反应副产物的反应的方法。在一些实施方案中，可以采用热对流，如微型热对流或红外介导的温度控制。在一些实施方案中，如图2B所示，加热元件220可以被制造入基板202中。所述加热元件可以被定位于基板中或在传感层之下，或者在装置上的任何其它合适的位置中。在一些实施方案中，所述加热元件可以被定位于置于所述孔的开口上的盖(cover)或盖子(lid)中，其可以用于给所述孔供热并且可以或可以不至少部分地密封所述孔。在一些实施方案中，所述加热元件是红外热源，例如钨灯、辐射(光谱的红色部分)。在这样的实施方案中，冷却是采用散热或通过压缩空气来实现的。
在一些实施方案中，主动加热/传感元件可以被整合到进行独立的PCR反应的装置或芯片中(反应不要求使用所述装置/芯片之外的设备)。在一些实施方案中，导体和半导体材料可以用于产生热和/或其它电磁辐射形式。在一些实施方案中，温度传感和加热可以通过铂的沉积、掺杂的多晶硅或其它任何合适的材料来实现。在一些实施方案中，能量源可以与装置偶联。在在一些实施方案中，所述装置可以与帕尔帖(Peltier)或其它热源偶联，如热块、热垫或任何其它合适的加热源。
用于PCR监测的配备集成执行器(actuator)(加热器)的硅片中一个孔或者孔的阵列的制造已经被详细描述于例如，美国公开第20100301398号和Iordanov et al.,Sensorised Nanoliter Reactor Chamberfor DNA Multiplication,IEEE(2004)229-232，二者通过全文引用并入本发明。由此制得的孔或者室(chamber)可各自以配备集成ISFET的方式提供，用于监测核酸扩增。正如Iordanov et al.在他们的上述论文中指出的，未处理的硅和标准的硅相关材料是Taq聚合酶的抑制剂。因此，当硅或硅相关材料，例如硅锗或应变硅(所有这类材料在下文中将被称为硅基板)，被用于制备进行核酸扩增的微芯片室或通道时，它通常被用材料覆盖以阻止由硅带来的聚合酶效率降低，例如SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PerspexTM或玻璃。
用于PCR的微加工含硅玻璃的表面钝化还被Shoffner et al.描述于Nucleic Acid Res.(1996)24,375-379中。在它们的研究中，采用标准光刻步骤制备并蚀刻硅芯片至115μm的深度。将PyrexTM玻璃盖置于每个硅芯片的顶部，并且硅和玻璃是阳极键合的(anodically bonded)。研究了几种类型的表面钝化，以期提高在所提供的室中进行热循环的PCR扩增效率。与在常规PCR管中进行的反应相比，发现氧化的硅表面(SiO2)给出一致的扩增。这样的表面也可以有利于制造带有ISFET pH传感器的微流体装置以进行根据本发明的核酸扩增。对于在PCR微流体装置进行表面钝化的进一步讨论，可以参考Zhang et al.,PCRmicrofluidic devices for DNA amplification,Biotechnology Advances(2006)24,243-284。如该综述文章中所述，作为通过基板包被进行静态表面钝化的替代方案，可以在样品中包括钝化剂(动态钝化)。
作为如上所述的用于在静态样品中进行PCR监测的低反应体积室的替代方案，可以使得用于PCR监测的样品流过微流体装置的通道或室，并且由于其液流连续经受不同的温度而由此实现PCR热循环。因此，例如，可以使得样品流过通道或室，其连续通过适于变性、引物退火和引物延伸的PCR阶段的不同温度区域，例如微流体装置中的通道，例如硅芯片装置，其连续通过基底提供的适于沿着变性、引物退火和引物延伸的PCR阶段通道进行连续重复的不同温度区域。用于在芯片上进行连续流动核酸扩增的这类微流体结构描述于，例如Auroux et al.,Minaturised NucleicAcid Analysis Lab Chip(2004)4,534-546，并且可以结合扩增的ISFET监测。可以通过采用标准微加工技术制造这类结构，采用例如光刻法来定义流体网络，然后进行蚀刻或沉积步骤，例如在PMMA、丙烯酸、PerspexTM或玻璃基板中建立所需的一个或多个通道。玻璃或PMMA或其它材料中的盖板可以或可以不重叠以盖住所述通道们。可以通过结合硅芯片的基板配备集成ISFET和温度传感器以及加热或热泵(帕尔帖)元件来形成所述一个或多个通道的基底，使得反应混合物与这些传感器和执行器直接接触，并可以或可以不包括用于温度控制的电路。或者，可以由容纳ISFET和温度传感器的印刷电路板(PCB)形成所述通道的基底，使得这些器件与反应混合物直接接触。PCB还可以容纳加热或热泵元件、传感器界面和温度控制电路。在微流体通道或室内存在的试剂可以是那些经缓冲的扩增反应混合物，其可以包括针对在适于扩增所选序列的位点与靶杂交的能力所选择的引物、所需要的酶或用于扩增的酶和过量的所有四种dNTPs。
温度控制可以通过比例-积分-微分(PID)控制器实现，其是最常用的闭环反馈控制系统之一。然后，测得温度和靶温度之间的误差可用于计算所需的加热水平。该输出水平的计算可以基于当前的误差直接地(比例)、误差的历史(积分)和基于其改变速率预测的未来误差(积分)进行。相似地，PI控制器可以基于误差的现在值和历史值来稳定温度，如同上的Iordanov et al.(2004)中所述。或者，可以实施如脉宽调制或占空比的技术。
或者可以选择具有一个往复系统，从而扩增混合物在微室中在所需的热循环温度区域之间来回移动。应理解，由这种在芯片上样品分流PCR所得到的核酸扩增(如上述Auroux et al.的综述文章所述)可以通过在微流体室壁上或在任何合适位置提供ISFET以测量pH来监测。
用于PCR的微流体装置(其可以针对ISFET传感根据本发明进行修改)的进一步的细节可以再次参考Zhang et al.(2006)Biotech.Adv.24,243-284。如该综述文章中所讨论的，虽然这类装置可以优选采取硅芯片的形式，也可以采用用于芯片基板的其它材料如玻璃、各种聚合物和陶瓷。作为用于热循环的接触式加热的替代方案，可以采用各种非接触式加热方法，也如该同一综述文章中所讨论的，包括例如热空气介导的加热、利用IR光、激光介导的加热、感应加热和微波辐射的方式。
在一些实施方案中，本发明所提供的装置可以用于进行DPCR。图3显示了用于DPCR的装置的一个实施方案。所述装置300可以由具有孔304的基板302组成，在一些实施方案中，所述基板302具有至少1个孔、至少100个孔、至少1000个孔、至少10,000个孔，至少30,000个孔。在一些实施方案中，所述基板302可以具有少于50,000个孔、少于40,000个孔、少于30,000个孔、少于20,000个孔、少于5,000个孔、少于1000个孔、少于500个孔、少于100个孔、少于10个孔。如图3中所示，至少一个孔304可以位于与传感层306化学通讯，所述传感层可以与至少一个传感器308进行电通讯。在一些实施方案中，每个孔与其自己的相应传感器308进行化学和电通讯。样品312，其可以包括，例如样品、PCR引物和试剂、缓冲液，或用于扩增的任何其它合适试剂可以上样至芯片上。在一些实施方案中，密封层310，例如不混溶流体层、塑料层、玻璃层或任何其它合适的密封层，然后可以被置于孔上以分隔在单个孔的每个孔中的反应混合物。在一些实施方案中，所述孔的表面的至少一部分可以用亲水性涂层或材料包被。在一些实施方案中，所述孔的表面的至少一部分可以用疏水性涂层或材料包被。此外，反应混合物然后可以经受进行PCR所必须的条件。如前所述，当PCR发生时，每次扩增子延伸/复制会释放氢离子，从而改变孔中反应混合物的pH。反应混合物pH的这种变化，然后可以被与孔进行化学通讯的传感器检测到。
在一些实施方案中，样品可以在如前所述的扩增之前上样到芯片上。在一些实施方案中，样品可以在芯片外扩增或富集，然后可以将带有经扩增的模板的样品上样至芯片上。一旦在芯片上，样品可以完成任何合适的反应，以释放可检测的副产物。在一些实施方案中，通过采用不混溶的流体将样品剪切成更小的反应体积而形成小反应体积，其然后被上样至芯片上。
图4A显示了本发明提供的装置的另一个实施方案。如图4A中所示，在本发明所提供的装置和方法的一些实施方案中，替代在基板中的孔中分割样品的是，样品412如DNA，可以被容纳和限制于基质414中，其中DNA的单个分子彼此分离。所述基质可以是任何合适的基质包括，但不限于，细胞外基质、聚合物基质或凝胶如聚丙烯酰胺凝胶。所述基质应当是足以降低DNA片段、菌落、簇、聚合酶克隆(polony)之间信号干扰的材料。在一些实施方案中，所述基质可以是铺展在传感层406表面上的连续层，如图4A中所示。在一些实施方案中，样品可以夹在两层玻璃片之间并置于传感板之上。在一些实施方案中，支持物406可以与基质进行结构通讯。在装置400的另一个实施方案中，基质412可以用于与含有至少一个孔404的基板402结合使用，如图4B中所示。在这样的实施方案中，孔404可以用于进一步降低样品簇之间的信号噪音，并减少检测单个簇的信号的传感器数量。单个菌落、簇、聚合酶克隆、片段之下的传感器然后可以检测每次扩增子延伸/复制释放氢离子时进行扩增的区域或孔中pH的变化。检测可以取决于样品接近传感器的程度，或者可以是基于时间的检测以鉴定在整个表面区域经扩增的聚合酶克隆的数量。采用基于时间的方法进行定量，然后可以通过计算每个区域或体积的菌落数量来完成。
在一些实施方案中，所述装置可以用于进行乳液dPCR。图5A和5B描绘了采用带有乳液的装置的一个实施方案。在这样的实施方案中，可以制备乳液，其中乳液液滴含有感兴趣的样品。在一些实施方案中，可以从含有样品、引物、探针、试剂、缓冲液或PCR所必须的任何其它合适成分的溶液制备乳液。在一些实施方案中，可以从样品制备第一乳液。可以制备含有试剂、探针、引物、缓冲液或用于PCR的任何其它合适成分例如5’核酸酶或TaqMan的第二乳液。在这样的实施方案中，来自样品乳液的液滴和来自试剂乳液的液滴可以在扩增之前聚结到某个点，采用任何合适的能量形式包括热、光、电流、化学性质、电荷或用于聚结液滴的任何其它合适的形式。在一些实施方案中，可以采用摇动、搅拌、搅动、超声处理或用于形成乳液的任何其它合适方法来形成乳液液滴。在一些实施方案中，可将含有样品512的未扩增的乳液液滴上样至含有至少一个孔504的基板502上。图5A是基板的俯视图，显示上样至孔504内的样品512，其中所述样品512已被向下稀释至含有单拷贝的靶核酸。在这样的实施方案中，某些孔可能含有至少一个模板的靶核酸，并且某些孔可能含有零模板的靶核酸。在一些实施方案中，孔的表面可以用表面涂层处理，例如亲水性表面涂层、DNA结合试剂或用于保持DNA分子的任何其它合适的处理。一旦所述样品已被上样至基板上，不混溶的流体层或密封层510(如图5B中所示)可以置于孔上以分隔单个的反应体积，并也可以作为覆盖物起作用。图5B显示了从侧面看到的装置500。在一些实施方案中，如图5B中所示，密封层510也可以填充没有充满样品的空孔504。一旦所述样品已被上样至基板502上，然后所述样品可以经受PCR扩增所必须的条件。含有经扩增的样品的孔，或阳性样品孔516，然后可以与没有靶DNA的孔或阴性样品孔518区分开。此外，非样品孔520可以与阳性样品孔516和阴性样品孔518区分开，因为非样品孔520会因为密封层而具有不同的电性质
在一些实施方案中，所述装置可用于采用珠的乳液dPCR，如图6A和6B所示。在这样的实施方案中，可以制备乳液，其中乳液液滴含有至少一个模板的感兴趣的样品和必要的PCR混合物和/或试剂、探针、引物和珠607，其中所述珠607可以包括用于结合DNA的引物位点或任何感兴趣的靶核酸。在一些实施方案中，可以采用摇动、搅拌、搅动、超声处理或用于形成乳液的任何其它合适方法来形成乳液液滴。有DNA存在的任何珠607将有从所述珠或模板阳性珠622延伸的DNA。在一些实施方案中，可以完成模板阳性珠的富集。含有样品612和珠607的经扩增的乳液液滴，然后可以上样至含有至少一个孔604的基板602上，如图6A中所示。在一些实施方案中，所述孔的表面可以用表面涂层处理，例如亲水性表面涂层、DNA结合试剂或用于保持DNA分子的任何其它合适的处理。在一些实施方案中，一旦所述样品已被上样至基板上，不混溶的流体层或密封层可以置于孔上以分隔单个的反应体积，并也可以作为覆盖物起作用。图6B显示了从侧面看到的装置600。一旦样品和/或珠已被上样至孔604中，然后样品可以经受PCR扩增所必须的条件。在一些实施方案中，新引物和/或探针可以用于查询(interrogate)感兴趣的分析。与空孔628相反，带有对应于感兴趣的分析序列的含有珠的孔或阳性孔624会给出信号，否则该孔会是阴性孔628。
在一些实施方案中，可以用必要的试剂、引物、探针和带有引物位点的珠制备乳液。然后可以对乳液进行PCR，使得有DNA存在的珠将有从所述珠延伸的DNA以形成模板阳性珠。然后可以将乳液进行破乳。然后阳性珠可以被鉴定，并且阳性珠的富集可能已完成或可能未完成。然后将所述珠可以上样至芯片上，其可以或可以不包括孔。然后，可以在芯片上进行PCR，并可以加入新引物以查询感兴趣的分析。然后带有珠、带有对应于感兴趣的分析序列的孔可能给出信号。没有对应于感兴趣的分析的珠会是阴性的。
在本发明所提供的方法的一些实施方案中，氢离子的检测可以在没有真正测序的情况下发生。非测序氢离子检测方法可以涉及产生带有两个靶特异性PCR引物的扩增子，将所述扩增子与珠结合，与靶特异性检测引物杂交，将所述珠上样至孔中，在芯片上进行珠检测以鉴定带有珠的孔，给反应混合物供应聚合酶和所有4种dNTP，并检测氢离子。在这种方法中，所述系统可以提供有多少珠具有扩增子并匹配检测引物的数量，但不必提供任何序列信息。然后氢离子峰会表明，DNA链的聚合已经发生。
在所述方法的一些实施方案中，氢离子的检测可以在靶分子部分测序的情况下发生，例如通过鉴定结合珠的扩增子的序列，但不会要求传统的1:1读出碱基。在这样的实施方案中，可以进行测序运行，采用dNTP池，其每一个缺乏四个碱基之一。这会给出能够用于阳性鉴定特定靶分子的序列模式，并且其还会针对每个测序循环给出更多氢离子以及峰高的可预测变化。
本发明还提供一种不用珠或孔进行离子检测的方法。在这样的实施方案中，单独的扩增子会结合位于围绕氢离子检测器外周的水凝胶膜的单个区域。然后可以运行反应以饱和该环，然后可以进行测序，其然后会释放氢离子以被氢离子检测器检测。
本发明提供了一种进行数字castPCR、PAP或TPAP延伸分析的方法。竞争性等位基因特异性 PCR(castPCR)是检测和定量样品中稀有突变的方法，所述样品含有大量正常的、野生型基因组DNA(gDNA)。castPCRTM技术将等位基因特异性 PCR与等位基因特异性MGB阻断剂组合，以抑制来自野生型等位基因的非特异性扩增，带来与传统等位基因特异性PCR相比更好的特异性，并且进一步在共同待审申请美国第13/350,764号(用于检测稀有细胞的方法、组合物和试剂盒)中讨论，其申请通过全文引用并入本发明。磷酸化激活的聚合(PAP)是当与靶或模板核酸杂交再接着延伸被激活的引物时，焦磷酸水解介导的引物去封闭的过程。PAP中所用的引物通常包括终止子核苷酸，如3’的双脱氧核苷酸(ddNMPs)。TPAP是指在三磷酸的存在下不可延伸的引物的聚合。通常，引物3’末端的不可延伸的核苷酸在聚合发生之前首先被去除以产生可延伸的引物。数字castPCR、PAP或TPAP延伸分析还可以用于稀有突变检测，但是可能要求每孔数千氢离子的检测灵敏度。在这样的实施方案中，包括稀有突变等位基因的剪切的gDNA(每个～100kb)的通用连接(universal attachment)可以结合珠。在采用castPCR或TPAP的等位基因特异性延伸过程中，随着稀有突变等位基因的延伸的发生，可以释放氢离子。然后，所释放的氢离子可以通过离子敏感性检测系统进行检测。
在一些实施方案中，采用由多磷酸分解作用进行活化(APP)来扩增核酸。APP可以采用以下步骤进行：(a)将核酸与具有可通过多磷酸分解作用来去除(即可活化的)的不可延伸的3’末端(“P*”)的第一寡核苷酸退火；(b)去除该3’不可延伸末端，采用多磷酸分解作用试剂和具有多磷酸分解作用活性的生物催化剂(即DNA聚合酶)以产生未封闭的寡核苷酸；以及，(c)延伸所述未封闭的寡核苷酸以产生期望的核酸链。所述APP方法还可以用于扩增期望的核酸链，通过，例如，增加以下额外的步骤：(d)从模板链分离步骤(c)的期望的核酸链，以及(e)重复步骤(a)-(d)直到实现期望的核酸链的所需扩增水平。APP的步骤(a)至(c)可以在热循环仪上作为两个或多个温度阶段顺序进行，或者它们可以在热循环仪上作为一个温度阶段进行。
本发明还提供了一种采用离子敏感性检测系统进行多重数字突变检测分析的方法。在这样的实施方案中，等位基因特异性引物可以附着到珠。每个珠可以能够分析100-500个突变。多重乳液TPAP PCR然后可以在每个珠存在0-1个分子的情况下进行。然后，使所述珠和结合等位基因经受扩增条件。然后，可以计数突变的存在与不存在，并且然后可以确定这些100-500个稀有突变的频率。TPAP和APP的其它实例可以发现于共同待审美国申请第13/324,676号(采用由多磷酸分解作用来活化(APP)的反应进行核酸聚合)，其申请通过全文引用并入本发明。
或者，等位基因特异性引物的混合物可以附着到珠。在一些实施方案中，可以附着至少2个等位基因特异性引物，可以附着至少3个，至少50个，至少100个，至少500个，至少1000个等位基因特异性引物。然后，所述珠可以与样品和PCR试剂混合
本发明还提供了一种在单个步骤或单个扩增反应中采用预扩增分区和双阶段乳液PCR进行多重数字PCR的方法。在单个步骤中进行分区和扩增，消除了随机噪音或误差和偏差，其可以干扰精确定量。在一些实施方案中，样品的分区，或模板分子或核酸的分区在样品的任何处理发生之前发生。处理可以包括例如加尾、靶向、扩增、珠上样或任何其它合适的处理。
在本发明所提供的单独扩增的方法的一些实施方案中，所述方法可以包括用多重靶向寡核苷酸(oligos)将样品分区，所述寡核苷酸每个含有序列特异性3’末端和通用5’末端，并且其中所述靶向寡核苷酸以足够浓度存在，以确保反应体积中的几轮任何靶的扩增可以发生以产生靶的加尾的扩增子。此外，可将通用寡核苷酸加至反应体积，其中所述通用寡核苷酸与存在于所有靶向寡核苷酸上的尾巴相同，并且其中所述通用寡核苷酸以足够浓度存在，以在第一轮之外继续进行任何加尾的扩增子的扩增。此外，珠如测序珠，可能存在于或不存在于反应体积中。在一些实施方案中，所述反应体积可以是单分散的液滴、多分散的液滴和/或乳液。在一些实施方案中，在乳液中进行一步法RT-PCR是可能的，并可以允许对RNA的数字分析。
实施例
采用预扩增分区和双阶段乳液PCR进行多重数字PCR
材料：将每个用同样的通用序列加尾的靶特异性寡核苷酸的多重池以低浓度与样品和PCR MasterMix组合。例如：带有期望量的靶的等位基因特异性正向引物、带有期望量的靶的等位基因特异性反向引物、通用正向引物或尾巴、通用反向引物或尾巴，可以与所述样品和PCR MasterMix组合。此外，可添加用通用正向引物/尾巴预上样的珠，以及更高浓度的匹配通用正向引物或尾巴和匹配通用反向引物或尾巴。通用反向引物或尾巴的量可以是比通用正向引物或尾巴稍微更高的浓度，以驱动珠上样。
方法：一旦多重池、样品和PCR MasterMix已经组合，然后将反应混合物通过乳化分成数千或数百万的液滴。因此，每个液滴会含有足够的靶向引物以启动每个靶的扩增。然后，可以通过任何等位基因特异性引物来匹配特定液滴中的模板以开始扩增。所有其他等位基因特异性引物是非生产性的。在第一阶段扩增之后，针对靶的等位基因特异性引物然后会被耗尽。然后，可以通过通用引物继续扩增，其在每个反应或液滴中是相同的。珠上的通用正向引物也可以被延伸而产生测序模板。
分析：液滴的定量是数字化的(扩增为阳性，或扩增为阴性)。
虽然本发明已经显示和描述了本发明的优选实施方案，对于本领域技术人员来说很明显的是，这样的实施方案仅以实例的方式提供。本领域技术人员可以在不偏离本发明的情况下产生许多变化、改变和替换。应当理解的是，本发明所述实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此将这些方法和结构及其等效物涵盖于这些权利要求范围内。